이 간행물에 보고된 연구는 NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250(C.S.S.), NIH Grant F31EY035156(AH) 및 P30 EY011373의 지원을 받았습니다. 자금 지원 기관은 이 연구의 설계나 수행에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

이 연구에서 동물 피험자의 사용은 Case Western Reserve University의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1. 시약 준비
<ol><li>칼슘, 마그네슘, 페놀 레드가 없는 Hank's Balanced Sal 용액(HBSS)에 10mM HEPES 완충 용액을 보충하여 세척 완충 매체를 준비합니다. 사용할 때까지 용액을 4°C에서 유지하십시오.</li>
	<li>Dulbecco's Modified Eagle's Medium에 4.5g/L 포도당, 1.25x GlutaMAX 보충제(스톡 농도 100x 또는 200mM, 최종 농도 2.5mM L-글루타민), 소 태아 혈청 10%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, MEM 비필수 아미노산 용액 1개(100x)를 보충하여 RPE 배지를 준비합니다. 사용하기 전에 수조에서 미디어를 37°C로 사전 예열하십시오.</li>
</ol>2. 쥐 눈 추출
<ol><li>가급적이면 생후 3주에서 14주 사이의 마우스를 IACUC가 승인한 안락사 방법(이 연구에서는 마우스 20g당 0.1mL의 케타민/자일라진 칵테일[87.5mg/kg 케타민 및 12.5mg/kg 자일라진]을 사용한 마취 하에 자궁경부 탈구)을 사용하여 안락사시킵니다. 참고: 어린 쥐에서 채취한 눈은 시간이 지남에 따라 망막 색소 상피 세포 수율을 증가시키고 연속적인 통과 능력을 확장합니다.</li>
	<li>눈을 위로 향하게 하여 마우스를 옆으로 평평하게 눕힙니다.</li>
	<li>검지와 엄지를 각각 눈 위와 아래에 놓습니다. 눈을 둘러싼 뼈 구조에 부드럽게 압력을 가하여 안구의 돌출을 유도합니다.</li>
	<li>약간 열린 가위의 끝을 눈 아래에 삽입하고 눈이 소켓에서 분리될 때까지 손목을 눈에서 90° 부드럽게 회전시킵니다. 알림: 눈이나 시신경을 절단하기 위해 가위를 닫지 마십시오., 아이컵의 해부를 더 어렵게 만들 수 있습니다.</li>
	<li>즉시 눈을 70% 에탄올에 넣고 5초 이상 굴린 후 얼음 위에 보관된 세척 완충 매체로 옮깁니다.</li>
	<li>해부 현미경으로 한 번에 한쪽 눈을 세척 완충액과 적신 거즈 조각으로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>핀셋으로 시신경을 잡아 눈을 안정시킵니다. 3.00mm 45° 수술용 칼 또는 0.009인치 면도날을 사용하여 오라 세라타 높이를 부드럽게 절개합니다.</li>
	<li>Vannas 가위를 사용하여 절개 부위에 가위를 부드럽게 삽입하고 전방분절과 유리체를 제거하고 버릴 수 있을 때까지 ora serrata 둘레를 자릅니다.</li>
	<li>RPE 층을 방해하지 않도록 주의하면서 끈으로 묶인 집게를 사용하여 아이컵에서 망막을 부드럽게 벗겨냅니다. 참고: 망막을 더 쉽게 제거하려면 전사 피펫에 세척 버퍼 매체를 채우고 아이컵 가장자리에 조심스럽게 적용하여 망막을 부드럽게 들어 올립니다.</li>
	<li>마지막으로 가위를 사용하여 아이컵에서 시신경과 과도한 결합 조직을 제거합니다. 아이컵에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하십시오.</li>
</ol>3. 기본 RPE 격리
<ol><li>1mL의 0.25% 트립신 + 0.02% EDTA가 포함된 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 아이컵을 옮깁니다. 참고: 배양 가능한 RPE의 수율을 높이기 위해 Trypsin-EDTA의 부분 표본 1개에 두 개의 아이컵을 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>마이크로 원심분리기 튜브를 37°C로 설정된 수조로 옮기고 10분 동안 배양합니다. 2분마다 수조에서 튜브를 제거하고 튜브 바닥을 조리대에 40번 단단히 두드립니다.</li>
	<li>10분 후 P1000 또는 2mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 3회 이상 피펫팅하여 아이컵을 기계적으로 부드럽게 파괴합니다. 알림: 큰 시트는 제대로 접착되지 않으므로 RPE 시트의 단편화가 필수적입니다.</li>
	<li>아이컵이 아닌 분리된 RPE 시트를 15mL 원뿔형 튜브에 담긴 0.5mL의 소 태아 혈청(FBS)에 겹쳐 트립신을 즉시 중화시킵니다.</li>
	<li>또한 3mL의 RPE 배지를 FBS 및 RPE 시트 층에 적하하여 트립신을 희석합니다.</li>
	<li>RPE를 340 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 24웰 플레이트(1.9cm2/웰) 또는 48웰 플레이트(0.75cm2/웰)에 적합한 양의 RPE 매체에 세포를 재현탁시킵니다. 참고: RPE는 세포외 기질 단백질, 특히 라미닌, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴으로 코팅된 웰 플레이트에 도금하여 부착력을 높일 수 있습니다11. 또한 RPE는 1mL의 RPE 배지에 재현탁하고 40% 밀도 분리 그래디언트에 적층하여 순수 RPE 세포를 추가로 분리할 수 있습니다. 또한, 플레이트를 340 x g 에서 3-5분 동안 회전시키면 세포 접착력이 증가할 수 있다13.</li>
	<li>37 ° C에서 5 % CO2 로 배양합니다.</li>
</ol>4. RPE 배양
<ol><li>최소 3일 동안 격리된 RPE를 중단하지 마십시오. 72시간 후 기존 매체를 조심스럽게 제거하고 미리 데워진 새 매체로 교체합니다.</li>
	<li>처음 48일 후 3시간마다 매체를 교체하십시오.</li>
	<li>세포가 밀도에 도달하면 0.25% 트립신 + 0.02% EDTA를 사용하여 세포를 통과시키고 RPE 배지의 FBS를 2%로 줄입니다. 참고: 일차 RPE는 이전에 5-7회 통과 후에 역분화를 시작하고 육각형 모양과 색소 침착을 잃기 시작하는 것으로 보고되었다14.</li>
</ol>

