단일 입자 저온-EM 분석은 막 단백질, 아밀로이드 피브릴, 핵산 결합 단백질 및 바이러스를 포함한 광범위한 표본에 적용되는 구조 생물학자의 툴박스에서 일상적인 기술이 되었습니다. 샘플 준비가 완료되고 현미경에 로드된 그리드가 완료되면 Astbury 바이오 구조 연구소 및 eBIC와 같은 많은 극저온-EM 시설에서 원격으로 데이터 수집을 수행할 수 있습니다. 성공적인 구조 결정에 대한 주요 장벽은 종종 이 프로세스를 통해 여러 번 반복이 필요한 샘플 준비 및 그리드 스크리닝 단계에 있습니다.
여기에서 원격 그리드 스크리닝 및 단일 파티클 데이터 수집을 시연합니다. 현미경 사용자 인터페이스의 자동 로더 탭에서 화살표를 사용하여 옵션 대화 상자를 탭하고 인벤토리 버튼을 누릅니다. 이렇게 하면 카세트의 각 위치를 순차적으로 검사하여 카트리지가 있는지 확인합니다.
인벤토리는 각 슬롯에서 순차적으로 실행됩니다. 점유된 모든 슬롯이 매핑되면 인벤토리가 중지됩니다. 현미경 열로 전송할 그리드를 강조 표시하고 부하를 클릭합니다.
그리드가 성공적으로 스테이지에 로드되면 슬롯 레이블이 파란색에서 노란색으로 바뀝니다. 그리드를 검사하려면 EPU 소프트웨어를 엽니다. 준비 페이지에서 획득 광학 및 설정을 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 아틀라스 사전 설정을 선택합니다.
적절한 빔 설정 사전 설정을 선택하고 매개 변수를 현미경으로 푸시하도록 설정된 프레스를 선택합니다. 컬럼 밸브를 열고 독감 화면을 삽입하려면 누릅니다. 빔이 표시되고 충분히 확산되고 검출기를 덮을 중앙에 있는지 확인합니다.
필요한 경우 조이스틱 또는 가상 손 패널을 사용하여 그리드의 더 얇은 영역으로 이동하여 X및 Y.Lift에서 단계 의 움직임을 제어하고 EPU의 미리 보기 버튼을 사용하여 이미지를 찍습니다. EPU에서 아틀라스 페이지로 이동하여 새 세션을 누릅니다. MRC 이미지 형식을 선택하고 스크리닝 세션을 저장하기 위한 적절한 폴더 이름과 위치를 입력한 다음 적용을 클릭합니다.
왼쪽의 메뉴에서 스크리닝을 선택합니다. 각 그리드 옆의 확인란을 선택하여 아틀라스 몽타주를 획득한 다음 EPU에서 스크리닝 세션을 시작합니다. 각 검사된 그리드에 대해 아틀라스가 획득되고 사용 가능한 그리드 사각형이 완료되면 나열됩니다.
각 아틀라스는 상영 페이지에서 강조 표시하여 볼 수 있습니다. 완료되면 수집된 아틀라스를 검토하고 더 높은 배율로 샘플 품질을 평가하는 데 적합한 그리드를 식별합니다. EPU 스크리닝 메뉴에서 선택한 그리드를 강조 표시하고 로드 샘플을 클릭합니다.
아틀라스 스크리닝 메뉴에서 현재 로드된 그리드를 선택하고 그리드 이미지에서 원하는 위치를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 여기에서 이동 단계를 선택하여 채워진 구멍이 포함된 그리드 사각형으로 스테이지를 이동합니다. EPU 준비 페이지로 돌아가 그리드 정사각형 사전 설정을 선택합니다. EPU 자동 기능 페이지를 열고 그리드 정사각형 사전 설정으로 스테이지 기울기로 자동 유중심을 실행하여 샘플을 동심 높이로 이동합니다.
EPU 준비에서 새 그리드 사각형 미리 보기 이미지를 가져 가라. 다른 얼음 두께를 나타내는 다른 구멍에 걸쳐 회색 값을 유의하십시오. 오른쪽 단추를 클릭하고 스테이지를 이동하여 구멍을 통해 스테이지를 이동합니다.
구멍 또는 유중심 높이 사전 설정을 선택한 다음 미리 보기를 클릭합니다. 데이터 수집 사전 설정을 선택하고 파티클을 쉽게 식별할 수 있는 배율을 설정합니다. 디포커스 오프셋을 음수 3~5마이크로미터로 설정합니다.
