저자는 삼목 시나이의 재생 의학 연구소와 겔랑 가족에서 사무엘 Oschin 종합 암 연구소 암 연구 포럼 수상의 지원뿐 아니라 자금을 인정하고 싶습니다. 설명이 프로젝트는 연구 자원, 그랜트 UL1RR033176를위한 국가 센터에 의해 투자 CTSI 코어 바우처의 형태로 지원하고, 번역 상 과학, 그랜트 UL1TR000124 선진화를위한 국가 센터에 지금 하였다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

이 절차는 삼목 시나이 IACUC의 요구 사항에 따라입니다. 조사자는 이전 절차에 기관 IACUC 준수를 확인해야합니다. 모든 도구와 시약은 사용하기 전에 소독해야한다. 1. 도구의 제조, 솔루션 및 DNA 혼합물 <ol><li> 마이크로 피펫 풀러에 100-mm 화재 광택 붕규산 유리 모세관 튜브를 삽입합니다. 약 17.5 mm의 피펫 팁을 형성하는 표준 가중치를 풀 수 있도록 열을 설정합니다. 약 100 μm의 직경의 구멍을 만들 수있는 팁의 시작 부분까지의 거리 약 8~9밀리미터에서 날카로운 수술 가위로 끝을 잘라. </li><li> 주식에게 1 % w / 건조 빠른 그린으로 (20 μm의 주사기 필터를 사용) 필터링 핵산 분해 효소가없는 물을 혼합하여 빠른 그린 솔루션 V를 확인합니다. </li><li> 트리스-EDTA (TE) 버퍼에 희석 고도로 집중되어 정제 된 독소가없는 플라스미드 DNA (예&gt; 3 ㎍ / μL)를 분리합니다. 플라스미드의 추가 원하는 양혼합물에 TE 버퍼에 희석 (w / 빠른 그린의 최종 농도 V 0.1 %를 만드는) 1 % 빠른 녹색 솔루션을 1:10의 비율을 추가합니다. 도입 유전자의 강력한 발현 플라스미드의 0.5 ~ 2.0 ㎍ / ㎕의 최종 농도를 사용합니다. </li></ol> 2. 동물 마취, 피펫 로딩 및 Pial 표면 플라스미드 주입 <ol><li> 5-8 분 (강아지 나이 / 무게에 따라 시간) 얼음에 배치 된 페트리 접시에 배치하여 1-2일 출생 후 마우스에서 저체온 마취를 유도한다. 저체온증이 발가락 곤란 및 / 또는 꼬리에서 반사 운동의 부족에 의해 확인되면, 마우스를 주입 할 준비가 된 것입니다. 통증 반사가 분명하면 얼음에 동물을 다시 넣습니다. 저체온증, 사출 및 일렉트로 절차를 따라 적절한 마취를 유지하는 시간, 그래서 주입 절차 및 일렉트로 합계보다 2 ~ 3 분을. </li><li> 마취하는 동안, 표준 피펫을 사용하여 조심스럽게 피펫 plasmi의 양을 원하는D 참조 파라핀 왁스 필름의 조각에 (0.5 μL)를 주입하는 혼합. 여기서, 플라스미드 믹스 0.5 μL의 총 부피가 주입된다. 다음, 마이크로 인젝터를 사용하여 조심스럽게 튜브 포함 플라스미드 혼합물로 조립 유리 모세관 피펫을 삽입합니다. 이 튜브의 가장자리에 닿지 않도록 확인하여 파손되는 팁을 방지하기 위해 추가 조치를 취. 천천히 이동 다이얼을 다시 전화를 걸어 피펫으로 솔루션을 대기음. 충분한 볼륨 피펫에로드되면, 0 고전력 증폭기의 중립 위치에 압력이 반환 될 때까지 앞으로 전화. </li><li> (2.2부터) 피펫 파라핀 왁스 필름 기준 주입 인근 팁을 배치, 심지어 pial 표면 / 수막 공간을 가득 채우는 적절한 압력을 확인하고 하나를 꺼내 마이크로 인젝터에서 풋 페달을 사용하여 주입을위한 300 ~ 450 고전력 증폭기의 압력을 사용하여 파라핀 왁스 필름에 볼륨. 배출 된 양이 이전에 피펫의 referenc에 달할 때까지 따라 압력을 조절전자 볼륨. </li><li> 팁 평형화되었고 마취 확인되면, 새끼 분사 될 준비가되었다. </li><li> 실험의 목표는 pial 표면 원종 (도 1a)로 아래쪽으로 DNA의 일렉트로 있도록 두개골 및 아래 pial 표면 위에 플라스미드 믹스를 주입하는 것이다. 피질 주사의 경우, 엄지 손가락과 덜 지배적 인 손의 검지 손가락을 사용하여 강아지를 누르십시오. 대뇌 피질 반구와 같은 뛰어난 colliculi 등의 표면 구조는 이러한 구조 (그림 1B)의 손쉬운 표적을 허용, P0과 P2 사이에 볼 수 있습니다. 