우리의 연구는 산화철 나노입자 플랫폼에서 이미지 유도 치료제를 사용하여 유방암 전이를 치료하는 데 중점을 두고 있습니다. 목표는 암 관련 사망의 주요 원인인 전이성 조직을 특이적으로 겨냥한 효과적인 치료법을 개발하는 것입니다. 동물을 희생시키지 않고 전신 치료제가 원하는 조직에 도달했는지 여부를 결정하는 것은 어려울 수 있습니다.
MRI 및 광학 이미징 방식을 사용하여 나노 입자를 이미지화할 수 있으므로 살아있는 동물의 약물 전달 및 축적을 모니터링할 수 있습니다. 전이성 유방암에 대한 현재의 치료법은 전이에 특이적이지 않고, 효능이 다양하며, 바람직하지 않은 부작용을 일으킵니다. 당사의 나노 입자 플랫폼은 전이성 틈새를 특이적으로 표적으로 하며 부작용의 증거 없이 전달을 비침습적으로 모니터링할 수 있습니다.
이전에는 나노입자 플랫폼을 사용하여 전이의 동인인 miR-10b를 표적으로 삼았고 전이와 전이의 성장을 저지할 수 있었습니다. 임상 중개를 염두에 두고 치료 요법을 최적화하고 효능을 극대화하기 위해 이 제형의 약력학을 조사하고 있습니다. 시작하려면 냉동 Matrigel을 섭씨 4도에서 24시간 동안 두어 매트릭스 추출물이 액화되도록 합니다.
연구에 필요한 총 세포 수를 결정한 후 세포를 트립신화하고 PBS로 세척합니다. 200G에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 500마이크로리터의 냉각된 PBS에 다시 현탁시켜 셀 스톡을 생성합니다.
이제 총 세포 수를 40 곱하기 10으로 희석하여 밀리리터당 6 세포의 거듭제곱을 얻습니다. 그런 다음 동일한 부피의 냉각 매트릭스 추출물을 첨가하여 50마이크로리터당 6개 세포의 거듭제곱에 1 곱하기 10의 최종 농도를 달성합니다. 이식 전에 추출물이 응고되는 것을 방지하기 위해 혼합물을 얼음에 보관하십시오.
마취된 마우스를 가열 패드의 노즈콘으로 옮깁니다. 마취 수술 평면을 확인한 후 각막 건조로부터 눈을 보호하기 위해 안과 연고를 도포합니다. 그런 다음 알코올 물티슈로 주사 부위 근처의 피부를 청소하고 몇 초 동안 건조시킵니다.
원발성 종양과 일반적인 전이 부위 사이의 신호 중복을 최소화하기 위해 4번 유선에서 유도합니다. 이제 셀 스톡을 위아래로 피펫팅하여 세포를 다시 현탁시킵니다. 50 게이지 바늘이 있는 인슐린 주사기에 얼음 냉각 세포 현탁액 50마이크로리터를 뽑습니다.
원하는 유선의 젖꼭지 바로 아래에 바늘 베벨을 마우스의 몸체와 평행하게 삽입하고 꾸준하고 느린 속도로 세포를 주입합니다. 주사를 마친 후 최소 5초 동안 바늘을 피부에 그대로 두어 Matrigel이 응고되고 누출을 방지할 수 있도록 합니다. 그 후, 회복을 위해 마우스를 보온 패드의 깨끗한 케이지로 옮기고 완전히 보행할 수 있고 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 때까지 감독합니다.
종양 성장 및 전이 진행을 모니터링하기 위해 마취된 전이성 유방암 마우스 모델에 복막내 체중 1kg당 150mg의 루시페린을 주입합니다. 생쥐를 보온 패드의 우리로 되돌려 놓고 쥐가 깨어나 루시페린을 대사할 수 있도록 합니다. 그런 다음 이미징 시스템 스캐너를 사용하여 루시페린 주입 후 약 10분 후부터 마우스를 이미지화합니다.
최대 5마리의 마우스를 누운 자세로 함께 이미지화하여 전체 몸이 시야 가이드 표시 내에 포함되고 가능한 한 직선 방향이 되도록 합니다. 겨드랑이 림프절을 더 잘 볼 수 있도록 투명 테이프를 사용하여 팔을 고정합니다. 이제 이미징 시스템 소프트웨어에서 생물 발광 이미징을 위해 Exposure를 Auto로, Binning을 Medium으로, FStop을 1로, Excitation을 Block으로, Emission을 Open으로, FOV를 D로, Height를 1.50으로 설정합니다.
