We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. 시험 관내 전사 <ol><li> 효소 (31)를 소화을 NotI 제한에 의해 PCS2-H2A.F / Z-EGFP 및 / 또는 PCS2-mCherry-CAAX 벡터를 선형화. 시험 관내 전사 키트에서 RNA를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 각각의 템플릿으로부터 5 &#39;mRNA의 캡 제품을 생성한다. </li><li> 정제 키트를 사용하여 캡핑 된 mRNA의 정제. 제조업체의 지침을 따르십시오. 의 RNase가없는 H 2 O로 용출 </li><li> 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도에 의해 RNA의 농도를 결정한다. (OD 260 X 희석 × 40 μg의 / ㎖). </li><li> 각각 H2A.F / Z-EGFP 및 mCherry-CAAX의 RNase없는 H 2 O에 대한 μL / 100 NG에 RNA를 희석 RNA의 농도가 너무 낮은 경우, 형광이 감소 또는 부재한다. 밝은 샘플은 광독성과 광표백을 통해 우려를 감소합니다. 한편, 너무 많은 RNA는 독성 및 / 또는 표적 효과를 일으킬 수있다. 참고 : 나머지 저장-80 ° C의 냉동고에서 정제의 mRNA. </li></ol> 2. Zebrafish의 사육, 배아의 수집 및 mRNA의 주입 36-38 <ol><li> 두 개의 영역으로 탱크를 분리 제브라 피쉬 시설에 사용되는 양식 시스템 물 각각의 사육 탱크를 채우기 위해 장벽 사육 탱크를 조립합니다. </li><li> 사육 전날 밤, 불의의 번식을 방지하기 위해 다른면에 배리어의 일측 두 개의 암컷 어류 수컷을 배치하기 위해. </li><li> 다음 날, 얼음에 이전에 제조 된 mRNA의 혼합물을 해동. 신선한 양식 시스템 물 사육 탱크에 물을 교체하고 장벽을 제거합니다. 장벽이 가져온 후 즉시, 28.5 ° C로 사출 금형을 따뜻하게하고 미세 주입을위한 장비를 설정합니다. 참고 : 사출 금형에 대한 자세한 내용은 라흐 (36)을 참조하십시오. </li><li> 차 여과기를 사용하여 15 분, E와 깨끗한 100 × 15mm 페트리 접시에 계란을 씻어 - 계란마다 10 수집3 블루 (5 mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 CaCl2를, 0.33 mM의 황산, 10 -5 % 메틸렌 블루). E3은 푸른 곰팡이 성장을 방지하고, 물고기 유충 적절한 발전을 위해 사용된다. 결합 및 배아 컬렉션에 대한 자세한 내용은 라흐 36 Porazinkski (37)을 참조하십시오. </li><li> 삽입 한 셀은 가온 사출 금형에서 배아를 단계적 배아 (도 1a)의 목적하는 양으로 난황에 RNA를 주입. 자연 배아 죽음과 실험에 필요한 것보다 15 % 더 많은 배아에서 배아 주사를 수행하여 미 수정 배아를 차지한다. 제브라 피쉬 배아의 미세 주입에 대한 자세한 내용은 라흐 36 Porazinkski (37)을 참조하십시오. 주 : mRNA를 처음으로 사용하기 위해서는 종래 5D 촬상을 수행하는 (최대 5 DPF없이 총 발달 결함으로 정의)의 형광과 생존에 대한 최적 투여 량을 결정하기 위해 용량 - 곡선 분석을 수행한다. 150-200 NG / μL수정란 내로 주입 따라서는 최종 농도를위한 좋은 출발점이 종종 최적 농도이다. </li><li> 조심스럽게 수정 된 9 &quot;유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 금형에서 주입 된 배아를 추출합니다. 피펫을 수정하려면,이 공을 형성 할 때까지 분젠 버너를 사용하여 끝을 용융. </li><li> 28.5 ° C 배양기에서 100 × 15mm 페트리 E3 블루에서 요리와 집에서 주입 된 배아를 놓습니다. </li><li> 포스트 분사 여섯 시간은 플레이트에서 죽은 또는 미 수정 배아를 제거하고 깨끗한 E3 블루를 추가합니다. 28.5 ° C에서 하우스 배아. </li></ol> 3. 준비 및 이미징에 대한 라이브 Zebrafish의 태아의 포함 (그림 1B) <ol><li> 두 시간 이미징 전에 형광 해부 현미경을 사용하여 GFP에 대한 주입 된 배아를 화면. E3 블루와 새로운 100 × 15mm 페트리 접시에 밝은 녹색 GFP 발현 배아를 놓습니다. </li><li> 아가 E3 블루 100 ml의 낮은 용융 1g을 첨가하여 1 % 저 용융 아가 로스의 스톡 용액을 끓여. 