자궁 에서 이중 전기 화는 다른 위치와 발달 세에서 생성 된 뉴런 세포 사이의 상호 작용과 같은 포유류 코르티코 발생의 중요한 측면을 연구하기위한 강력한 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 상세하며 저렴한 방식으로 이러한 다른 세포 집단 간의 흔들리지 않는 상호 작용을 검사하는 기능입니다. 우리의 방법의 한 눈에 띄는 의미는 우리의 배선이 자폐증과 정신 분열증 같이 신경 무질서에서 얼마나 유사한지의 더 나은 이해를 용이하게 한다는 것입니다.
이 연구는 신피질에 국한되지 않지만 세포 상호 작용, 세팔륨 또는 소뇌와 같은 외코르티코 부위에 세포를 분석하기 위해 사용될 수도 있다. 가장 어려운 단계 중 하나는 초기 배아의 측면 심실에 DNA를 주입하는 것입니다. 밝은 광원의 사용은 성공적인 주사에 필수적이다.
각 수술에 대해 먼저 빠른 녹색 염료 1마이크로리터를 포함하는 10 마이크로리터 용액, 각 플라스미드에 대한 관심의 마이크로리터 플라스미드 DNA 솔루션 당 1마이크로그램, 엔도톡신 프리 TE 버퍼에 적절한 부피를 준비한다. 그리고 적절한 준비 된 DNA 용액으로 유리 미세 모세관 파이펫을 미리로드합니다. 자궁 전공 수술의 첫 번째 경우, 적절하게 적정한 마취 임신 마우스의 눈에 연고를 적용하고 면도기를 사용하여 복부를 면도합니다.
복부의 오른쪽에 절개를 진행하기 전에 순차적 70 %에탄올과 요오드 와이프로 노출 된 피부를 두 번 소독하십시오. 자궁이 접근되면 조심스럽게 장기를 추출링 집게를 사용합니다. 구강 제어 흡구관을 사용하여, 전략 A.Or 전략 B의 오른쪽 반구의 측면 심실에 E11.5 배아의 왼쪽 반구의 측면 심실에 약 0.5 마이크로리터의 용액을 주입하여 빠른 녹색 염료가 심실 내부에 보일 때까지.
모든 용액이 주입되었을 때, 포셉 타입의 백금 전극을 주입배아의 머리 주위에 측면으로 배치하고, 전략 A를 위한 피질 옷자락을 표적으로 하는 포지티폴을 또는 전략 B를 위한 측면 피질을 지향하여 심장과 태반을 피하기 위해 주의를 기울인다. 제곱파 전기포라이터를 사용하여 각 배아 연령에 적합한 전기 펄스 시퀀스를 적용합니다. 모든 배아가 주입되고 전기화되었을 때, 집게를 사용하여 자궁을 복강에 조심스럽게 돌려시키고 복부를 따뜻한 식염수로 채웁니다.
바늘 6-0 봉합사를 사용하여 복벽을 닫고 피부 절개를 조심스럽게 닫습니다. 그런 다음 동물을 완전한 회복까지 모니터링하여 홈 케이지로 돌아갑니다. 초기 수술 이틀 후, 마우스가 정상적인 행동을 나타내는지 확인하고 통증이나 고통의 흔적을 제시하지 않습니다.
자궁 전기기에서 두 번째 동물을 준비하기 전에 방금 입증된 바와 같이. 전략 A를 위한 E13.5 배아의 왼쪽 측면 뇌 심실에 원하는 DNA 용액의 0.5 마이크로리터를 주입하고, 전략 B.를 위한 E15.5 배아의 좌측 측측 뇌 심실로 각 주사 후, 전략 A 및 전략 B.및 전략 B.및 전극을 통해 배아를 주입하는 양극을 가진 전극을 배치한다. 전기포이션이 끝나면 자궁을 복강으로 돌려보내 수술 및 수술 후 치료를 완료합니다.
전략 A를 구현할 때, 제2 전기기후 4일, 태아의 날 17.5 임신한 암컷 마우스의 자궁을 얼음 위에 PBS의 페트리 접시로 수확한다. 그리고 핀셋을 사용하여 해부 현미경으로 태아를 PBS의 새로운 접시로 옮기. 집게를 사용하여 각 배아의 머리를 조심스럽게 잡고 머리와 두개골 에 피부의 제거를 용이하게합니다.
노출 된 뇌를 들어 올리기 위해 집게 또는 주걱을 사용합니다. 그런 다음 숟가락을 사용하여 각 뇌를 48 개의 우물로 옮기면 약 600 마이크로 리터의 고정 용액이 들어 있습니다. 모든 뇌가 수집되었을 때, 궤도 셰이커에서 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 뇌를 고치고 PBS에서 3 10 분 동안 세워합니다.
마지막 세척 후, 약 10 분 동안 PBS에서 4 % 낮은 융점 아가로즈에 뇌를 포함. 아가로즈가 고화된 후, 시아노아크라일레이트 접착제를 사용하여 각 뇌를 진동 조직 홀더 후각 전구쪽으로 고정하십시오. 홀더를 진동 용기 안에 넣고 컨테이너를 PBS로 채웁니다.