일반적으로 표면적인 위치로 인해 강한 신호를 생성하는 원발성 종양을 이미징할 때 노출을 자동으로 설정합니다. 전이를 모니터링하는 경우 원발성 종양을 검은색 전기 테이프로 조심스럽게 덮고 수동으로 노출을 300초로 설정하여 희미한 신호를 포착합니다. 시작하려면 전이성 유방암 마우스의 무게를 측정하십시오., Nanodrug 투여량은 체중을 기준으로 합니다.
쥐 체중 1kg당 10mg의 철 Nanodrug로 채워진 29게이지 바늘로 인슐린 주사기를 준비합니다. 그런 다음 마취된 동물의 꼬리를 섭씨 30-35도의 따뜻한 물에 30초 동안 담가 꼬리 정맥을 확장시킵니다. 그 후 꼬리에서 여분의 물을 닦아내고 70% 알코올 물티슈로 주입 부위를 청소합니다.
이제 바늘 베벨을 꼬리 아래쪽의 대략 절반 정도 측면 꼬리 정맥에 삽입합니다. 플런저를 약간 뒤로 당겨 혈액이 바늘로 역화되어 배치를 확인합니다. 성공적인 삽입 시, 40 마이크로리터 주입을 위한 대략 5 10 초의 느린 비율로 Nanodrug를 꾸준히 주사하십시오.
주사 부위 근처의 꼬리 피부 아래에 용액이 고이지 않고 어두운 나노 입자 용액으로 인해 정맥이 어두워짐으로써 성공적인 주입을 확인하십시오. 거즈로 주입 부위에 압력을 가하고 바늘을 제거합니다. 출혈이 멈출 때까지 약 30초 동안 압력을 유지합니다.
전이 샘플을 수집하려면 먼저 생물 발광 이미징을 사용하여 마우스를 이미징합니다. 전이를 수집한 후 수집된 조직을 페트리 접시에 넣습니다. 이미징 시스템 소프트웨어에서 생물 발광 이미징을 위해 Exposure를 Auto로, Binning을 Medium으로, FStop을 1로, Excitation을 Block으로, Emission을 Open으로, FOV를 D로, Height를 1.50으로 설정합니다.
형광 이미징의 경우 Exposure를 Auto로, Binning을 Medium으로, FStop을 1로, Excitation을 675로, Emissions를 720으로, Lamp Level을 High로, FOV를 D로, Height를 1.50으로 설정합니다. 그런 다음 BLI로 쥐 사체를 이미지화하여 수집할 가치가 있는 암 조직이 남아 있는지 확인합니다. 다음으로, 수집된 암 조직을 PBS에서 헹굽니다.
현미경 검사 또는 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응을 위해 조직을 수집하려면 최적의 절단 온도 화합물에 내장하고 처리 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 유도 결합 플라즈마 발광 분광법(inductively coupled plasma optical emission spectroscopy)을 위한 조직을 수집하려면 빈 1.7ml 튜브를 사용하여 스케일의 무게를 측정합니다. 조직을 튜브에 넣고 무게를 기록합니다.
조직을 동결한 후 처리 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 최적의 절단 온도인 저온 절편은 10마이크로미터 두께의 현미경 슬라이드에 신선하게 동결된 샘플을 내장했습니다. 조직 유형에 따라 챔버와 표본 홀더 온도를 섭씨 영하 20도에서 영하 15도 사이로 조정합니다.
조직 절편을 4% 파라포름알데히드 용액에 15분 동안 담가 슬라이드에 고정합니다. PBS로 슬라이드를 조심스럽게 헹굽니다. 그런 다음 조직 구조를 시각화하기 위해 DAPI가 포함된 매체를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.
형광 현미경을 사용하여 조직 절편에서 나노약물 전달을 나타내는 Cy5.5 형광을 검사합니다. 형광 신호가 배경 잡음이 아닌지 확인하기 위해 주입하지 않은 동물의 음성 대조군 샘플과 비교합니다. 나노약물을 투여한 마우스는 투여 일주일 후 폐 전이에서 상당한 생물 발광 신호를 보였으며, 이는 폐 조직에 전이가 있음을 확인했습니다.
형광 이미징은 치료된 마우스의 전이성 폐 조직에서만 Nanodrug에서 Cy5.5의 축적을 확인했습니다.