아가로 오스를 사용한 후 알루미늄 호일로 플라스크를 커버한다. 원액 한 달까지 유용 남아있다. </li><li> 분취 액을 17 X 100mm 배양 관 내로 용융 아가 3 ㎖. 사용할 준비가 될 때까지 42 ° C의 물을 욕조에 문화 튜브를 배치하여 아가 로스를 따뜻하게 유지합니다. 제브라 피쉬 배아 (36) 마취 탈 이온수에 15 mM의 Tricaine 솔루션을 준비합니다. 주 : 이전 시점의 영상을 원하는 경우, 한천의 농도가 0.3 %로 낮은 39으로 감소 될 수있다. </li><li> 15 mM의 Tricaine, 상영 배아, 낮은 용융 아가로 오스, E3 블루, 및 해부 광학 현미경에 35mm 유리 커버 슬립 바닥 배양 접시를 가져옵니다. 조심스럽게 # 5 핀셋으로 배아의 융모막을 제거합니다. 세 개의 배아에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 별도의 용기에 dechorionated 배아를 마취 할 수 놓습니다. 커버 슬립 바닥 접시의 뚜껑은 주로 이러한 목적으로 사용된다. 전송 피펫을 사용하여, 세 방울을 추가 (약 150 μL)나까지 배아 충분히 마취 된 (커버 슬립 바닥 접시의 뚜껑을 사용하는 경우) 5 ml의 E3 블루의 접시에 15 mM의 Tricaine의. 1 % 용융 아가로 오스 튜브에 15 mM의 Tricaine 솔루션 - (200 ㎕를 약 150) 또한, 3 ~ 4 방울을 추가합니다. </li><li> 차단 피펫 팁 1 cm와 P200 피펫을 사용하여; 커버 슬립 바닥 접시에 마취 배아를 전송합니다. Tricaine 솔루션 : 초과 E3 블루를 제거합니다. </li><li> 배아 실수로 서로 가까이 표류하지 않도록하기 위해 별도의 각 드롭을 유지, 배아를 통해 Tricaine 솔루션 : 낮은 용융 아가로 오스 10 ㎕의 - 천천히 다섯을 추가합니다. 경고 : 아가로 오스가 너무 따뜻 경우에는 배아를 손상시킬 수 있습니다. 42 °의 C이다에 좋은 온도는 한천을 유지합니다. </li><li> 21 G 1 ½ 바늘을 사용하여 부드럽게 원하는 위치로 오스에서 배아의 방향. 시간 경과 이미징을위한 거꾸로 현미경을 사용하는 경우, possib로 커버 슬립에 가까운 관심 (ROI)의 영역의 방향르. 주 : 일반 목적 꼬리 영역 인해 비교적 얇은 조직 (도 1a)에 배향하고 명료 용이성을 제공한다. 이러한 노른자 및 핀 폴드를 둘러싸는 상피층 등 기타 조직, 28, 29을 이용할 수있다. 이 조직은 그러나이 지역은 불과 몇 세포층 두께이며, 좋은 선명도를 제공합니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 가능한 한 많은 세포 분열을 취득 꼬리 영역은 이미지에 유익하다. </li><li> 한천의 부분 응고에 대한 몇 분을 허용합니다. 그 응고를 테스트하기 위해 한천의 작은 조각 떨어져 휴식 바늘을 사용합니다. 한천의 조각을 드롭에서 멀리 당겨 할 수있는 경우, 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 낮은 용융 한천이 포함 된 배아를 통해 돔을 형성하는 전체 커버 슬립을 커버. 한천은 공 초점 영상 (그림 1A)의 요리를 이동하기 전에 응고하도록 허용합니다. </li><li> 한천 응고 공정 (약 10 분 소요) 동안, 3 ㎖ O 준비(약 250 μL) 15 mM의 Tricaine의 다섯 방울과 F E3 블루 솔루션은 영상 중에 포함 된 배아 위에 배치합니다. </li></ol> 라이브 Zebrafish의 배아 40, 41의 4 5D 공 촛점 이미징 참고 : 다른 공 초점 시스템을 사용하여 5D 영상을 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 아리가 40 오브라이언 (41)을 참조하십시오. Z-간격, Z-스택, Z-깊이, 시간 간격 및 5D의 정의는 그림 1C를 참조하십시오. <ol><li> 이미징 소프트웨어를 열고 60X NA 1.4 대물 렌즈로 현미경을 설정합니다. 대물 렌즈에 침지 기름을 적용하고 현미경 무대에 슬라이드 홀더에 배양 접시를 놓습니다. 축 제어기를 사용하여, 대물 렌즈를 상기 관심 배아 센터와 배양 접시에 맞게 상승 대물 렌즈를 가져온다. </li><li> 눈 조각 아이콘을 클릭하고 현미경에 GFP 필터로 전환합니다. 투자 수익 (ROI)에 초점을 맞 춥니 다. O를 coverslip에 가장 가까운 조직에 초점을 것입니다최적의 촬상 결과 ffer. </li><li> 연동을 제거합니다. (소프트웨어에서 사전 설정된 파장)에 GFP 및 mCherry 채널을 선택하고 정상에 옵션을 평균 라인을 설정합니다. </li><li> 사용 &quot;보기 / 취득 컨트롤 / A1 스캔 영역&quot;은 A1 스캔 영역 도구를 엽니 명령. </li><li> 스캔을 시작합니다. 스캔 영역이 가능한 제브라만큼 충전되도록 축 제어기를 이용하여 태아의 위치. 레이저 출력은이 점에서 최적으로 할 필요가 없다. 불필요한 광표백을 피하기 위해 레이저 파워를 낮 춥니 다. </li><li> ND 취득 제어판을 열고 &quot;보기 / 취득 컨트롤 / ND 취득&quot;명령을 사용하십시오. </li><li> Z 축 스택 매개 변수를 설정 스캔을 시작합니다. 세포가 더 이상 볼 수 있습니다 위치로 Z-스택 세포에 초점이없는 경우에 상한과 하한을 설정합니다. 촬상 영역으로 확장 할 수있다 성장 및 세포 이동을 위해 샘플 위에 3 ㎛의 공간 허용한다. 이 프로에 도시 된 도면의 Z 스택로토콜은 배아의 꼬리에 40 ㎛의 Z-깊이 덮여있다. </li><li> 2 μm의에 Z-간격 스텝 크기를 설정합니다. 평균 셀 직경 10 ㎛의이며; 따라서, 2㎛는 촬상 데이터 다섯 간격은 각각의 셀에 대해 분석되도록 생성된다. 참고를 취득 할 수있는 화상의 깊이는 Z 간격에 의존한다. Z 해결 가능한 (Z-큰 깊이)와 같은 유사 분열을 겪고 많은 세포로서 이미지를 위하여 Z 차원의 전체 깊이를 얻기 위해 희생된다. Z 깊이 (Z-작은 깊이)를 희생하는 동안 그 역으로, 사실, 스텝 사이즈를 감소시킴으로써, Z 해상도가 얻어진다. </li><li> 화상 레이저 파워, HV을 조정 레벨 오프셋. 실험이 프로토콜에서 설명 들어, 다음의 레이저 파워, HV를 사용하여 GFP 채널에 각각 상응하는 레벨로 설정된 레벨을 오프셋 (5), (120) - - 2 (140), 및 -11에 -9. mCherry 채널 들어, 다음 레이저 파워, HV를 사용하고, 각 레벨을 오프셋 3-6, 120-140, 및 -3-8. 매개 변수가 설정되면, 샘플의 광독성 및 광표백 될 수 있습니다 불필요한 레이저 노출을 방지하기 위해 스캔을 종료합니다. </li><li> 2 번 라인의 평균 아이콘을 선택합니다. &quot;평균 4 배 라인은&quot;크게 스캔 시간을 증가하는 동안 &quot;아무 평균&quot;는 거친 이미지를 생성합니다. 배 선 평균의 사용은 이미지 품질과 빠른 스캔 시간 최고의 제공합니다. </li><li> 실험에 필요한 적절한 시간 간격 및 시간 지속 기간을 선택한다. 야생형 구분 내용을 2 시간 2 분의 시간 간격 (도 1,도 2,도 3a 및도 3b에서 사용) 분열 기간을 결정하기위한 최선이다. 이상 30 분 동안 스핀들 조립 검사 점을 활성화 부문도 3c에 설명 된대로 형광을 유지하기 위해 네 시간 다섯 분 간격으로 더 적합하다. </li><li> &quot;파일 저장&quot;상자를 선택하고이 획득되고 자동으로 파일을 저장할 파일 이름을 지정합니다. 모든 파 더블 체크rameters 올바르게 설정하고 &quot;실행을 시작합니다&quot;충돌한다. </li><li> 인수가 완료되면, 세 차원 형식의 파일을 볼 볼륨 임계 값 아이콘을 클릭합니다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 방법의 사용은 하나가 생체 내에서 한 번에 의존하는 방식으로 두 개의 새로운 세포를 형성하는 핵 봉투 고장, 미세 소관 - 동원체 첨부하여 중기 판의 형성 및 자매 염색 분체의 분리를 유추 할 수 있습니다. 세포가 천연 생리에 묘화되기 때문에 제브라 유사 분열 관찰하는 능력은 조직 형광 단백질을 사용하기 위해, 그들은 비교적 빠른 개발 및 저속 촬상 허용하는 투명 고정 샘플 및 세...