배양된 1차 쥐 RPE의 특성화 및 형태학적 역학

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).</li><li>Lambros, M. L., Plafker, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+the+Nrf2+anti-oxidant+transcription+factor+in+age-related+macular+degeneration.">Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration.</a> Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).</li><li>Ferrari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+genes+and+disease+mechanisms.">Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li><li>Xia, T., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+diabetic+retinopathy+on+the+barrier+functions+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium.</a> Vision Res. 139, 72-81 (2017).</li><li>Edwards, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+rat+retinal+pigment+epithelium.">Culture of rat retinal pigment epithelium.</a> In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).</li><li>Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+rat+retinal+pigment+epithelial+cells.">An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).</li><li>Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+pigment+epithelial+cells+from+rat+retina.">An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina.</a> Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).</li><li>Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).</li><li>Sakagami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+rat+eyeballs.">A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs.</a> Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).</li><li>Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+isolation+and+culture+of+adult+rat+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+cells+to+study+retinal+diseases.">A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 9, 449 (2015).</li><li>Shen, J., He, J., Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+cells+with+Rho-Kinase+and+TGFbetaR-1/ALK5+inhibitor.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor.</a> Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).</li><li>Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+cryosectioning+of+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+on+transwell+cell+culture+inserts.">Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101758 (2022).</li><li>Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Junctions+of+the+outer+blood+retina+barrier.">Tight Junctions of the outer blood retina barrier.</a> Int J Mol Sci. 21 (1), 211 (2019).</li><li>Ban, B., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions.">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Mol Vis. 3, 18 (1997).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+diseases+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Functions and diseases of the retinal pigment epithelium.</a> Front Pharmacol. 12, 727870 (2021).</li></ol>

관련 재무 또는 비재무 공개가 없습니다.

이 기사에서는 쥐 망막 색소 상피의 분리 및 배양을 위한 간소화된 프로토콜을 간략하게 설명했습니다. 성체 마우스의 눈에서 분리한 RPE 세포는 RPE 특이적 마커인 RPE65와 세포간 접합 마커인 ZO-1을 발현했습니다. 또한, 배양된 세포는 배양에서 착색된 육각형 시트로 발달했습니다.
설치류에서 RPE를 분리하는 여러 가지방법이 이전에 6,7,8,9,10,11,12로 발표되었?...

