We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. 시험 관내 전사 <ol><li> 효소 (31)를 소화을 NotI 제한에 의해 PCS2-H2A.F / Z-EGFP 및 / 또는 PCS2-mCherry-CAAX 벡터를 선형화. 시험 관내 전사 키트에서 RNA를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 각각의 템플릿으로부터 5 &#39;mRNA의 캡 제품을 생성한다. </li><li> 정제 키트를 사용하여 캡핑 된 mRNA의 정제. 제조업체의 지침을 따르십시오. 의 RNase가없는 H 2 O로 용출 </li><li> 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도에 의해 RNA의 농도를 결정한다. (OD 260 X 희석 × 40 μg의 / ㎖). </li><li> 각각 H2A.F / Z-EGFP 및 mCherry-CAAX의 RNase없는 H 2 O에 대한 μL / 100 NG에 RNA를 희석 RNA의 농도가 너무 낮은 경우, 형광이 감소 또는 부재한다. 밝은 샘플은 광독성과 광표백을 통해 우려를 감소합니다. 한편, 너무 많은 RNA는 독성 및 / 또는 표적 효과를 일으킬 수있다. 참고 : 나머지 저장-80 ° C의 냉동고에서 정제의 mRNA. </li></ol> 2. Zebrafish의 사육, 배아의 수집 및 mRNA의 주입 36-38 <ol><li> 두 개의 영역으로 탱크를 분리 제브라 피쉬 시설에 사용되는 양식 시스템 물 각각의 사육 탱크를 채우기 위해 장벽 사육 탱크를 조립합니다. </li><li> 사육 전날 밤, 불의의 번식을 방지하기 위해 다른면에 배리어의 일측 두 개의 암컷 어류 수컷을 배치하기 위해. </li><li> 다음 날, 얼음에 이전에 제조 된 mRNA의 혼합물을 해동. 신선한 양식 시스템 물 사육 탱크에 물을 교체하고 장벽을 제거합니다. 장벽이 가져온 후 즉시, 28.5 ° C로 사출 금형을 따뜻하게하고 미세 주입을위한 장비를 설정합니다. 참고 : 사출 금형에 대한 자세한 내용은 라흐 (36)을 참조하십시오. </li><li> 차 여과기를 사용하여 15 분, E와 깨끗한 100 × 15mm 페트리 접시에 계란을 씻어 - 계란마다 10 수집3 블루 (5 mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 CaCl2를, 0.33 mM의 황산, 10 -5 % 메틸렌 블루). E3은 푸른 곰팡이 성장을 방지하고, 물고기 유충 적절한 발전을 위해 사용된다. 결합 및 배아 컬렉션에 대한 자세한 내용은 라흐 36 Porazinkski (37)을 참조하십시오. </li><li> 삽입 한 셀은 가온 사출 금형에서 배아를 단계적 배아 (도 1a)의 목적하는 양으로 난황에 RNA를 주입. 자연 배아 죽음과 실험에 필요한 것보다 15 % 더 많은 배아에서 배아 주사를 수행하여 미 수정 배아를 차지한다. 제브라 피쉬 배아의 미세 주입에 대한 자세한 내용은 라흐 36 Porazinkski (37)을 참조하십시오. 주 : mRNA를 처음으로 사용하기 위해서는 종래 5D 촬상을 수행하는 (최대 5 DPF없이 총 발달 결함으로 정의)의 형광과 생존에 대한 최적 투여 량을 결정하기 위해 용량 - 곡선 분석을 수행한다. 150-200 NG / μL수정란 내로 주입 따라서는 최종 농도를위한 좋은 출발점이 종종 최적 농도이다. </li><li> 조심스럽게 수정 된 9 &quot;유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 금형에서 주입 된 배아를 추출합니다. 피펫을 수정하려면,이 공을 형성 할 때까지 분젠 버너를 사용하여 끝을 용융. </li><li> 28.5 ° C 배양기에서 100 × 15mm 페트리 E3 블루에서 요리와 집에서 주입 된 배아를 놓습니다. </li><li> 포스트 분사 여섯 시간은 플레이트에서 죽은 또는 미 수정 배아를 제거하고 깨끗한 E3 블루를 추가합니다. 28.5 ° C에서 하우스 배아. </li></ol> 3. 