저자는 기술 지원을위한 박사 Gongpu 조 및 Danxia 애 감사드립니다. 우리는 DRS 감사합니다. 자신의 이미지 처리 소프트웨어를 공유하기위한 에드워드 Egelman와 니코 Grigorieff. 우리는 또한 구조 cryo - EM 시설 생물학과 의학의 피츠버그 학교의 대학에서 베오울프 클러스터와 그리드를 지원하는 직원을 인정합니다. 이 작품은 GM082251와 GM085043 지원했다.

1. 냉동 수산화 EM 표본 준비 HIV - 1 capsid 단백질 (CA)이 어셈블리 9 단 cryo - EM 이미지에 강한 배경 소음을 기여 높은 소금 (1M NaCl) 버퍼에 안정되기 때문에, 우리는 transiently 소금을 줄이기 위해 빠른 희석 다시 사이드 모래 바닥 방법을 사용 농축 냉동 수산화 EM 격자를 준비할 때. <ol><li> 25초에 대한 25mA 이하 200 메쉬 R2 / 1 Quantifoil 구리 격자의 글로우 방전은 탄소 측면. </li><li> 80 % 환경 챔버에서 습도, 집에서 만든 수동 중력 플런저를 데리고 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 사용합니다. </li><li> 페이 Vitrobot 플러져 듀어, 액체 질소를 사용하여 냉각 액체 에탄에서. 수동 중력 플런저에 뛰어들다 - 냉동 듀어를 탑재합니다. </li><li> 포셉에 장착할 수있는 격자의 탄소쪽으로 preassembled CA 솔루션 2.5 μl를 적용하고, 당신을 멀리 직면하고있는 격자의 탄소 사이드와 플런저에 포셉를로드합니다. </li><li> 그리드의 뒷면에 낮은 소금 희석 버퍼 (100 MM NaCl) 3 μl를 추가하고 즉시 필터 종이와 그리드의 뒷면에 얼룩. 그리드의 전체 배면은 필터 용지를 제거하기 전에, 약 6 초 동안 필터 종이와 긴밀한 연락을해야합니다. 즉시 필터 용지를 제거한 후 액체 에탄으로 격자를 뛰어들다. </li><li> 플런저의 집게를 제거하고 신속하게 그리드 스토리지 상자에 격자를 전송합니다. </li></ol> 2. CA 관형 어셈블리 Cryo - 전자 현미경 <ol><li> 200kv에서 황비홍 폴라라 G2 전자 현미경 운영에 냉동 수산화 격자를로드하고 Gatan 4Kx4K CCD 카메라가 장착되어. </li><li> ~ 200x의 확대에 낮은 선량 - 검색 모드에서와 복용 &lt;0.001e과 함께 - / 2, 스크린 적합한 얼음 무대 파일에 이러한 영역의 위치를 저장과 영역에 대한 전체 그리드. </li><li> 낮은 선량 - 검색 모드에서 3,900 X의 확대에 저장된 위치와 추가 화면이 영역을 회수. 데이터 수집을 위해 구멍을 통해 잘 구분된 긴 튜브를 포함하는 얼음의 유니폼, 얇은 레이어로 영역을 선택합니다. 두 번째 단계 파일에서 이러한 영역의 위치를​​ 저장합니다. </li><li> 59,000 X, 삽입된 페이지 100 μm의 목표 구멍의 확대에 노출 모드로 전환하고, ~ 15 E의 복용에 대한 객관적 stigmatism 및 빔 강도를 조정 - 노출 당 / A 2. </li><li> 낮은 복용량 - 검색 모드로 돌아갑니다, 저장된 위치로 이동하고 CCD 카메라를 사용하여 좋은 튜브를 파악하고 중심. 초점 모드로 전환, 초점을 조정하고, defocus 값을 설정, 일반적으로 사이 0.5-2.5 μm의. 노출 모드로 전환, 15 E의 복용량을 위해, 0.3-0.5 초 노출 시간을 설정 - / 2, 그리고 이미지를 수집합니다. 이미지는 접시 카메라 수집하고, 노출이 촬영되기 전에 필름은 10 초 동안 정착을 허용해야합니다. </li><li> 다음 저장된 위치로 이동하고 더 많은 이미지를 수집하기 위해 5 단계를 반복합니다. </li><li> 영화 12 분 동안 풀 가동 D19에서 개발하고 6.35 μm의의 픽셀 크기 니콘 슈퍼 coolscan 9000 ED 스캐너를 사용하여 디지털됩니다. 이미지 파일의 형식은 TIFF 있습니다. </li></ol> 3. 나선형의 색인 나선형 개체는 두 개의 매개 변수에 의해 색인을 생성할 수 있습니다 베셀 주문, N, 및 레이어 줄 번호, 난 있습니다. 로 (N, L)에 의해 특징 푸리에 변환의 각 계층 라인, 2D 격자의 표기법을 사용하여, (H, K)에 의해 인덱스를 표시된 나선형 오브젝트의 표면 격자에 라인의 집합에 해당합니다. 