그리드 전체의 입자 분포, 방향 및 오염에 대한 다양한 얼음 두께를 재평가하기 위해 단계를 반복합니다. 현미경 가용성에 따라 다른 사이트를 포함하여 향후 수집을 위해 현미경에서 데이터 수집 또는 그리드로 직접 계속 제거할 수 있습니다. 아틀라스 설정을 설정하고 아틀라스를 획득하기 위해 그리드를 선택하여 스크리닝에서 사용할 수 없는 경우 아틀라스를 수집합니다.
아틀라스를 획득하고 그리드 위치를 클릭하여 출력을 확인합니다. 아틀라스가 완료되면 프로젝트의 실험적 요구에 따라 각 빔 설정 사전 설정을 정의합니다. 이미지 시프트 교정을 수행합니다.
EPU 페이지 세션 설정을 선택한 다음 기본 설정에서 새 세션 또는 새 세션을 선택하여 EPU 세션을 설정합니다. 새 세션을 선택한 후 이전 설정을 사용할 수 있는 옵션을 제공하는 팝업이 나타납니다. 설정은 이전 세션에서 현재 EPU 세션으로 자동으로 로드됩니다.
또는 기본 설정에서 새 를 선택하고 저장된 기본 설정이 있는 파일을 선택하여 이 정보를 현재 EPU에 미리 로드합니다. 세션 이름을 유익한 것으로 채웁니다. 유형에서 설명서를 선택합니다.
획득 모드의 경우 수차 없는 이미지 시프트 컬렉션을 사용할 수 있고 원하는 경우 정확한 구멍 중심을 선택하거나 더 빠른 수집을 선택합니다. 원하는 이미지 형식을 선택한 다음 저장소 폴더를 선택하고 EPU는 세션 이름으로 디렉토리를 만듭니다. 그리드 구멍 간격이 사용되는 지 에 따라 적절한 그리드를 선택하고 적용을 누릅니다.
초기 그리드 정사각형을 선택하고 획득 템플릿을 설정합니다. 정사각형 선택으로 이동합니다. 모든 사각형이 녹색인 경우 왼쪽 상단의 모든 선택 취소를 클릭합니다.
오른쪽 단추를 클릭한 다음 열린 타일을 선택하여 타일을 엽니다. 선택 선택을 클릭한 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 이동 단계를 그리드 정사각형으로 선택하여 그리드 사각형을 추가하거나 선택합니다. 구멍 선택으로 이동하여 자동 유중심을 누릅니다.
그리드 정사각형 이미지가 촬영될 때까지 기다립니다. 자동 기능이 실패하면 높이가 크게 꺼져 있기 때문일 수 있습니다. 그리드 제곱 배율에서 독감 화면을 사용하여 수동으로 조정할 수 있습니다.
구멍 크기를 측정하려면 노란색 원을 이동하고 조정하여 올바른 크기와 간격으로 구멍 위에 있습니다. 구멍을 찾아보세요. 구멍이 올바르게 발견되었는지 확인합니다.
그렇지 않은 경우 구멍 크기를 변경하고 다시 구멍을 찾습니다 누릅니다. 이 프로세스가 일관되게 실패하면 그리드 제곱 배율에서 더 낮은 숫자 또는 더 밝은 스팟 크기로 이동하는 것이 좋습니다. 오른쪽의 필터 얼음 품질 히스토그램을 사용하여 구멍 선택을 조정합니다.
이것은 두꺼운 얼음과 얇은 얼음이있는 영역을 제외하는 데 유용 할 수 있습니다. 세션 중에 선택한 향후 그리드 사각형에 대해 기억됩니다. 상단의 선택 메뉴의 도구로 구멍 선택을 최적화합니다.
예를 들어 그리드 막대 에 가까운 구멍을 제거하려면 클릭합니다. 템플릿 정의로 이동하여 획득을 누릅니다. 찾기 및 중앙 구멍을 클릭합니다.
단계 이동 후 지연을 변경하고 이미지 시프트 시간 후 지연 시간을 1~5초로 변경한 다음 가능한 경우 최대 이미지 시프트 값이 원하는 대로 확인합니다. 획득 영역을 클릭하고 이미지의 어느 곳을 클릭합니다. 획득 영역을 원하는 위치로 이동합니다.