준비 및 이미징에 대한 라이브 Zebrafish의 태아의 포함 (그림 1B) <ol><li> 두 시간 이미징 전에 형광 해부 현미경을 사용하여 GFP에 대한 주입 된 배아를 화면. E3 블루와 새로운 100 × 15mm 페트리 접시에 밝은 녹색 GFP 발현 배아를 놓습니다. </li><li> 아가 E3 블루 100 ml의 낮은 용융 1g을 첨가하여 1 % 저 용융 아가 로스의 스톡 용액을 끓여. 아가로 오스를 사용한 후 알루미늄 호일로 플라스크를 커버한다. 원액 한 달까지 유용 남아있다. </li><li> 분취 액을 17 X 100mm 배양 관 내로 용융 아가 3 ㎖. 사용할 준비가 될 때까지 42 ° C의 물을 욕조에 문화 튜브를 배치하여 아가 로스를 따뜻하게 유지합니다. 제브라 피쉬 배아 (36) 마취 탈 이온수에 15 mM의 Tricaine 솔루션을 준비합니다. 주 : 이전 시점의 영상을 원하는 경우, 한천의 농도가 0.3 %로 낮은 39으로 감소 될 수있다. </li><li> 15 mM의 Tricaine, 상영 배아, 낮은 용융 아가로 오스, E3 블루, 및 해부 광학 현미경에 35mm 유리 커버 슬립 바닥 배양 접시를 가져옵니다. 조심스럽게 # 5 핀셋으로 배아의 융모막을 제거합니다. 세 개의 배아에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 별도의 용기에 dechorionated 배아를 마취 할 수 놓습니다. 커버 슬립 바닥 접시의 뚜껑은 주로 이러한 목적으로 사용된다. 전송 피펫을 사용하여, 세 방울을 추가 (약 150 μL)나까지 배아 충분히 마취 된 (커버 슬립 바닥 접시의 뚜껑을 사용하는 경우) 5 ml의 E3 블루의 접시에 15 mM의 Tricaine의. 1 % 용융 아가로 오스 튜브에 15 mM의 Tricaine 솔루션 - (200 ㎕를 약 150) 또한, 3 ~ 4 방울을 추가합니다. </li><li> 차단 피펫 팁 1 cm와 P200 피펫을 사용하여; 커버 슬립 바닥 접시에 마취 배아를 전송합니다. Tricaine 솔루션 : 초과 E3 블루를 제거합니다. </li><li> 배아 실수로 서로 가까이 표류하지 않도록하기 위해 별도의 각 드롭을 유지, 배아를 통해 Tricaine 솔루션 : 낮은 용융 아가로 오스 10 ㎕의 - 천천히 다섯을 추가합니다. 경고 : 아가로 오스가 너무 따뜻 경우에는 배아를 손상시킬 수 있습니다. 42 °의 C이다에 좋은 온도는 한천을 유지합니다. </li><li> 21 G 1 ½ 바늘을 사용하여 부드럽게 원하는 위치로 오스에서 배아의 방향. 시간 경과 이미징을위한 거꾸로 현미경을 사용하는 경우, possib로 커버 슬립에 가까운 관심 (ROI)의 영역의 방향르. 주 : 일반 목적 꼬리 영역 인해 비교적 얇은 조직 (도 1a)에 배향하고 명료 용이성을 제공한다. 이러한 노른자 및 핀 폴드를 둘러싸는 상피층 등 기타 조직, 28, 29을 이용할 수있다. 이 조직은 그러나이 지역은 불과 몇 세포층 두께이며, 좋은 선명도를 제공합니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 가능한 한 많은 세포 분열을 취득 꼬리 영역은 이미지에 유익하다. </li><li> 한천의 부분 응고에 대한 몇 분을 허용합니다. 그 응고를 테스트하기 위해 한천의 작은 조각 떨어져 휴식 바늘을 사용합니다. 한천의 조각을 드롭에서 멀리 당겨 할 수있는 경우, 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 낮은 용융 한천이 포함 된 배아를 통해 돔을 형성하는 전체 커버 슬립을 커버. 한천은 공 초점 영상 (그림 1A)의 요리를 이동하기 전에 응고하도록 허용합니다. </li><li> 한천 응고 공정 (약 10 분 소요) 동안, 3 ㎖ O 준비(약 250 μL) 15 mM의 Tricaine의 다섯 방울과 F E3 블루 솔루션은 영상 중에 포함 된 배아 위에 배치합니다. </li></ol> 라이브 Zebrafish의 배아 40, 41의 4 5D 공 촛점 이미징 참고 : 다른 공 초점 시스템을 사용하여 5D 영상을 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 아리가 40 오브라이언 (41)을 참조하십시오. Z-간격, Z-스택, Z-깊이, 시간 간격 및 5D의 정의는 그림 1C를 참조하십시오. <ol><li> 이미징 소프트웨어를 열고 60X NA 1.4 대물 렌즈로 현미경을 설정합니다. 