모든 (H, K)의 경우, (N 홍콩, 난 HK) 레이어 라인의 N과 나는 가치 두 가지 기본 벡터 (N 10 리터 10)와 (N 01, 전 01)의 선형 ​​조합입니다 두 주요 레이어 라인 (1, 0)과 (0, 1). 리터는 푸리에 변환의 Z 축을 따라 측정의 레이어 라인 높이에서 구할 수 있습니다. N의 값은 다음 방정식 10을 사용 예상 수 πRr ≈ J N ≈ 1.1 | N | -0.9 .....................( 1) J n은 N의 번째 레이어 라인의 강도를 결정하는 베셀 함수이고, R은 나선형 객체의 반경이고, R은 레이어 라인의 최대 진폭의 반경이다. 레이어 라인 번호, 전, 선택 규칙 11 N과 관련이 L = TN + 음 ....................( 2) T와 U는 나선형의 상수 어디. 특정 나선형 들어, (또는 매우 밀접하게) 정확히에서 T C U 정확히 단위가있을 수 있습니다omplete이 바뀝니다. <ol><li> EMAN의 프로그램 12 helixboxer 및 MRC 포맷으로 이미지를 저장을 사용하여 균일한 직경이 비교적 직선과 긴 튜브 밖으로 상자. </li><li> MRC 패키지 13 등 &#39;imgccf&#39;와 같은 교차 상관 기반 프로그램을 사용하여 나선형 반복 거리, C를,,, 확인하십시오. </li><li> 반복 거리, C의 핵심입니다 새로운 상자 길이와 푸리에 변환을 계산합니다. </li><li> 두 가지 기본적인 표면 격자 벡터 (1,0)을 정의하고 (0,1) 2 주요 레이어 라인을 선택합니다. </li><li> 튜브의 반경, R 및 푸리에 변환, 전 10, R 10, 각각 01 리터 R 01, (그림 1)에서 두 개의 주요 레이어 라인의 높이와 반경을 측정합니다. </li><li> N 10 방정식 (1)에 따라 N 01 계산. </li><li> N 값은 추정하기 때문에, N 10 N 01의 몇 가지 조합이 프로그램 패키지 IHRSR를 사용하여 올바른 나선형 대칭을 찾아 (단계 4.2 참조) 나중 단계에서 테스트합니다. </li><li> subunits (Δφ)과 한 별 나선의 축 리즈 (Δz) (N = 1) 사이의 순환 두 개의 현실 번호에 의해 설명하는 나사 대칭을 계산합니다. 리터 10 리터 01, N 10, N 01 가치를 감안할 때, U와 t는 m 값의 범위 (예를 들어, -50 &lt;m &lt;50) 선택 규칙에 따라. 테스트하여 구할 수 있습니다 마지막으로, Δφ 및 Δz이 사용하는 계산됩니다 Δφ = 360t / U 및 Δz = C / U. </li></ol> 4. 입체 재건 <ol><li> 입자 세분화 <ol><li> EMAN 패키지 프로그램입니다 그래픽 프로그램 복서를 사용, 나선형 입자를 포함하는 현미경을 엽니다. </li><li> 중복 세그먼트로 나선형 입자를 잘라. 복서의 제어판에서 헬릭스 모드를 선택하고 복싱에 대한 매개 변수를 설정 상자의 크기는 입자의 직경과 &#39;OLAP&#39;이 상자 크기의 ~ 90 %되어야합니다에 대한 값보다 커야합니다. </li><li> 나선형 입자의 양쪽 끝에 왼쪽 버튼으로 클릭한 후, 복서가 자동으로 나선형의 길이를 따라 입자 박스 시리즈를 생성합니다. </li><li> 박스 세그먼트뿐만 아니라 자신의 좌표를 저장합니다. </li></ol></li><li> IHRSR 프로그램을 사용하여 초기 3 차원 재구성 <ol><li> cryo - EM 이미지의 명암을 반전하고 반복 헬리컬 실제 공간 재구성 방법 (IHRSR)로 처리하기 전에 14 (옵션) 필터링 낮은 패스를 적용합니다. </li><li> &quot;생성기&quot;를 입력하여 IHRSR 프로그램의 그래픽 인터페이스를 엽니다. 이름과 경로 스택의 스택에서 이미지의 숫자를 포함하여 박스 입자 스택에 대한 모든 정보와 그래픽 인터페이스를 제공, 대칭 매개 변수의 값은 등 재구성 스크립트를 만들려면 버튼 &quot;마침&quot;을 클릭 b25.spi. </li><li> 초기 참조로 고체 또는 속이 빈 실린더를 사용하여 보통 몇 사이클 후에 발생하는 정의 나사 대칭에 변화가 없을 때까지 사이클로 프로 시저를 허용합니다. 오른쪽 나선형 대칭이 안정적으로 수렴 재건을 줘야한다. 지난주기에서 생성된 재건은 더욱 정제에 대한 최초의 레퍼런스로 사용됩니다. IHRSR 스파이더 프로그램을 사용하여 3 차원 재구성을 수행합니다. </li></ol></li><li> 반복 상세 15 재건은 IHRSR에 의해 생성 3D 재구성은 현재 추가적인 정제를위한 초기 참조로 사용됩니다. 