그런 다음 진동과 브러시를 사용하여 100 마이크로미터 두께의 관상 연재 섹션을 얻습니다. 우물 당 7 개의 섹션과 배아 당 6 개의 우물을 옮기는 새로운 48 개의 우물 판에는 신선한 PBS의 웰 당 600 마이크로 리터가 함유 되어 있으며, 항 진균 방부제로 보충됩니다. 모든 단면을 획득하면 각 섹션을 유리 현미경 슬라이드에 장착하고 유리 표지슬립으로 덮어 직립 에피오레시언스 현미경의 전기기공 효능을 평가합니다.
전략 B를 구현할 때, 15일 산후일에, 토핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 마우스를 supine 위치에 고정하고, 가위를 사용하여 중진 피부 절개를 하여 흉곽과 횡격막을 노출시키고, 다이어프램을 잘라 심장에 접근할 수 있도록 한다. 미세 한 가위를 사용 하 여 오른쪽 아트리움에 절개를 하고, 왼쪽 심실을 관통 하는 연동 관류 펌프에 유연한 튜브에 연결 된 25 게이지 바늘을 사용 하 여. 바늘이 제자리에있을 때, 분당 5.5 밀리리터에서 일정한 플럭스에서, 환원 관류에 의해 4 % 파라 포름알데히드의 적어도 25 밀리리터를 제공합니다.
약 5분 후에 관류를 멈추고 가위를 사용하여 머리 위로 피부를 제거합니다. 두개골을 제거하고 주걱을 사용하여 뇌 조직을 제거하십시오. 뇌를 24밀리리터의 신선한 4%파라포름알데히드를 함유한 24개의 웰 플레이트에 넣고, 궤도 셰이커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 잠식합니다.
그런 다음 방금 입증 된 대로 산후 뇌의 40 마이크로 미터 섹션을 획득하십시오. 배아 및 산후 뇌 슬라이스 이미징의 경우, 관심의 장착 된 뇌 섹션을 포함하는 슬라이드를 현미경 슬라이드 홀더에 놓습니다. 공초점 현미경에서 슬라이더 홀더를 소개하고 실험에 사용되는 형광에 적합한 채널을 선택합니다.
샘플 스캐닝을 수행하여 두 개의 서로 다른 파장에서 각 뇌 섹션의 맵 이미지를 얻어 이중 전기기 출력의 일반적인 뷰를 확인합니다. 완료되면 다중 영역 Z 스택 시간 경과 관찰 모드에서 10배 렌즈를 선택합니다. 각 선택된 XY 영역에서, 적절한 이미징 둘레뿐만 아니라 형광이 보이는 시료의 평면에 따라 Z 축을 따라 스캐닝의 깊이를 설정합니다.
선택한 모든 영역의 낮은 배율 이미지를 얻고 현미경 뷰어 소프트웨어에서 OIF에서 TIFF 형식으로 이미지를 내보냅니다. 그런 다음 60x 렌즈를 선택하고 방금 입증된 대로 높은 배율 이미지를 캡처하여 세포 대 세포 상호 작용을 보다 상세한 수준으로 관찰합니다. 자궁 전분 수술에서 이중 간격은 CAG 가태리 날 11.5에 표적으로 한 CAG 토레수세포를 수색성 부위를 포함한 측면 신피질의 한계 영역에 도달할 수 있게 해 주며, 13.5일째배아에 표지된 피질 프로젝션 뉴런과의 접촉을 확립할 수 있다.
향상된 GFP를 표현하는 프로젝션 뉴런의 주요 프로세스는 피질의 한계 영역에서 풍부하게 상승하고, 음용 세포를 표현하는 M-체리의 과정과 혼합. 배아 일 13.5에서 자궁 전기 포기에서, 플라스미드를 발현하는 BFP를 사용하여 다른 피질 층을 통해 프로젝션 뉴런의 라벨링을 용이하게한다. 배아일 15.5의 상층 칼약 투영 뉴런을 대상으로 하는 배아일 15.5의 상측에 있는 제2 전기기화는 초기 단계에서 발전하는 하층 프로젝션 뉴런을 대상으로 하지 않는다.
상부 층 표적 뉴런은 특징적인 식목 패턴으로 축삭을 반대반구로 확장합니다. 높은 배율은 상반구 내에서 표적 투영 뉴런의 캘러솔 축삭 내시경 의 보다 상세한 시각화를 가능하게 한다. 이 프로토콜을 시도할 때, 표적화될 세포 집단에 따라 전극의 전극의 위치, 주사할 반구, 및 전극의 위치를 계획하는 것이 중요하다.
이 절차에 따라 전기 화와 같은 모든 방법이 흥미로운 방법입니다. 두 세포 유형에 대해 생체 내에서 가능한 회로 변경을 연구하기 위해 수행될 수 있다. 이 기술을 사용하여 두 개의 다른 표적 세포 사이의 미세한 상호 작용을 연구 할 수 있습니다.
형광 시 냅 스 단백질의 전기 화에 의해 생체 내새로운 과학 정보를 포함.