대물 렌즈에 침지 기름을 적용하고 현미경 무대에 슬라이드 홀더에 배양 접시를 놓습니다. 축 제어기를 사용하여, 대물 렌즈를 상기 관심 배아 센터와 배양 접시에 맞게 상승 대물 렌즈를 가져온다. </li><li> 눈 조각 아이콘을 클릭하고 현미경에 GFP 필터로 전환합니다. 투자 수익 (ROI)에 초점을 맞 춥니 다. O를 coverslip에 가장 가까운 조직에 초점을 것입니다최적의 촬상 결과 ffer. </li><li> 연동을 제거합니다. (소프트웨어에서 사전 설정된 파장)에 GFP 및 mCherry 채널을 선택하고 정상에 옵션을 평균 라인을 설정합니다. </li><li> 사용 &quot;보기 / 취득 컨트롤 / A1 스캔 영역&quot;은 A1 스캔 영역 도구를 엽니 명령. </li><li> 스캔을 시작합니다. 스캔 영역이 가능한 제브라만큼 충전되도록 축 제어기를 이용하여 태아의 위치. 레이저 출력은이 점에서 최적으로 할 필요가 없다. 불필요한 광표백을 피하기 위해 레이저 파워를 낮 춥니 다. </li><li> ND 취득 제어판을 열고 &quot;보기 / 취득 컨트롤 / ND 취득&quot;명령을 사용하십시오. </li><li> Z 축 스택 매개 변수를 설정 스캔을 시작합니다. 세포가 더 이상 볼 수 있습니다 위치로 Z-스택 세포에 초점이없는 경우에 상한과 하한을 설정합니다. 촬상 영역으로 확장 할 수있다 성장 및 세포 이동을 위해 샘플 위에 3 ㎛의 공간 허용한다. 이 프로에 도시 된 도면의 Z 스택로토콜은 배아의 꼬리에 40 ㎛의 Z-깊이 덮여있다. </li><li> 2 μm의에 Z-간격 스텝 크기를 설정합니다. 평균 셀 직경 10 ㎛의이며; 따라서, 2㎛는 촬상 데이터 다섯 간격은 각각의 셀에 대해 분석되도록 생성된다. 참고를 취득 할 수있는 화상의 깊이는 Z 간격에 의존한다. Z 해결 가능한 (Z-큰 깊이)와 같은 유사 분열을 겪고 많은 세포로서 이미지를 위하여 Z 차원의 전체 깊이를 얻기 위해 희생된다. Z 깊이 (Z-작은 깊이)를 희생하는 동안 그 역으로, 사실, 스텝 사이즈를 감소시킴으로써, Z 해상도가 얻어진다. </li><li> 화상 레이저 파워, HV을 조정 레벨 오프셋. 실험이 프로토콜에서 설명 들어, 다음의 레이저 파워, HV를 사용하여 GFP 채널에 각각 상응하는 레벨로 설정된 레벨을 오프셋 (5), (120) - - 2 (140), 및 -11에 -9. mCherry 채널 들어, 다음 레이저 파워, HV를 사용하고, 각 레벨을 오프셋 3-6, 120-140, 및 -3-8. 매개 변수가 설정되면, 샘플의 광독성 및 광표백 될 수 있습니다 불필요한 레이저 노출을 방지하기 위해 스캔을 종료합니다. </li><li> 2 번 라인의 평균 아이콘을 선택합니다. &quot;평균 4 배 라인은&quot;크게 스캔 시간을 증가하는 동안 &quot;아무 평균&quot;는 거친 이미지를 생성합니다. 배 선 평균의 사용은 이미지 품질과 빠른 스캔 시간 최고의 제공합니다. </li><li> 실험에 필요한 적절한 시간 간격 및 시간 지속 기간을 선택한다. 야생형 구분 내용을 2 시간 2 분의 시간 간격 (도 1,도 2,도 3a 및도 3b에서 사용) 분열 기간을 결정하기위한 최선이다. 이상 30 분 동안 스핀들 조립 검사 점을 활성화 부문도 3c에 설명 된대로 형광을 유지하기 위해 네 시간 다섯 분 간격으로 더 적합하다. </li><li> &quot;파일 저장&quot;상자를 선택하고이 획득되고 자동으로 파일을 저장할 파일 이름을 지정합니다. 모든 파 더블 체크rameters 올바르게 설정하고 &quot;실행을 시작합니다&quot;충돌한다. </li><li> 인수가 완료되면, 세 차원 형식의 파일을 볼 볼륨 임계 값 아이콘을 클릭합니다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 방법의 사용은 하나가 생체 내에서 한 번에 의존하는 방식으로 두 개의 새로운 세포를 형성하는 핵 봉투 고장, 미세 소관 - 동원체 첨부하여 중기 판의 형성 및 자매 염색 분체의 분리를 유추 할 수 있습니다. 세포가 천연 생리에 묘화되기 때문에 제브라 유사 분열 관찰하는 능력은 조직 형광 단백질을 사용하기 위해, 그들은 비교적 빠른 개발 및 저속 촬상 허용하는 투명 고정 샘플 및 세...