상세 동안 나선형 대칭은 Δφ 및 IHRSR 절차에서 결정됩니다 Δz에서 고정됩니다. <ol><li> 프로그램 CTFFIND3 및 CTFTILT 16을 사용하여 현미경에서 defocus 및 난시의 현재를 확인합니다. </li><li> 스파이더 프로그램 17을 사용하여 CTF에 의해 입자 세그먼트를 곱하면됩니다. 거미 스위트에서 FT를 칭했다 작업은 2D 이미지의 푸리에 변환 (FFT)을 계산하는 데 사용됩니다. 그 후, FFT는 거미 제품군 내에서 MU를 칭했다 작업을 사용하여 이전 단계에서 결정, CTF 값을 곱한 것입니다. 얻은 값은 다음 역 거미 작업을 사용하여 실제 공간에 새로운 이미지 (CTF - 수정)을 양식으로 변형, FT 다시합니다. </li><li> 다중 참조 정렬을 사용하여 CTF - 수정된 이미지 참조 볼륨 계획을 비교하여 프로젝션 검색을 수행합니다. 아웃 - 오브 - 비행기의 기울기 각도의 편차는 + / -10 °로 제한하고 1 °의 단계로 샘플링됩니다. 각 세그먼트의 정렬 매개 변수에 대한 이러한 높은 상관 계수와 같은 제약, 0 ° 또는 180 °, 그리고 X - 교대 제한 근처에 - 평면 각도를 소개합니다. 제약을 만족 재건에만 세그먼트에 포함합니다. </li><li> 각 상세 검색 사이클을 반복하면, 3D 재구성은 CTF 이상 합계로 다시 투영을 사용하여 생성하고 나누어져 있습니다2. </li><li> symmetrized 볼륨을 생성하는 나선형 대칭을 부과. 새로운 3D 재건의 해상도에서 더 이상 개선이 발생 없을 때 반복 상세가 종료됩니다. </li><li> 이미지 프로세싱 패키지 거미는 상세 검색 단계를 대부분 사용됩니다. 작업 일련의 작업과 매개 변수 값의 시퀀스를 포함하는 사용자가 만든 배치 제어 파일입니다 스파이더 스크립트에 의해 제어됩니다. 최종 재건은 거미의 제품군에 프로그램을 사용하여 계산됩니다. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 : 단일 HIV - 1 CA A92E 튜브 (그림 1A)은 박스 나오려고했는데 그 푸리에 변환 (그림의 1B)는 나선형 색인 계산되었다. 레이어 라인 (1, 0)과 (0, 1), 전 10 = 28 리터 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. 211.57Å의 튜브 반경을 감안할 때, 우리는 N 10 =- 12 N 01 approximated = 11 (여기서, handedness가 미리 정해진되었다). 5195.48Å의 반복 거리로 튜브의 나사 대칭이 Δz과 같이 결정되었습니다 = 6.8093Å, Δφ = 328.88 °. Δz과 Δφ는 7.1321Å과 328.86에 세련된했다 ° IHRSR (그림 2A) 및 초기 재건이 그림에 표시됩니다를 사용하여. 2B. 최종 재건 (그림 3), 상세 검색을 반복 후 IHRSR (그림 2B)로 계산 초기 모델에서 상당히 밀도지도를 향상되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. HIV - 1 CA 헬리컬 튜브의 색인을 생성합니다. (A) 하나의 HIV - 1 CA A92E 관 이미지. 스케일 바, 30 NM. (B) 푸리에 (A)에 표시된 튜브의 변환. 나선형 지표는 (N 10 =- 12 N 01 = 11) 표시된 있습니다. 23A 해상도에서 레이어 라인에 애로를 가리 킵니다. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. IHRSR를 사용하여 초기 재건. 각 반복주기 (A) 나사 대칭 결정. 10 상세 검색 사이클을 반복 후 Δφ과 Δz은 초기 값부터, 안정적인 값으로 수렴. (B) 10 일 이후 최초 3D 밀도지도 사이클을 반복. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 반복 상세 후 3D 밀도지도. (AC) CA 튜브의 밀도지도는 세 직교 조각으로 표시됩니다 튜브 축에 평행하고 튜브 축 (B)에 수직, 표면 (A) 가까이 및 병렬 튜브 축 (C)와 통해 . 스케일 바, 10 NM. (D) 3D 밀도지도의 표면 렌더링 100 % 볼륨을 둘러싸고 1.8s에서 contoured.