유사 분열은 살아있는 유기체의 성장, 분화 및 재생을위한 중요한 세포 과정에 필수적이다. 정확한 준비와 계면에서 DNA의 복제하면, 셀 분할 할 준비가 끝났다. 유사 분열, 의향의 첫 단계는 사이클린 B /는 Cdk1의 활성화에 의해 개시된다. 의향은 염색체에 염색질 물질의 응축을 특징으로한다. 핵 봉투 고장 의향 및 prometaphase 사이의 전환에서 발생한다. prometaphase에서, 중심체는 스핀들 형성을위한 핵 센터는 동원체 첨부 파일의 검색 미세 소관을 확장하면서 반대 극으로 이주하기 시작합니다. 부착시, 전환은 미세 소관의 첨부 파일 - 종료하고 장력은 중기 판 (1)을 구성하는 염색체의 방향. 모든 염색체가 올바르게 연결된 경우, 스핀들 조립 검사 점은 만족 함께 자매 염색 분체를 들고 cohesin 반지가 절단되고, 미세 소관은 동생을 끌어 단축anaphase (핵분열 말기), 3 중 반대 극에 염색 분체. 마지막 단계는 telophase, 두 개의 새로운 핵 주위의 핵 봉투의 세포와 개혁의 신장을 포함한다. 세포질 분열는 두 개의 새로운 딸 세포 4-6의 세포질을 분리하여 분할 프로세스를 완료합니다. 키 유사 분열 경로 (즉, 스핀들 조립 검사 점, 중심체 복제, 자매 염색 분체의 응집, 등.)의 변경은 중기 체포, 염색체의 missegregation 및 게놈 불안정 7-10 발생할 수 있습니다. 궁극적으로, 경로 제어 유사 분열에 결함이 발달 장애 및 암, 유사 분열의 필요로 시각화 및 라이브, 척추, 다세포 유기체 10-16에서의 결함의 원인이 될 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아 인해 투명한 조직, 미세 주입의 용이성, 빠른 발전에 라이브 영상을위한 훌륭한 모델 생물의 역할을한다. 제브라 피쉬를 사용하여,이 원고의 전반적인 목표는이다라이브 5D 분열 (17) (도 1C)의 (차원 X, Y, Z, 시간 및 파장) 이미징하는 방법을 설명한다. 다른 유사 분열 경로에 결함이있는 돌연변이 제브라 피쉬의 사용은 이러한 결함의 결과를 보여줍니다. 이 프로토콜의 경우, 오로라 B와 Esco2 돌연변이는 이러한 결함을 설명하기 위해 선택되었다. 오로라 B는 스핀들 형성 및 미세 소관의 부착에 관여하는 염색체 승객 복잡 (CPC)의 일부인 키나제이다. 또한 세포질 분열 18,19 분열 고랑 형성을 위해 필요하다. 제브라 피쉬에서 오로라 B 결핍은 밭고랑 유도, 세포질 분열과 염색체 분리 (20)의 결함으로 이어집니다. Esco2 반면에, 자매 염색 분체의 응집 21,22 필수 인 아세틸이다. 그것은 이렇게 중기-anaphase (핵분열 말기) 천이 23 적절한 염색체 분리를 보장하기 cohesin 안정화 링 SMC3 부에 cohesin을 아세틸 레이트. 제브라 피쉬의 Esco2의 손실으로 Ch 리드romosome missegregation, 조기 자매 염색 분체 분리, 게놈의 불안정성 및 p53의 종속 및 독립적 인 세포 사멸 (24, 25). 인해 가용성 auroraB의 hi1045 및 esco2의 hi2865 돌연변이 제브라 25-27이 기술을 설명하기 위해 사용될 것이다 (이하 aurB m / m 및 m 개의 esco2 / m 각각이라 함). 형광 태그 셀 기계와 커플 링 공 초점 현미경은 유사 분열 25,28,29 동안 크로 마틴과 세포막 역학을 시각화하는 연구자 수있었습니다. 형광 태그가 히스톤은 역사적으로 염색질을 시각화하는 데 사용되었다. 히스톤은 염색체 (30)를 구성하는 뉴 클레오 구조에 대한 책임이 있습니다 네 가지 쌍 (H2A, H2B, H3 및 H4)로 구성된 핵 단백질이다. H2B는 틀림없이 형광 단백질을 가장 많이 사용되는 히스톤 동안마우스와 세포 배양, 히스톤 2A의 사용, 가족 Z (H2A.F / Z)는 제브라 피쉬 (31, 32)에 사용하기 위해 잘 입증하고있다. 콘 카나 발린 A와 카제인 키나제 1-γ는 예를 들어, 세포막에 지역화 및 이전 성게 초파리 (33, 34)의 세포막을 시각화 효과적인 것으로 나타났다. 다른 연구는 CAAX 형광 표지 된 단백질이 세포막 라벨 것을 도시 제브라 31에 성공했다. CAAX는 farnesyltransferases 및 geranylgeranyltransferases로 번역 후 수정 효소에 의해 인식되는 주제이다. 이 효소에 의해 변형 단백질 따라서 세포막 (35) 라벨, 멤브레인 관련되는 원인. 때문에 제브라 피쉬에서 사용하기 전에,이 프로토콜은 염색질과 세포막에 라벨을 H2A.F / Z와 CAAX를 사용하기로 결정했습니다. 이 방법의 응용 프로그램은 각각의 염색체를 관찰하는 연구자가 개별 세포 수준에서 유사 분열을 모니터링 할 수 있습니다역학뿐만 아니라, 동시에 조직 분화 및 발달에 영향을 미칠 수있는 여러 세포 분열을 모니터링한다. 이 문서는 개별 세포 수준에서 유사 분열시 염색체 분리의 역학 이미징에 초점을 맞출 것이다. 이 논문 내에서 여러 분열 분열 관찰 분할 시간을 계산하고, 유사 분열 표현형을 해독 할 수있는 능력은 도시되고 논의 될 것이다. 이러한 매개 변수를 사용하여 생리적으로 관련된 데이터가 수집 될 수 있고, 유사 분열 결함의 영향을 여러 질환 상태에 적용 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1094">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pCS2 vectors</td>