유사 분열은 살아있는 유기체의 성장, 분화 및 재생을위한 중요한 세포 과정에 필수적이다. 정확한 준비와 계면에서 DNA의 복제하면, 셀 분할 할 준비가 끝났다. 유사 분열, 의향의 첫 단계는 사이클린 B /는 Cdk1의 활성화에 의해 개시된다. 의향은 염색체에 염색질 물질의 응축을 특징으로한다. 핵 봉투 고장 의향 및 prometaphase 사이의 전환에서 발생한다. prometaphase에서, 중심체는 스핀들 형성을위한 핵 센터는 동원체 첨부 파일의 검색 미세 소관을 확장하면서 반대 극으로 이주하기 시작합니다. 부착시, 전환은 미세 소관의 첨부 파일 - 종료하고 장력은 중기 판 (1)을 구성하는 염색체의 방향. 모든 염색체가 올바르게 연결된 경우, 스핀들 조립 검사 점은 만족 함께 자매 염색 분체를 들고 cohesin 반지가 절단되고, 미세 소관은 동생을 끌어 단축anaphase (핵분열 말기), 3 중 반대 극에 염색 분체. 마지막 단계는 telophase, 두 개의 새로운 핵 주위의 핵 봉투의 세포와 개혁의 신장을 포함한다. 세포질 분열는 두 개의 새로운 딸 세포 4-6의 세포질을 분리하여 분할 프로세스를 완료합니다. 키 유사 분열 경로 (즉, 스핀들 조립 검사 점, 중심체 복제, 자매 염색 분체의 응집, 등.)의 변경은 중기 체포, 염색체의 missegregation 및 게놈 불안정 7-10 발생할 수 있습니다. 궁극적으로, 경로 제어 유사 분열에 결함이 발달 장애 및 암, 유사 분열의 필요로 시각화 및 라이브, 척추, 다세포 유기체 10-16에서의 결함의 원인이 될 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아 인해 투명한 조직, 미세 주입의 용이성, 빠른 발전에 라이브 영상을위한 훌륭한 모델 생물의 역할을한다. 제브라 피쉬를 사용하여,이 원고의 전반적인 목표는이다라이브 5D 분열 (17) (도 1C)의 (차원 X, Y, Z, 시간 및 파장) 이미징하는 방법을 설명한다. 다른 유사 분열 경로에 결함이있는 돌연변이 제브라 피쉬의 사용은 이러한 결함의 결과를 보여줍니다. 이 프로토콜의 경우, 오로라 B와 Esco2 돌연변이는 이러한 결함을 설명하기 위해 선택되었다. 오로라 B는 스핀들 형성 및 미세 소관의 부착에 관여하는 염색체 승객 복잡 (CPC)의 일부인 키나제이다. 또한 세포질 분열 18,19 분열 고랑 형성을 위해 필요하다. 제브라 피쉬에서 오로라 B 결핍은 밭고랑 유도, 세포질 분열과 염색체 분리 (20)의 결함으로 이어집니다. Esco2 반면에, 자매 염색 분체의 응집 21,22 필수 인 아세틸이다. 