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	<li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice.">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Purple+Membrane+from+Halobacterium-Halobium+-+Analysis+of+X-Ray-Diffraction+Pattern.">Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern.</a> J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method:+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers.">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).</li><li>Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-Actin+Is+a+Helix+with+a+Random+Variable+Twist.">F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist.</a> Nature. 298, 131-135 (1982).</li><li>Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+model+of+the+microtubule.">High-resolution model of the microtubule.</a> Cell. 96, 79-88 (1999).</li><li>Jimenez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structure+of+an+SH3+amyloid+fibril+and+model+of+the+molecular+packing.">Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing.</a> Embo J. 18, 815-821 (1999).</li><li>Butler, P. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+particle+of+tobacco+mosaic+virus+from+RNA+and+disks+of+protein.">Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein.</a> Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).</li><li>Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+core+and+central+channel+of+bacterial+flagella.">Structure of the core and central channel of bacterial flagella.</a> Nature. 342, 648-654 (1989).</li><li>Byeon, I. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Convergence+between+Cryo-EM+and+NMR+Reveals+Intersubunit+Interactions+Critical+for+HIV-1+Capsid+Function.">Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function.</a> Cell. 139, 780-790 (2009).</li><li>Toyoshima, C., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+acetylcholine+receptor+by+cryoelectron+microscopy+and+helical+image+reconstruction.">Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction.</a> J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).</li><li>Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+I.+Indexing+of+diffraction+patterns.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns.</a> Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Yonekura, K., Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+IV.+Distortion+correction+and+its+combined+application+with+real-space+averaging+and+solvent+flattening.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening.</a> Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).</li><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+electron+cryo-microscopy:+towards+atomic+resolution.">Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.</a> Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).</li><li>Sachse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens:+A+fresh+look+at+Tobacco+Mosaic+Virus.">High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus.</a> J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+Processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+dynamin+in+the+constricted+state.">Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state.</a> Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 나선형 오브젝트의 3D 구조를 얻기 위해 직접적인 접근을 제공하는 프로토콜의 집합을 제시한다. 설명한 절차를 사용하여, 우리는 하나의 튜브 이미지 (176 세그먼트)에서 HIV - 1 capsid 어셈블리의 3D 구조를 인수했다. 높은 해상도의 구조는 더 많은 이미지 데이터를 포함하여 얻을 수 있습니다. 최적의 데이터 수집 및 분석을위한 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다 첫 번째는 cryo - EM 표본의 준비 기간 동안, 샘플 솔루션은 표본의 크기보다 약간 두껍 솔루션의 유니폼, 얇은 레이어를 떠나 멀리 blotted해야합니다. 예제를 얼룩하는 여러 가지 방법이 있습니다. 특히 백 측면에서, 한 측면에서 모래 바닥 세균 세포와 같은 HIV - 1 CA 어셈블리로 관형 표본, 들어 가장 적합합니다. 둘째, 나선형의 handedness이가 나선형 색인을 생성하거나 재구성하여 수행할 수 없으므로, 결정되어야합니다. 일반적인 연습은 로타리가 handedness을 결정하는 18 붙인 다음 냉동 에칭을 사용하는 것입니다. 밀도지도의 해상도가 충분히 높은 경우 Handedness 또한 이후 재건을 결정 수 있으며 정확한 handedness를 가정하면 개별 구성 요소의 3D 모델은 원자 밀도지도에 잘 맞지도한다. 그렇지 않으면, 반대 handedness을 가정해야합니다. 셋째, 위너 필터는 잡음 증폭을 줄이기 위해, 위상과 진폭 보정 모두, 이미지 처리하는 동안 사용해야합니다. 하나의 이미지에서 CTF는 항상 제로 횡단을 가지고 있기 때문에, 상호 공간에서 정보의 일부가 손실됩니다. 따라서 다른 defocus 값에서 3D 재구성, 각각의 몇 군데에 포함 여러 투영 데이터 집합이 필요합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 출처 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 100X 글로우 방전 장치 </td><td> 100X 글로우 방전 장치 </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai 폴라라 전계 방출 총으로 F30 현미경 </td><td> 황비홍, 힐스 보로, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4K X 4K CCD 카메라 </td><td> Gatan, 플레즌턴, CA </td><td></td></tr><tr><td> 플런지 - 냉동 장치 </td><td></td><td> 집에서 만든 수동 중력 플런저 </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 메쉬 holely - 탄소 구리 격자 </td><td> Quantifoil 마이크로 도구, 예나, 독일 </td><td></td></tr><tr><td> EM 소프트웨어 EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM 소프트웨어 IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> 에드워드 H. Egelman에서 제공 프로그램 </td></tr><tr><td> EM 소프트웨어 스파이더 </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC 기반 헬리컬 처리 소프트웨어 </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> 코지 요네쿠라에서 제공 프로그램 </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT과 실제 공간 헬리컬 상세 검색 소프트웨어 </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structure of hiv-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction

이미지 프로세싱과 결합 Cryo - 전자 현미경 (cryo - EM)는, macromolecular 단백질 단지와 어셈블리의 구조 결정에 대한 점점 더 강력한 도구입니다. 사실, 단일 입자 전자 현미경 1 (2D) 2 차원은 전자 crystallography 2 상대적으로 일상적인 방법론과 구조의 많은되고있는 이러한 방법을 사용하여 해결했습니다. 동시에, 이미지 처리 및 헬리컬 객체의 세 차원 (3D) 재건은 빠르게 특히 나선형 대칭과 함께 단일 입자 분석 도구를 사용하여 나선형 실제 공간 재건 (IHRSR) 방법 3을 반복, 발전시켜 왔습니다. 나선형 엔티티의 3D 밀도지도가 하나의 투영에서 획득 할 수 있기 때문에 대부분의 생물 학적 실체가 filamentous 또는 헬리컬 굴지의 필라멘트 4, microtubules 5, 아밀로이드 섬유 6, 담배 모자이크 바이러스 7, 박테리아 flagella 8 포함한 양식, 그리고에 기능 IHRSR 방식이 아닌 나선형 오브젝트의 3D 재건에 필요한 다양한 이미지, 등 유연하고 무질서 나선형 어셈블리의 구조 분석에 비해 이미지는 지금 실현합니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 cryo - EM으로 cryo - EM 시료 준비, 저용량 데이터 수집을위한 프로토콜을 포함 헬리컬 단백질 어셈블리의 3D 밀도지도 (HIV - 1 capsid 9의 예입니다), 인덱싱를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다 헬리컬 회절 패턴, 그리고 IHRSR를 사용하여 이미지 프로세싱 및 3D 재건. 다른 기술에 비해, cryo - EM은 근처 기본 조건 하에서 최적의 표본 보존을 제공합니다. 샘플은 빠른 냉동으로 유리 얼음의 얇은 레이어에 포함된, 그리고 방사선 피해를 최소화하기 위해 저용량 조건 하에서 액체 질소 온도에서 전자 현미경으로 몇 군데 있습니다. 샘플 이미지는 낮은 신호 및 기록 micrographs 낮은 콘트라스트의 비용으로 근처 기본 조건 하에서 얻을 수 있습니다. 다행히, 나선형 재구성하는 과정은 크게 헬리컬 회절 패턴을 색인을 제외하고, 자동되었습니다. 여기, 우리는 인덱스 헬리컬 구조 방식을 설명하고 디지털 micrographs, 3D 나선형 재건을위한 필수적인 단계에서 나선형 symmetries을 (헬리컬 매개 변수)를 결정합니다. 간단히, 우리는 IHRSR 방법을 적용하여 초기 3D 밀도지도를 구하십시오. 이 초기지도는 다음 반복함으로써 자신의 자유도를 조절, 각 세그먼트의 정렬 매개 변수에 대한 제약을 도입하여 세련됩니다. 더 개선은 전자 현미경 (진폭 및 위상 보정)의 대비 전송 기능 (CTF)을 수정하여하고 어셈블리의 나선형 대칭을 최적화하여 이루어진다.