망막 색소 상피(RPE)는 광수용체와 맥락막1 사이에 위치한 브루흐 막(Bruch's membrane)을 둘러싸고 있는 특수 세포 단층입니다. RPE 세포는 망막의 적절한 기능에 중요한 역할을 합니다. RPE 세포는 포도당과 비타민 A를 광수용체로 운반하고, all-trans retinal을 11-cis retinal로 재이성질화하여 시력을 촉진하고, 벗겨진 외부 분절의 phagocytosis를 통해 광수용체의 외부 분절을 유지하고, 망막하 공간에서 수분을 제거하고, 긴밀한 접합부의 존재를 통해 외부 혈액-망막 장벽을 형성하고, 신경 영양 성장 인자(예: Pigment Epithelium Derived Factor, 및 Basic Fibroblast Growth Factor)를 지원하여 광수용체를 지원한다2. RPE 세포의 기능 장애는 연령 관련 황반 변성, 색소 망막염 및 당뇨병성 망막증을 포함한 다양한 망막병증의 발병에 관여합니다 3,4,5. RPE 세포를 사용한 체외 연구는 이러한 질병의 발병 기전에 대한 이해를 높이는 데 매우 중요합니다. RPE 세포주는 쉽게 구할 수 있지만 1차 RPE 세포의 주요 특성이 부족하기 때문에 이러한 연구에서 훨씬 선호됩니다.
다양한 종이 일차 RPE 세포의 공급원으로 활용되어 왔지만, 마우스는 유전자 변형을 사용하여 망막병증의 발병 기전을 이해하는 데 도움이 되는 장점이 있습니다. 설치류로부터 RPE 세포를 분리하기 위한 이전에 설명된 프로토콜은 신생아 동물의 사용을 필요로 하거나, 시간이 오래 걸리거나, 기술적 기술을 요구하거나, 배양에 적합하지 않다 6,7,8,9,10,11,12. 당사는 RPE 세포를 고순도 배양액을 생성하는 성체 마우스에서 RPE 세포를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.009 RD Single-Edge Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>941202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>no Calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Unitome Knife</td>
			<td>BVI Beaver</td>
			<td>377546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Microplates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td>24-well or 48-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult mice

망막 색소 상피 세포(RPE)는 망막의 적절한 기능에 매우 중요합니다. RPE 기능 장애는 연령 관련 황반 변성, 색소 망막염 및 당뇨병성 망막병증과 같은 중요한 망막 질환의 발병 기전에 관여합니다. 쥐 성인 눈에서 RPE를 분리하기 위한 간소화된 접근 방식을 제시합니다. 이전에 보고된 방법과 달리, 이 접근법은 성체 마우스에서 고순도 RPE의 분리 및 배양을 가능하게 합니다. 이 간단하고 빠른 방법은 광범위한 기술이 필요하지 않으며 기본적인 과학 도구와 시약으로 달성할 수 있습니다. 1차 RPE는 3주에서 14주까지의 C57BL/6 배경 마우스에서 안구 적출 후 전방 분절 제거에 의해 분리됩니다. 효소 트립신화 및 원심분리는 아이컵에서 RPE를 해리하고 분리하는 데 사용됩니다. 결론적으로, 이 접근법은 망막 기능 및 질병 연구에서 RPE를 활용하기 위한 빠르고 효과적인 프로토콜을 제공합니다.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized cell monolayer lining the Bruch&#39;s membrane located between photoreceptors and the choroid1. RPE cells play a critical role in the proper function of the retina. RPE cells transport glucose and vitamin A to photoreceptors, promote vision by re-isomerization of all-trans retinal into 11-cis retinal and maintain outer segments of photoreceptor through phagocytosis of shed outer segments, remove water from the subretinal space, form the outer blood-retinal barrier through the presence of tight junctions and secrete neurotropic growth factors (such as Pigment Epithelium Derived Factor, and Basic Fibroblast Growth Factor) that support photoreceptors2. Dysfunction of RPE cells is involved in the pathogenesis of various retinopathies, including age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy3,4,5. In vitro studies using RPE cells are critical to improving our understanding of the pathogenesis of these diseases. Primary RPE cells are much preferred for these studies since RPE cell lines, while readily available, lack key characteristics of primary RPE cells.
Whereas various species have been utilized as sources of primary RPE cells, mice have the advantage of using genetic modifications to help understand the pathogenesis of retinopathies. Previously described protocols to isolate RPE cells from rodents either require the use of neonatal animals, are lengthy, require technical skill, or are not suitable for culture6,7,8,9,10,11,12. We describe a simple and fast method to isolate RPE cells from adult mice that yield highly pure cultures of these cells.