그것은 이렇게 중기-anaphase (핵분열 말기) 천이 23 적절한 염색체 분리를 보장하기 cohesin 안정화 링 SMC3 부에 cohesin을 아세틸 레이트. 제브라 피쉬의 Esco2의 손실으로 Ch 리드romosome missegregation, 조기 자매 염색 분체 분리, 게놈의 불안정성 및 p53의 종속 및 독립적 인 세포 사멸 (24, 25). 인해 가용성 auroraB의 hi1045 및 esco2의 hi2865 돌연변이 제브라 25-27이 기술을 설명하기 위해 사용될 것이다 (이하 aurB m / m 및 m 개의 esco2 / m 각각이라 함). 형광 태그 셀 기계와 커플 링 공 초점 현미경은 유사 분열 25,28,29 동안 크로 마틴과 세포막 역학을 시각화하는 연구자 수있었습니다. 형광 태그가 히스톤은 역사적으로 염색질을 시각화하는 데 사용되었다. 히스톤은 염색체 (30)를 구성하는 뉴 클레오 구조에 대한 책임이 있습니다 네 가지 쌍 (H2A, H2B, H3 및 H4)로 구성된 핵 단백질이다. H2B는 틀림없이 형광 단백질을 가장 많이 사용되는 히스톤 동안마우스와 세포 배양, 히스톤 2A의 사용, 가족 Z (H2A.F / Z)는 제브라 피쉬 (31, 32)에 사용하기 위해 잘 입증하고있다. 콘 카나 발린 A와 카제인 키나제 1-γ는 예를 들어, 세포막에 지역화 및 이전 성게 초파리 (33, 34)의 세포막을 시각화 효과적인 것으로 나타났다. 다른 연구는 CAAX 형광 표지 된 단백질이 세포막 라벨 것을 도시 제브라 31에 성공했다. CAAX는 farnesyltransferases 및 geranylgeranyltransferases로 번역 후 수정 효소에 의해 인식되는 주제이다. 이 효소에 의해 변형 단백질 따라서 세포막 (35) 라벨, 멤브레인 관련되는 원인. 때문에 제브라 피쉬에서 사용하기 전에,이 프로토콜은 염색질과 세포막에 라벨을 H2A.F / Z와 CAAX를 사용하기로 결정했습니다. 이 방법의 응용 프로그램은 각각의 염색체를 관찰하는 연구자가 개별 세포 수준에서 유사 분열을 모니터링 할 수 있습니다역학뿐만 아니라, 동시에 조직 분화 및 발달에 영향을 미칠 수있는 여러 세포 분열을 모니터링한다. 이 문서는 개별 세포 수준에서 유사 분열시 염색체 분리의 역학 이미징에 초점을 맞출 것이다. 이 논문 내에서 여러 분열 분열 관찰 분할 시간을 계산하고, 유사 분열 표현형을 해독 할 수있는 능력은 도시되고 논의 될 것이다. 이러한 매개 변수를 사용하여 생리적으로 관련된 데이터가 수집 될 수 있고, 유사 분열 결함의 영향을 여러 질환 상태에 적용 하였다.