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Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

이 문서는 cryo - 전자 현미경을 사용하여 나선형으로 조립 분자의 3 차원 (3D) 구조를 구하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 반복 나선형 실제 공간 재건 방법에 의해 밀도지도를 달성하기위한 세부적인 3D 재건 절차를 설명하기 위해 HIV - 1 capsid 어셈블리를 사용합니다.

Cryo - 전자 현미경에 의해 HIV - 1 Capsid 어셈블리의 구조와 반복 나선형 실제 공간 재건

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K 조회수.  University of Pittsburgh School of Medicine. 이 문서는 cryo - 전자 현미경을 사용하여 나선형으로 조립 분자의 3 차원 (3D) 구조를 구하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 반복 나선형 실제 공간 재건 방법에 의해 밀도지도를 달성하기위한 세부적인 3D 재건 절차를 설명하기 위해 HIV - 1 capsid 어셈블리를 사용합니다.

비디오: Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

하여 HIV - 1 V3 루프 크라운 R2 시퀀스 Immunologically 관련 동적 차 구조 기능의 평가 순이 론적 접는

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

연구

면역학 및 감염병학

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

전자 레인지 전송 전자 현미경으로 식물 바이러스 질병의 신속한 진단을 도와

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Genotypic 접근 방법을 사용하여 시퀀스 분석에 의한 HIV-1 Coreceptor 사용 (Tropism)의 예측

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1 코어의 시험 관내 Uncoating에서

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

측정<em&gt; 체외</em&gt; HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...