오른쪽 상단에 디포커스 범위를 추가합니다. 멤브레인 단백질 프로젝트의 전형적인 디포커스 목록은 음수 0.8에서 음수 3마이크로미터 디포커스로, 다른 획득 영역을 추가하여 획득 영역이 빔으로 이중으로 노출되지 않도록 배열합니다. 자동 초점 영역을 추가한 다음 이미지의 어느 곳을 클릭합니다.
자동 초점 영역을 구멍을 둘러싼 탄소로 이동합니다. 표준 관행은 제곱정에 걸쳐 Z 높이 변화에 따라 AFIS 또는 5 ~ 15 마이크로미터를 사용할 때 중심을 이윤을 사용하는 것입니다. 드리프트 측정 영역을 추가하려면 클릭합니다.
드리프트 측정은 그리드 스퀘어당 한 번 수행되었으며 표준 설정으로 초당 0.05 나노미터의 설정된 임계값을 측정했습니다. 드리프트 측정 영역은 자동 초점 영역과 직접 겹칠 수 있습니다. 드리프트나 자동 초점 영역이 획득 영역과 겹치지 않도록 합니다.
정사각형 선택으로 돌아가 그리드에서 수집할 사각형을 선택합니다. 수집 영역 수와 예상 데이터 수집 률을 사용하여 필요한 수집 영역 수를 예측합니다. 원하는 사각형을 모두 선택하면 모든 사각형을 준비합니다.
각 사각형이 수집되면 그리드 사각형 사이를 탐색하고 선택 브러시를 사용하여 구멍을 미세 조정합니다. 시편의 스테이지 위치로 이동하고 자동 기능을 사용하여 동심 높이를 설정합니다. 이전에 설명된 바와 같이 현미경 소프트웨어를 사용하여 현미경 정렬을 수행하고 텍스트에 있습니다.
목표 조리개를 다시 삽입하고 중앙에 조정하고 EPU로 객관적인 렌즈 난시를 수정하기 전에 자동 기능 내에서 혼수 상태에 관계없이 혼수 상태에 관계없이 정렬을 수행합니다. 두 선형이 모두 적절한 값에 수렴되는지 확인합니다. 자동 인수 실행을 시작하기 전에 자동 로더 터보 펌프가 꺼지고 필요한 경우 목표 조리개가 삽입되었는지 확인합니다.
자동화된 인수에서 자동화된 데이터 수집을 시작하기 위해 프레스 실행을 시작합니다. 이 프로토콜을 사용하면 아틀라스 단계에서 깨진 또는 건조 그리드를 선별하고 폐기할 수 있습니다. 대부분의 그리드에서 얼음 그라데이션이 관찰됩니다.
스크리닝 하는 동안 이상적인 입자 분포는 다양한 파티클 방향을 볼 수 있는 단일 분산됩니다. 얼음이 너무 얇으면 전자 빔으로 비춰지면 녹아 마이크로 그래프에 과도한 움직임을 일으킬 수 있습니다. 버퍼에 세제가 있을 때 가장 일반적으로 관찰됩니다.
얼음은 유리체여야 하므로 대부분의 이미지가 결정적인 얼음을 보여주는 그리드 영역은 제외되었습니다. 현미경 사진 품질을 평가하고 데이터 수집 수정이 필요한지 여부를 결정하기 위해 데이터의 그래픽 요약이 포함되었습니다. crYOLO와 같은 파티클 피커는 데이터의 첫 번째 패스를 위해 충분히 잘 작동하므로 2D 클래스 평균으로 진행이 가능합니다.
정크 파티클을 폐기해야 하는 동안 3D 분석을 위해 보조 구조 세부 사항을 표시하는 클래스를 선택해야 합니다. 파티클의 하위 집합을 사용하여 3D 분류 및 미세 조정을 위한 초기 모델을 생성할 수 있습니다. RagAB의 경우 데이터 집합에는 3D 분류 중에 분리할 수 있는 세 가지 구분 순응자가 포함되어 있습니다.
데이터 수집 및 후속 이미지 분석 단계의 성공은 스크리닝 단계에서 최적화된 그리드를 획득하고 식별하는 데 의존한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 3D EM 밀도 맵이 얻어지면 단백질 모델을 피팅 및 정제하거나 원자 모델 드 노보를 구축하여 더욱 해석될 수 있습니다. Cryo-EM 단일 입자 분석을 통해 이전에는 불가능했던 많은 대상을 구조화한 측정할 수 있습니다.
특히 이러한 워크플로우는 최근 COVID-19 관련 거대 분자의 구조를 해결하는 데 사용되었습니다.
