눈 형태 발생에 대한 우리의 이해는 이전 고정 조직 연구에서 비롯됩니다. 그러나, 이러한 연구는 세포와 조직 역학 부족. 시간 경과 이미징을 사용하여 시각화 및 분석을 위해 이 전체 프로세스를 캡처할 수 있습니다.
라이브 이미징을 용이하게 하는 제브라피시 배아의 광학 선명도의 외부 개발을 활용하고 대부분의 연구 캠퍼스에서 쉽게 구할 수 있는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사를 사용하는 당사의 방법. 이 방법을 새로 사용하는 연구원은 사용 가능한 데이터 집합을 얻기 전에 몇 가지 시행 착오를 예상해야 합니다. 많은 단계, 특히 주사와 포함, 성공을 위해 잘 가야한다, 그래서 인내심을 가지고.
얼룩말물고기가 번식하기 시작하면, 계란이 수정될 수 있도록 15~20분을 기다리는 동안 P10 파이펫과 P10 마이크로리터 팁을 사용하여 RNA 희석의 2.5~5 마이크로리터를 가진 당겨진 유리 모세관 마이크로 주입 바늘을 다시 로드합니다. 계란이 준비되면, 이송 파이펫과 해부 현미경을 사용하여 계란을 사출 몰드에 조심스럽게 로드하고, 집게를 사용하여 배아를 굴려 단일 세포가 필요에 따라 볼 수 있도록 하십시오. 그런 다음 1 세포 단계에서 모든 배아를 주입하여 노른자가 아닌 세포를 표적으로 하여 개발 중인 배아의 균일한 라벨링을 보장합니다.
약 11시간 후 수정시, E3 배지에서 1~5밀리리터 알리쿼트의 1.6% 낮은 용융 아가로즈를 42도의 열 블록에 넣고 형광 현미경을 사용하여 전체적인 식물성 밝기를 가진 성공적으로 주입된 배아를 검사합니다. 소미를 세어 배아를 올바르게 무대에 올수 있습니다. 수정 후 11시간에서 3개의 소미트를 관찰해야 합니다.
이상적인 샘플은 강력한 EGFP 및 mCherry 신호를 가지고 있으며 올바른 개발 단계에 있을 것입니다. 장착하기 전에 배아를 한천 코팅 접시에 놓고 집게를 사용하여 각 배아에서 초리온을 제거합니다. 모든 배아가 비약되었을 때 유리 롤러 파이펫을 사용하여 하나의 배아를 흡입하십시오.
배아가 유리 파스퇴 피펫의 끝에 앉아 열 블록에서 아가로즈의 튜브에 배아를 떨어 뜨리기 위해 가능한 한 많은 E3를 배출합니다. 배아가 배아와 함께 소량의 아가로즈를 심기 전에 몇 초 동안 아가로즈안으로 가라앉게 하고, 배아가 파이펫 끝에 남아 있다는 것을 주의하십시오. 배아와 아가로즈를 유리 바닥 접시에 있는 아가로즈 액적으로 배출하고 재빨리 하지만 조심스럽게 집게를 사용하여 아가로즈 액적경화전에 배아 등쪽을 방향을 지정합니다.
동일한 방식으로 10-12개의 배아를 장착한 후, 단일 아가로즈 디스크에 모든 액적을 감싸는 접시의 바닥을 완전히 덮을 수 있는 충분한 아가로즈를 추가합니다. 아가로즈가 경화되면, 아가로즈 위에 E3층을 층으로 레이어하여 샘플을 수화시켰다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 시간 경과 이미징에 적합한 매개 변수로 설정한 후, 유리 바닥 접시의 밑면을 물의 굴절률과 일치시키는 침수 매체로 자유롭게 코팅하고, 기포를 피하기 위해 주의를 기울이고, 40X 물 목표에 작은 침지 배지를 적용한다.
단계 삽입에서 유리 바닥 접시를 고정하고 배아를 밤새 촉촉하게 유지하기 위해 추가 E3 배지를 추가합니다. 모델링 점토를 사용하여 접시 위에 플라스틱 뚜껑을 밀봉하고 요리와 접촉하는 목표를 높입니다. 현미경 소프트웨어의 위치 아래, 클릭 추가를 클릭하여 첫 번째 샘플의 XYZ 정보를 저장하여 시간 경과를 하고 강한 형광과 최적의 장착을 갖춘 샘플을 선택합니다.
찾기 탭에서 다음 샘플을 검색하고 위치를 클릭하고 추가하여 설명된 대로 샘플을 선택합니다. 모든 샘플을 선택한 경우 첫 번째 위치를 강조 표시하고 이동을 클릭합니다. 지속적으로 스캔하는 동안, 프레임 내에서 광학 소포를 정렬, 광학 소포와 뇌에 비해 전방 및 탈구 영역에 충분한 공간을 떠나.
첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스를 할당하려면 먼저 세트를 선택하고 미세 포커스 노브로 Z 방향을 통과하는 동안 마지막으로 설정하여 광학 컵의 성장을 수용하기 위해 총 63의 슬라이스 수를 유지합니다. 성장을 위한 공간을 확보할 수 있도록 광학 소포의 복부 쪽에 여분의 공간을 포함시키실 수 있습니다. 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스가 설정되면 C를 클릭하여 Z 스택의 중심으로 이동하고 레이저 전원을 조정하고 두 레이저 모두에 대한 게인을 조정합니다.
레이저 전원과 게인이 설정된 경우 스캐닝을 중지하고 업데이트를 클릭하여 위치 정보를 업데이트합니다. 다음 위치로 이동하려면 두 위치를 클릭합니다. 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스가 모두 설명된 대로 정의되면 타임 시리즈 제목을 열고 사이클 수를 300으로 설정하고 시간 간격을 2.5분으로 설정합니다.
모든 것이 완료되었는지 확인하기 위해 설정을 검토한 후 시작하여 시간 경과를 시작하고 첫 번째 이미징 라운드가 올바르게 캡처되었는지 확인한 후 시간 경과가 하룻밤 사이에 실행되도록 합니다. 단일 셀내 직접 주입은 균일한 라벨링과 견고한 형광에 필요합니다. 아가로즈에 침지되면 배아는 접시 전체에 고르게 간격을 두어야 합니다.
배아가 올바르게 준비되고, 충분히 형광되고 적절하게 장착되면, 그들은 시간 경과 중에 이미징 프레임에 남아 전체 장기를 이미지화 할 수 있게합니다. 수평 또는 대각선과 같은 등쪽 축을 따라 지향되지 않는 샘플은 시간 경과가 진행됨에 따라 이미징 프레임에서 자라며 추가 분석에 사용할 수 없습니다. 과도하게 회전하는 배아는 더 후방 시간 경과를 초래할 것입니다.
회전이 저조한 배아는 대부분의 전방 조직만 관찰할 수 있습니다. 또한 프레임 의 방향에 대해 장착된 샘플은 성공적인 시간 경과를 얻을 가능성이 높습니다. 복부 측을 향한 이러한 편견은 복부 방향의 조직 성장을 위한 여분의 공간을 제공하여 최적의 시간 경과를 초래합니다.
이러한 기준이 충족되지 않을 때, 시간 경과는 더 이상 조직의 전체 3D 부피를 포착하지 않으며 추가 분석을 위해 사용될 수 없습니다. 이러한 정보 풍부 데이터 집합은 세포 속도 및 궤적 정량화, 세포 및 조직 부피 측정 및 3 및 4D 시각화를 통한 4D 세포 추적을 포함하여 여러 가지 방법으로 분석될 수 있다.