피질의 지배적 인 손과 대상 원하는 영역 (등 즉, 모터, 체성 감각 등)를 사용하여, 대뇌 동맥에주의하면서 피부와 두개골을지나 피펫을 삽입합니다. (다만 두개골을 관통 한 후 더 저항의 부족에 의해 표시된다) 두개골을지나 끝의 더 침투를 방지해야합니다. </li><li> 혈장을 주입ID 솔루션은 마이크로 인젝터의 풋 페달을 사용하고 있는지 확인이 조직 (그림 2A)에 걸쳐 균등하게 분산합니다. 참고 : 경험적으로 인해 유체 압력에 혈종을 피하면서 플라스미드의 전달을 극대화 방법을 결정하는 것이 매우 중요합니다. 이것은 분사 기간, 각도, 볼륨, 및 혈관 장애를 피하기 위해 정확한 목표 부위를 조정함으로써 행해질 수있다. </li><li> 시도하고 파라핀 종이 또는 플라스틱 파라핀 필름에 이전에 만든 주사에서 테스트 방울의 팁을 배치하여 주사 사이에 건조에서 팁을 유지해야합니다. 이것은 팁, ​​그리고 모순 대금 볼륨의 막힘을 초래할 수 증류 및 결정화 DNA 용액의 팁 축적을 방지하기 위해 필요하다. </li></ol> 3. 일렉트로 <ol><li> 각 펄스 사이에 950 밀리 초 간격으로, 50 밀리 초를 지속, 다섯 펄스에 135-150 V에 Electroporator을 설정합니다. 전도도를 증가시키기 위해 및피부의 연소를 방지, 일렉트로 젤 3 mm 백금 tweezertrodes 커버. 마취를 보장하기 위해이 시점에서 발가락 곤란 꼬리 반사를 확인합니다. 응답하는 경우, 마취 몇 분 동안 얼음에 배치합니다. </li><li> 외피 (뛰어난 둔덕) 주사를, (- 심실 영역에 전기 천공에 사용되는 10-mm 전극 (7)에 비해서) 송아지의 생존을 증가시키는 3 mm 전극 (도 2B)를 사용한다. 전극 방향이 중간 선 (그림 2C)에 45 ~ 60 °의 각도로되도록 눈 아래의 반대편 지역 주변의 주입 영역과 적극적으로 청구 프로브를 통해 전극의 부정 청구 프로브를 놓습니다. </li><li> 곡률에 대한 회계 할 때 전류를 트리거 할 electroporator의 풋 페달을 사용하여 효과적으로 기본 pial 표면의 세포에 DNA를 대상으로, 강아지의 나이와 체중에 따라 3-5 펄스 자리에 tweezertrodes 개최반구의. 주 : 음극 펄스 또는 확대 전극 electroporation하여 면적을 증가하는데 사용될 수 사이에서 주입 영역을 석권 할 수있다. </li><li> 즉시 전기 충격 후, 조심스럽게 새끼에서 젤을 청소하고 약 5 분간 가열 램프 아래에 배치합니다. </li><li> 새끼 심하게 청색증에 의한 일렉트로 후 분에 자연 붉은 핑크 색상을 잃게됩니다. 자신의 새장에 반환하기 전에 자연적인 색깔 및 일반 운동의 개시의 복구를 위해 새끼를 관찰합니다. </li><li> 그녀가 다시 둥지에 새끼를 제공하고이를 정리 시작 여부를 관찰하여 어머니와 재 사회화를 확인합니다. 그녀는 공격적이되면 반드시 새끼 젤의 잔해를 가지고 새끼로 냄새를 전송하는 침구의 일부를 배양 실 수 있습니다. </li></ol> 4. 우수한 Colliculi를 대상으로하기위한 수정 대상 : <ol><li> 인제CT 우수한 피질과 같은 방식으로 둔덕 만이 대상 지역이 단지 후부 및 람다 측면과 대략 중간 선에 자리 잡고 있습니다 (그림 3a 및 3b). 성공적인 주사로, 플라스미드 믹스 자연스럽게 뛰어난 둔덕의 컨투어를 채운다. 주사가 성공적으로되었습니다되면, 동물은 전기 충격에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 일렉트로 : <ol><li> 매우 유사한 방식으로, 우수한 둔덕 주사를 위해, 우수한 둔덕의 표면 영역 (그림 3C)으로 DNA를 운전, 주입 영역과 눈, 코 또는 턱 주위에 적극적으로 청구 프로브를 통해 전극의 부정 청구 프로브를 배치 . 이 경우, 전극 방향은 정중선에 25 ~ 40 °의 각도로있다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