저자 스포트라이트: 망막병증 연구를 위한 성인 마우스의 원발성 망막 색소 상피 세포의 효율적인 분리

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

Retinal pigment epithelial cells or RPE are located between photoreceptors and the choroid. Dysfunction of RPE is important in the pathogenesis of diseases, such as age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, and retinitis pigmentosa. The use of primary RPE is key to studies to improve the understanding of how disease is developed.While various species have been used as a source of primary RPE, mice have the advantage of allowing to use genetic manipulation to help understand how retinopathies develop. Prior methods of isolation of primary RPE from rodents require either the use of neonatal animals, are lengthy, require technical expertise, or are not suitable for cell culture. We describe a simple and fast method to isolate primary RPE from adult mice that yields highly pure cultures of the cells.

설명된 프로토콜은 C57BL/6 배경 마우스에 사용되었습니다. 성별은 RPE를 배양하는 능력을 변화시키지 않는 것으로 보인다. 6주 미만의 마우스는 나이가 많은 마우스에 비해 제한된 RPE 시트를 생성하며 최적의 밀도에 도달하기 위해 더 많은 눈이 필요할 수 있습니다. 분리 후 RPE 세포가 안정화되어 세포 배양 플레이트에 부착되는 데 약 3일이 걸립니다. 분리 후 약 24시간이 지나면 무핵세포처럼 보이?...

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

a-simplified-method-for-isolation-culture-retinal-pigment-epithelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

642 조회수.  Case Western Reserve University. 망막 색소 상피 세포 또는 RPE는 광수용체와 맥락막 사이에 위치합니다. RPE의 기능 장애는 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 및 색소 망막염과 같은 질병의 발병에 중요합니다. 1차 RPE의 사용은 질병이 어떻게 진행되는지에 대한 이해를 높이기 위한 연구의 핵심입니다.다양한 종이 원발성 RPE의 원인으로 사용되어 왔지만, 마우스는 유전자...

비디오: 저자 스포트라이트: 망막병증 연구를 위한 성인 마우스의 원발성 망막 색소 상피 세포의 효율적인 분리

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

연구

신경과학

Extraction and Cultivation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice Eyes

To begin, prepare the wash buffer by supplementing Hank's Balanced Salt Solution with 10 millimolar heaps buffer. Store the buffer at four degrees Celsius until use. Prepare retinal pigment epithelium or RPE medium in DMEM and prewarm to 37 degrees Celsius in a water bath.Lay the euthanized mouse flat on its side with the eye facing upwards. Place the index finger above the eye and the thumb below it. Apply gentle pressure on the bone structure around the eye to cause the eyeball to protrude.Insert the tip of slightly open scissors under the eye and gently rotate the wrist away from the eye 90 degrees until the eye detaches from the socket. Immediately place and roll the eye in 70%ethanol for five seconds. Then transfer the eye to a wash buffer kept on ice.Under a dissecting microscope, place the eye in a Petri dish filled with wash buffer and strips of soaked gauze. Stabilize the eye by holding the optic nerve with tweezers and using a surgical knife gently make an incision at the level of the Ora Serrata. Insert Vannas Scissors into the incision and cut around the circumference of the Ora Serrata until the anterior segment and vitreous are removed.Gently peel away the retina from the eye cup using tethered forceps without disturbing the RPE layer. With the help of scissors, remove the optic nerve and excess connective tissue from the eye cup without puncturing the eye cup. Transfer the eye cup to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube containing one milliliter of 0.25%trypsin and 0.02%EDTA.incubate the eye cup in a 37 degrees Celsius water bath for 10 minutes. Every two minutes, remove the tube and firmly tap the bottom 40 times onto the countertop. After incubation, using AP-1000 pipette gently mix up and down three times to disrupt the eye cup.To neutralize the trypsin, immediately layer the detached RPE sheets, excluding the eye cup onto 0.5 milliliters of FBS in a 15 milliliter conical tube. Then dropwise, add RPE media onto the layers of FBS and RPE sheets to dilute the trypsin. Centrifuge the RPE at 340G for three minutes.Discard the supernatant and resuspend the cells in a suitable amount of RPE media for a 24 well plate. Incubate the RPE at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for three days. 24 hours after RPE isolation, a nucleate pigmented cells begin to settle without full adherence.Over the 48 to 72 hours, these cells attach and spread, retaining dark pigmentation in a transparent nucleus. After five days, RPE cells show increased co fluency in start forming cell to cell contacts shaping into a polarized monolayer with hexagonal structures. Isolated RPE showed purity as evidenced by the RPE specific marker and tight junction integrity after six days in culture.