마우스 망막 해부는 눈의 크기와 모양과 망막 섹션의 취약성으로 인해 정말 섬세한 과정입니다. 효율적인 방법과 팁을 제공하는 상세한 프로토콜을 갖는 것이 고품질 망막 해부 및 섹션의 핵심입니다. 우리는 연구원이 일반적인 함정을 피하고 면역 조직화학에 적합한 몇몇 고품질 망막 단면도를 얻는 것을 돕기 위하여 팁 과 조언을 제공합니다.
각막을 매우 가볍게 만지고 약간 각막을 태우고 구멍을 만드는 것을 피하기 위해 분할 초 이하의 경우, 꼬리 소작을 사용하여 안락사 마우스의 눈의 시간 적 부분을 표시합니다. 그 직후 마우스 눈을 방출하기 위해 곡선 듀몬트 545 집게를 사용했다. 1.5 밀리리터 냉동고튜브에 4%의 PFA와 PBS1밀리리터를 배치하고 얼음 위에 15분 동안 배양합니다.
그런 다음, PBS로 채워진 변형된 35mm 해부 접시에 구부러진 Dumont 545 집게를 사용하여 고정된 눈을 전송하고 해부 현미경의 밑에 놓습니다. 마이크로나이프를 사용하여 각막의 림푸스 경계 바로 위에 수직으로 화상 마크에 작은 절개를 합니다. 절개에 곡선 가위를 삽입하고 림푸스 다음 각막의 할례 컷을 수행합니다.
그런 다음 얇은 Dumont 5 포셉을 사용하여 각막을 제거하고 렌즈를 추출한 다음 눈의 후방 부분에서 섬세하게 들어 올립니다. 유리체 몸은 렌즈와 함께 나올 것이고 망막은 후방 눈컵의 내부를 덮고 있는 흰색 표면으로 볼 수 있습니다. 실온에서 10 분 동안 PBS의 1 밀리리터에 고립 된 눈 컵을 두 번 씻으시다.
눈컵을 보호하려면 15%의 자당과 PBS를 4도에서 섭씨 4도에서 상량화하여 가라앉을 때까지 평형화합니다. 그런 다음 안구컵을 30% 자당과 PBS로 2~3시간 동안 옮겨 가라 앉을 때까지 옮겨넣습니다. 10월에 아이컵을 10mm에서 10mm 의 냉동 금형으로 배치합니다.
해부 현미경하에서, 화상 자국이 위에 올 때까지 눈을 회전하여 등쪽 복부 축을 따라 냉동 금형의 눈을 방향을 지정합니다. 시신경은 왼쪽이고 금형의 잘라낸 부분은 오른쪽에 있습니다. 망막 조직을 고정하려면, isopentane을 포함하는 금속 비커에 적어도 5 분 동안 냉동 금형을 침지 한 다음 비커의 높이의 1/3까지 액체 질소에 비커를 놓습니다.
냉동 블록을 제거하고 알루미늄 호일에 싸서 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 펜 이나 Sharpie를 사용 하 여 고정 된 블록을 표시 하 여 방향을 기록 합니다. 영하 20도에서 영하 25도 사이의 저온을 조정한 후, 내장된 눈컵이 들어 있는 금형을 내부에 놓고 1시간 동안 저온 온도에 평형할 수 있도록 합니다.
등대 복부 배향으로 극저온에 블록을 설치하고 10 마이크로미터 두께의 직렬 섹션을 절단하십시오. 주석이 주석이 추가된 현미경 슬라이드에 망막 섹션을 조심스럽게 배치한 다음 면역 염색을 준비할 때까지 섭씨 영하 20도 또는 영하 80도의 슬라이드 박스에 보관하십시오. rhodopsin, 광수용체 마커, 글루타믹 산 데카르복실라제 65, 및 아맥린 세포 마커, 글루타민 신디사이저와 뮬러 세포 마커, 및 칼빈딘, 수평 세포 마커를 가진 면역 조직 화학은 망막 섹션에서 수행되었다.
결과는 이 프로토콜이 다른 프로토콜에서 얻은 열악한 품질 망막 섹션과 달리 고품질의 잘 보존된 망막 섹션을 산출한다는 것을 나타냅니다. Rhodopsin 풍부한 내부 및 외부 세그먼트는 망막 색소 상피를 오버레이에서 거의 또는 전혀 분리와 수직 및 그대로 남아있다. Gad65 양성 막시 세포와 같은 인터뉴런은 내부 핵 층 및 내부 플렉시폼 층 내에서 적절하게 계층화되어 있습니다.
또한, 뮬러 세포는 신경절 세포 층에서 외부 핵 층까지 에 걸쳐 세포질 공정에 제대로 정렬 된 소마로 잘 보존 되어 있습니다. 더욱이, 잘 정의된 수평 세포는 내부 핵층 및 외부 플렉시폼 층 테두리에서 검출할 수 있다. 눈의 토퍼 영역을 표시하고 포함하는 동안 방향을 유지하는 것이 중요합니다.
항상 적절한 개인 보호 장비와 후드 아래 파라 포름 알데히드를 준비합니다.