<table><tbody><tr><td>pCS2 vectors</td><td>Gift from K. Kwan</td><td></td><td>For plasmid of interest</td></tr><tr><td>NotI-HF restriction enzyme</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>For restriction digest of plasmid</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; transcription</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For purifying mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For housing embryos</td></tr><tr><td>microinjection mold</td><td>homemade</td><td></td><td>For holding embryos during microinjection</td></tr><tr><td>Agarose II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>For embedding embryos</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>For anesthetizing embryos</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>100 mm culture tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>For melted agar</td></tr><tr><td>35 mm glass coverslip bottom culture dish&amp;nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&amp;nbsp;</td><td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td></tr><tr><td>#5 tweezers</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>For dechorionating embryos</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 gauge needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>For positioning embryos in agar</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>For time-lapse imaging</td></tr><tr><td>Confocal software</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>For image acquisition and processing</td></tr></tbody></table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

유사 분열은 유기체의 성장과 분화에 중요합니다. 이 과정은 매우 동적이며 작은 시간 프레임에 적절한 염색질 응축, 미세 소관 - 동원체 부착, 염색체 분리 및 세포질 분열을 수행하는 이벤트를 주문할 필요합니다. 섬세한 과정에서 오류가 출생 결함과 암을 포함하여 인간의 질병이 발생할 수 있습니다. 인간 유사 분열 질환 상태를 조사 전통적인 접근법들은 인간의 질병을 연구 할 때 천연 생리 유리한 개발 / 조직 특정 콘텍스트 부족한 세포 배양 시스템에 의존한다. 이 프로토콜은 고해상도, 척추 시스템에서 염색체 역학 제브라 피쉬으로 시각화하는 방법을 제공함으로써 많은 장애물을 극복한다. 이 프로토콜 세부 사항을 포함 분열하는 세포의 동적 이미지를 획득하는 데 사용할 수있는 방법 것 : 시험 관내 전사, 제브라 피쉬 번식 / 수집, 배아 삽입하고, 시간 경과 영상을. 최적화 및 modif이 프로토콜의 ications도 탐구한다. H2A.F / Z-EGFP를 사용하여 mCherry-CAAX (라벨 세포막) mRNA를 주입 배아, AB 야생형, auroraB의 hi1045 및 돌연변이 제브라 피쉬가 가시화 esco2의 hi2865의 유사 분열 (염색질 레이블). 제브라 피쉬의 고해상도 라이브 영상은 하나가 통계적으로 유사 분열의 결함 및 유사 분열 진행의 타이밍을 정량화하기 위해 여러 유사 분열을 관찰 할 수 있습니다. 또한, 잘못된 (즉, congression 결함, 염색체 missegregation 등) 유사 분열 과정 부적절한 염색체 결과 (즉, 염색체, 배수성, 소핵 등)을 정의 질적 측면 관찰 관찰된다. 상기 분석은 조직 분화 / 현상의 관찰에 적용 돌연변이 제브라 약리 제제의 사용 의무가 될 수있다. 유사 분열에 결함이 암과 발달 장애에 의지 크게 이끌어 방법의 시각화질병의 발병 기전에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.

그림 2는 AB 야생형 제브라 피쉬 테일의 넓은 필드 뷰를 사용하여 많은 세포 분열을 관찰 할 수있는 능력을 보여줍니다. 일곱 개 이상의 유사 분열 세포는 14 분의 시간 프레임 (동영상 1)에 몇 군데 있습니다. 두 시간 시간 코스 내에서 40 개 이상의 유사 분열 이벤트가 포착되었다. 평균적으로 50 분할 세포는 AB에서 관찰하고 AUR의 B m / m...

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Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

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12.0K 조회수.  University of Alabama at Birmingham. Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

비디오: Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

연구

발생학

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

생물학

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

신경과학

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시 배아를 위한 개선된 Multiview Light Sheet Microscopy 프로토콜

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 고해상도 멀티뷰 광시트 현미경을 위한 제브라피시 배아 장착 전략 — 이미징 및 이미지 재구성 기법

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

요약

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살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

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실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

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Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos