미세 글리 아 표현 형을 완전히 특성화 하려면 기저 및 방향 운동 성을 모두 해결 하는 것이 중요 합니다. 이 프로토콜은 맞춤형 3D 인쇄 인터페이스 및 관류 챔버를 사용하여 마우스 뇌 슬라이스에서 2 광자 이미징에 의해 microglia의 방향 운동성을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 패니 에티엔느, 박사 과정 학생, 그리고 빈센조 마스트리아, 박사 후 연구원, 모두 우리의 실험실에서 될 것입니다.
해부 30분 전에 는 70밀리리터의 콜린 인공 뇌척수액 또는 콜린 aCSF를 얼음 위에 부글끓기 시작합니다. 카보겐과 함께 32도에 콜린 aCSF 150 밀리리터를 추가합니다. 200 밀리리터 결정화 접시에 바 자석을 밀봉된 푸드 박스에 넣고 200밀리리터의 aCSF를 접시에 넣습니다.
3D 인쇄 인터페이스 슬라이스 홀더를 접시 위에 놓고 인터페이스 슬라이드 홀더의 메쉬를 덮는 용액의 박막만 남아있을 때까지 결정화 접시에서 과도한 유체를 제거합니다. 음식 상자 의 바닥에 aCSF의 몇 밀리미터를 추가하고 카르보겐으로 유체를 버블링 시작합니다. 그런 다음, 밀봉 된 상자를 닫으면서 지속적인 육습을 유지하면서 가습, 95 %의 산소, 5 %의 이산화탄소가 풍부한 인터페이스 챔버를 만듭니다.
수확 후, aCSF에 젖은 필터 용지의 조각에 뇌를 배치하고 슬라이스의 바람직한 각도에 따라 관심의 영역을 해부. 관상 동맥의 경우, 뇌의 소달 면을 진동 슬라이서의 절단 블록에 부착된 10센티미터 페트리 접시에 배치하고, 얼음으로 채워진 큰 챔버 내에서 진동 슬라이서의 저수지 챔버에 블록을 배치합니다. 차가운 콜린 aCSF로 접시를 채우고 슬라이스를 사용하여 300 마이크로 미터 두께의 뇌 조각을 얻을 수 있으며 블레이드의 모든 패스 후 4 밀리미터 직경의 일회용 이송 파이펫을 사용하여 각 슬라이스를 수집합니다.
각 슬라이스는 32도 콜린 aCSF에서 약 10 분 동안 회복한 후, 슬라이스를 렌즈 클리닝 용지에 옮기고 콜린 aCSF 한 방울을 얹어 놓습니다. 그런 다음 여분의 콜린 aCSF를 흡습하고 주걱을 사용하여 슬라이스를 인터페이스 챔버의 메시로 전송하여 슬라이스가 이 환경에서 적어도 30 분 동안 복구 할 수 있게합니다. 레코딩을 시작하기 30분 전에, 조직 조각의 산소화 및 생존가능성을 최적화하기 위해 상하 관류와 함께 맞춤형 녹음 챔버에 연동 펌프를 연결하고, 50밀리리터의 초순수수로 전체 관류 시스템을 청소한다.
세정 사이클의 끝에서, 일정한 카보징 하에서 유리 비커에 aCSF의 50 밀리리터와 녹음 챔버의 관류를 시작하고, 일회용, 넓은 입 전달 파이펫을 사용하여 렌즈 종이를 제거하기 위해 비커에 이미지될 첫 번째 슬라이스를 전송한다. 단면이 비커의 바닥으로 침몰하면, 섹션을 기록 챔버로 옮기고 슬라이스 홀더를 슬라이스에 배치하여 관류 흐름에 의해 유도된 움직임을 최소화한다. 밝은 필드 조명을 사용하여 5 ~ 10 배율에서 관심있는 뇌 영역을 대상으로합니다.
그런 다음 0.35배의 수분 침수 렌즈를 사용하여 25배 의 목표를 사용하여 시야의 위치를 조정합니다. 형광 조명을 사용하여 형광 마이크로글리아 세포를 찾고 최종 농도에서 관심 화합물을 포함하는 10 마이크로 리터의 aCSF로 파이펫을 백필하십시오. 팁에 갇힌 기포를 제거하고 5밀리리터 주사기에 연결된 파이펫 홀더에 채워진 파이펫 홀더에 장착하고 플런저를 5밀리리터 위치에 배치하고 3축 마이크로 조작기에 장착하여 팁을 부드럽게 흔들어 아래쪽으로 가리킵니다.
파이펫 끝이 슬라이스 표면에 가볍게 닿을 때까지 파이펫을 슬라이스쪽으로 부드럽게 내리고 목표를 동시에 제어하고 조정합니다. 이제 레이저를 조정하고 현미경을 다광 모드로 전환합니다. 챔버가 모든 광원에서 스크리닝되고 비디캔디검출기를 켜는지 확인하십시오.
게인을 설정하고 이미지의 픽셀을 포화하지 않도록 색상으로 구분된 상한이 있는 조회 테이블을 사용합니다. 그런 다음, 적어도 30분의 총 지속 시간 동안 레코딩을 시작하여 5분 후 5초 동안 주사기 플런저를 5분에서 1밀리리터 위치로 천천히 우울하여 단면에 화합물을 적용한다. 이미지 분석을 위해 먼저 관심 파일에 ImageJ를 통해 z 프로젝션 및 드리프트 보정을 수행합니다.
그런 다음, 얼음에서 수정된 파일을 열고 사출 부위를 중심으로 35마이크로미터 직경의 관심 영역을 그립니다. ROI로 영화를 다시 실행하여 위치가 잘 되었는지 확인합니다. 그런 다음 관심 강도 의 영역을 사용하여 관심 지역에서 시간이 지남에 따라 평균 강도를 측정하고 결과를 XLs 파일로 저장합니다.
이 프로토콜은 ATP 또는 세로토닌과 같은 다른 화합물에 의해 유도된 반응을 측정할 수 있게 합니다. ATP의 주사는 형광의 증가를 유도하지만, 대부분의 ATP 주사 후, 몇 분 후에 돌아오는 조직 왜곡으로 인해 형광의 즉각적이고 약간의 감소가 있습니다. 경위를 증가시켜 실험 중 가변성을 감소시키고 검출된 반응의 정확도와 크기를 감소시키기 때문에 관심 영역의 크기도 정량화에 영향을 미칩니다.
특정 시점에서 마이크로글리아 반응의 평가는 상이한 화합물의 통계적 비교에 유용할 수 있으며, 관류 용액에 추가된 특정 길항제의 효과를 테스트하는 데 유용할 수 있다. 3차원으로 운동성을 정량화하려면 분석 요구 사항에 맞게 z 단계 간격과 수집의 샘플링 속도를 변경해야 할 수 있습니다.