			<td style="width:175px;">Gift from K. Kwan</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:460px;">For plasmid of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:175px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>For restriction digest of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">mMessage SP6 kit</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>For in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:175px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">74104</td>
			<td style="width:460px;">For purifying mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 x 15 mm petri dishes</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">FB0875712</td>
			<td>For housing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">microinjection mold</td>
			<td style="width:175px;">homemade</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For holding embryos during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose II</td>
			<td style="width:175px;">Amresco</td>
			<td style="width:129px;">0815-25G</td>
			<td>For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tricaine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>For anesthetizing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">S9888</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">P3911</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C8106</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">M7506</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Methylene Blue Hydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">MB1</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 mm culture tube</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-819-812</td>
			<td>For melted agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">35 mm glass coverslip bottom culture dish&#160;</td>
			<td style="width:175px;">MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-20-C&#160;</td>
			<td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">#5 tweezers</td>
			<td style="width:175px;">Dumont</td>
			<td style="width:129px;">72701-D</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">21G 1 1/2 gauge needle&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:129px;">305167</td>
			<td>For positioning embryos in agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon AZ100</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon A1+</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal software</td>
			<td style="width:175px;">NIS Elements AR 4.13.00</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

유사 분열은 유기체의 성장과 분화에 중요합니다. 이 과정은 매우 동적이며 작은 시간 프레임에 적절한 염색질 응축, 미세 소관 - 동원체 부착, 염색체 분리 및 세포질 분열을 수행하는 이벤트를 주문할 필요합니다. 섬세한 과정에서 오류가 출생 결함과 암을 포함하여 인간의 질병이 발생할 수 있습니다. 인간 유사 분열 질환 상태를 조사 전통적인 접근법들은 인간의 질병을 연구 할 때 천연 생리 유리한 개발 / 조직 특정 콘텍스트 부족한 세포 배양 시스템에 의존한다. 이 프로토콜은 고해상도, 척추 시스템에서 염색체 역학 제브라 피쉬으로 시각화하는 방법을 제공함으로써 많은 장애물을 극복한다. 이 프로토콜 세부 사항을 포함 분열하는 세포의 동적 이미지를 획득하는 데 사용할 수있는 방법 것 : 시험 관내 전사, 제브라 피쉬 번식 / 수집, 배아 삽입하고, 시간 경과 영상을. 최적화 및 modif이 프로토콜의 ications도 탐구한다. H2A.F / Z-EGFP를 사용하여 mCherry-CAAX (라벨 세포막) mRNA를 주입 배아, AB 야생형, auroraB의 hi1045 및 돌연변이 제브라 피쉬가 가시화 esco2의 hi2865의 유사 분열 (염색질 레이블). 제브라 피쉬의 고해상도 라이브 영상은 하나가 통계적으로 유사 분열의 결함 및 유사 분열 진행의 타이밍을 정량화하기 위해 여러 유사 분열을 관찰 할 수 있습니다. 또한, 잘못된 (즉, congression 결함, 염색체 missegregation 등) 유사 분열 과정 부적절한 염색체 결과 (즉, 염색체, 배수성, 소핵 등)을 정의 질적 측면 관찰 관찰된다. 상기 분석은 조직 분화 / 현상의 관찰에 적용 돌연변이 제브라 약리 제제의 사용 의무가 될 수있다. 유사 분열에 결함이 암과 발달 장애에 의지 크게 이끌어 방법의 시각화질병의 발병 기전에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.

그림 2는 AB 야생형 제브라 피쉬 테일의 넓은 필드 뷰를 사용하여 많은 세포 분열을 관찰 할 수있는 능력을 보여줍니다. 일곱 개 이상의 유사 분열 세포는 14 분의 시간 프레임 (동영상 1)에 몇 군데 있습니다. 두 시간 시간 코스 내에서 40 개 이상의 유사 분열 이벤트가 포착되었다. 평균적으로 50 분할 세포는 AB에서 관찰하고 AUR의 B m / m...

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Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

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11.9K 조회수.  University of Alabama at Birmingham. Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

연구

발생학

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

초파리 배아에서 근육 수축의 라이브 이미징 및 분석

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.