pial 표면 조상의 성공적인 일렉트로의 가장 중요한 측면은 다음과 같습니다 : 1) pial 표면에 플라스미드 믹스의 대상; 2) 주사 부위 혈종의 발생을 회피; 및 3) 중뇌 전기 천공과 연관된 사망률을 회피. 적절하게 pial 표면을 대상으로하는 pial 표면의 침투를 방지하기 위해 두개골의 측정 및주의 천공에 의해 달성된다. 부드럽게 조직 (즉, 빠른 그린이 피부와 결합 조직의 ?...

신경 줄기 및 전구 세포는 포유 동물 CNS 1, 2에 걸쳐 존재한다. 자신의 성격과 뇌와 척수의 심실 지역 주변 배아와 성인 새싹 영역의 속성을 광범위하게 지난 십 1-3에 설명되어있다. 많은 부분에서, 이는 같은 floxed 대립 유전자 또는 4를 추적 레트로 바이러스 계통의 신경계 특정 크레 재결합으로 더욱 정확한 유전 도구의 개발에있다. 그러나 한 전구 지역 - pial 표면 전구 최근에 어떤 세부 5-7에 설명 된 영역 - 가지고 기다리고 종합 시험. 뇌 pial 표면은 뇌의 표면 및 주변 수막 8 간의 인터페이스로 정의된다. 나중에 개발, neuroepithelial하고, 동안, 반경 폐해 최종 피트는이 표면 9, 10에 연결합니다. 전나무의 일부인간의 두뇌와 신경 세포의 유사 분열의 많은 성 신경 세포는이 지역 11에서 관찰된다. 나중에 배아 신경 동안, 대뇌 피질의 interneurons는 중간 영역과 subventricular 영역 12 ~ 14에서의 이주 경로에 추가하여 pial 지역을 통과하는 것으로 알려져있다. 이 기간 동안, 줄기 세포는이 영역에서 배양 될 수 있고 신경 및 gliogenesis 5의 활성 부위로 나타난다. 성인의 뇌에서,의 interneurons는 저산소 도전 7 다음 pial 표면 조상에서 태어난 될 수 있음을보고하고있다. 그러나, 배아 및 출생 후의 개발 기간 동안 genensis하는 자신에 대한이 지역의 기여로 인해 특히이 지역 6 조사의 어려움으로 일부 모호한 남아있다. 우수한 둔덕과 대뇌 피질에, 표면 (또는 피질 층 I)의 interneurons는 기본 흥분성 신경 세포 집단의 회로 출력을 조절하고, 따라서 signific를 기여할 수있다이러한 구조의 기능에 antly. 특히, 1 층의 interneurons는 대뇌 피질의 열 (15, 16)의 표면과 깊은 층에 자신의 광범위한 연결 주어진 대뇌 피질의 상위 계층에서 뉴런의 발화를 조절하는 주요 위치에 있습니다. 유사한 방식으로, 가로의 interneurons는 비교적 넓은 면적에 걸쳐 피질 및 망막 섬유 프로젝트에서 흥분성 입력을 수신하고 원격 시각적 자극 (17, 18)에 응답 신경원 인구의 억제를 중재하는 추측된다. 또한, 그들의 형태는 현상 카메라 시스템 (19)의 패터닝 표면파 활동 전위 역할을 매우 적합하다. 흥미롭게도, interneuron의 개발과 성숙은 출생 후 큰 정도 발생합니다. 또한,이 숙성 공정은 신경 활성에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다 따라서 회로 기능 (20, 21)의 평생 결과와 발달 가소성 기판이다. 특히, N오 발기인은 특히 transgenically이 세포를 표적으로 할 수있는 기술되어있다. 분할 전구 세포가 레트로 바이러스 7 대상이 될 수 있지만 바이러스의 생산 시간이 소요됩니다 세포 전달에 필요한 높은 역가를 산출하는 기술이 필요합니다. 이 신경 전구 세포 4, 22, 23의 신호 전달 경로의 신속하고 효율적인 유전자 심문을 허용으로 일렉트로는 신경 발달의 연구에서 르네상스를 주도하고있다. 전기 천공은 일방향 심실 4, 22, 23를 둘러싸고 증식 전구 세포로 DNA를 구동하는 헤드의 외부로의 전기 펄스의 전달 다음에 플라스미드 DNA의 주입하는 것을 포함한다. 일렉트로는 플라스미드 형질 전환 유전자 (24)의 식에 대한 세포주기의 M 단계를 통해 세포의 이동을 필요로 나타납니다. 구체적으로는 발견되었습니다 만이플라스미드의 일렉트로의 8 시간 이내 M 단계를 통과 세포는 심실 벽 (24)의 ~ 160 μm의 내의 모든 세포에 자신의 효과적인 전달에도 불구하고 도입 유전자를 표현하는 것입니다. 그것은 핵 permeabilization를 일으키는 화학 물질이 포스트 유사 분열 세포 (25)에 플라스미드의 발현을 유도 할 수있는이, 에피 솜 플라스미드의 핵 액세스를 허용 핵 봉투 고장의 필요성 때문이라고 추측된다. 원래 배아 22에 사용, 일렉트로는 훨씬 나중에 26, 27 출생 후의 뇌에 사용하기 위해 적응했다. 최근에, 우리는 pial 표면의 전구 세포 (6)의 유전자 조작에 사용하기 위해 전기 충격을 적응. 또한,이 방법을 사용하여 우리는 조상의 두 가지 계통이 지역 - interneuronal 및 성상 세포 6에 분명히 있다는 것을 보여 주었다. 이 프로토콜은 심문이 세포를 대상으로, 간단한 신속하고 강력한 방법의 자세한 사항이러한 세포의 조절 메커니즘 개발.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Item Name</td>
			<td style="width:269px;">Vendor</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fire Polished Borosilicate Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td>P-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, Inc.</td>
			<td>F7528</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 Generator</td>
			<td><a name="RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</a></td>
			<td>45-0052</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mm Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td>
			<td>45-0487</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SignaGel Electrode Gel</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>70315-025</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris-EDTA Buffer, pH 8.0</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>11-01-02-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infrared Heat Lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36547-009</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal pial surface electroporation

지난 몇 년 동안 pial 표면은 손상 후를 포함하여, 배아 산기 및 성인 신경과 gliogenesis 동안 중요성을 싹 틈새로 확인되었습니다. 그러나 유전이 전구 인구를 심문하고 그들의 계보를 추적하는 방법은 특이 또는 시간 바이러스의 생산을 소비의 부족으로 제한했다. 따라서,이 지역의 발전은이 지역의 연구 단지 소수의 상대적으로 느리다. 일렉트로은 배아의 신경 줄기 세포의 특성을 연구하기 년 넘게 사용하고, 최근에는 출생 후 뇌의되었습니다. 여기에 우리가 적응 일렉트로 방식에 따라 pial 표면 조상의 유전자 조작에 대한 효율적이고 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. Pial 표면 일렉트로 따라서 이러한 세포 연구를위한 시간 절약과 경제적 인 접근 방식을 나타내는 이러한 조상의 손쉬운 유전자 표시 및 조작 할 수 있습니다.

세포 - 주로 조상 -이나 pial 표면 6 근처에있는 플라스미드 DNA의 발현에 Pial 표면 일렉트로 결과. 보다 구체적으로, 전극의 배향이 플라스미드 움직임과 후속 식의 방향을 지시하는 중요하다. 따라서, 이중 전극 구성에서, 플라스미드는 부정과 양극 사이에 거의 직선 벡터에 관한 것이다. 음극은 주사 부위 위에 배치되고 양극이 음극에 복부 롭다 따라서, 플라스미드 pial 표면으로 강제한다....

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Neonatal Pial Surface Electroporation

pial 표면은 증가 주목을 받고 CNS에서 독특한 전구 영역입니다. 여기서, 세부 사항보기 개질 전기 천공 법을 사용하여이 시조 존의 급격한 유전자 조작 방법을 우리. 이 절차는 세포 계통 및 세포 분화에 관련된 신호 전달 경로의 세포 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다와 딸 세포의 운명과 특성을 설명하기 위하여.

신생아 Pial 표면 에레

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K 조회수.  Cedars-Sinai Medical Center.  pial 표면은 증가 주목을 받고 CNS에서 독특한 전구 영역입니다. 여기서, 세부 사항보기 개질 전기 천공 법을 사용하여이 시조 존의 급격한 유전자 조작 방법을 우리. 이 절차는 세포 계통 및 세포 분화에 관련된 신호 전달 경로의 세포 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다와 딸 세포의 운명과 특성을 설명하기 위하여. 

비디오: Neonatal Pial Surface Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

신생아 Subventricular 지대 Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

새로운 방법으로 자유롭게 움직이는 신생아 쥐의 뇌파 기록

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...