우리는 FACS 정렬과의 도움을 박사 Yitzchak Oschry 박사 Orit Sagi - Asif 감사드립니다. 이 연구는 보조금 협정 N 아래에있는 유럽 연합 (EU) 세븐 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에서 NE에 대한 교부금에 의해 지원되었다 ° [276890] 이스라엘 암 협회 (# 20110078)에서와 이스라엘 암 연구 기금 (연구에서 경력 개발 상).

1. 마우스에서 유방이나 피부 조직을 박리 <ol><li> 마우스에서 원하는 조직을 해부하기 전에 다음과 같은 용품 및 시약을 준비 : 공급 : <ul><li> 수술 도구 (세제로 세척 한 후 70 % 에탄올에 담근). </li><li> 스티로폼 표면은 절개 중에에 마우스를 말이다. </li><li> 핀이나 바늘은 절개 중에 쥐를 개최합니다. </li><li> 자기 저어 바 (autoclaved)를 포함하는 소화 뚜껑 유리 항아리. </li><li> 37 번 물을 욕조 ° C, 저어 판에 쉬고있는 동안, 잠수함 자기 교반기와 잠수함 소화 병을 할 수있을만큼 물을 포함. </li></ul> 시약 : <ul><li> FACS 버퍼 I : (4 ° C) : Dulbecco의 인산이 (칼슘 마그네슘 무료) 식염 CMF 버퍼 + 0.5 % BSA </li><li> Collagenase 솔루션 (바로 사용하기 전에 한) : 0.05 g Collagenase II 0.05 g Collagenase IV 0.01 g의 Deoxyribonuclease 20ML FACS 버퍼 I.는 사용까지 얼음에 collagenase 솔루션을하세요. </li><li> PharmLyse (염화 암모늄의 Lysing 시약). </li><li> FACS 버퍼 II : Dulbecco의 인산이 식염 CMF 버퍼 + 1% FCS합니다. </li></ul></li><li> 유방 땀샘의 해부 (또한 17 참조). <ul><li> 이산화탄소 (CO 2) 흡입을 사용하여 여성의 쥐를 안락사시켜야. </li><li> 스티로폼 표면에서의 뒷면에 마우스를 놓고 단단히 25 게이지 바늘 (그림 1A)를 사용하여 사지를 핀. 70 %의 에탄올과 넉넉한 마우스를 스프레이. </li><li> 집게를 사용하여 중간 선에서 복부 피부를 당겨와 날카로운 가위로 작은 절개를합니다. </li><li> 복부 나 가슴 충치를 펑 쳐링 피하는 동안 절개부터, 동물의 목에 피부를 잘라. </li><li> &quot;Y 모양&quot;의 ​​결과로, 다리에 대한 중간 선 절개의 후면 다리에 피부를 잘라. </li><li> 마우스 몸에서 떨어진 피부를 당겨 아래로 핀, 노출유방 땀샘은 피부의 아래쪽 (그림 1B)에 부착. </li><li> 마우스의 척추를 향해 유선을 분리하는 작은 날카로운 가위로 결합하는 조직을 절단하면서 부드럽게 피부의 유방 땀샘을 분리하는 Q-팁을 사용하십시오. </li><li> 복부 분비 (# 4, 5)이 프로토콜에 가장입니다. 당신은 또한 2 차 유선을 사용하지만, 이러한 분비는 해부학 적 혼합 조직 출신 세포의 결과로, 별도의하기 어려운 경우도 있습니다 pectoralis 근육 가까이에있는 것을 명심 수 있습니다. </li><li> 참고 : 종양 조직을 해부 할 때,이 괴사 영역을 제거하는 것이 좋습니다. </li></ul></li><li> 피부 조직의 해부 : 머리 제거 처리 할 필요없이, 피부 조직을 취득하는 가장 쉬운 방법은 마우스 귀를 사용하는 것입니다. 조직의 큰 금액이 필요한 경우, 당신은 마우스 몸에서 머리를 면도하고 피부를 해부 할 수 있습니다. <ul><li> CO 2 흡입을 사용하여 쥐를 안락사시켜야. </li><li> 날카로운 가위를 사용하여 얼음에 PBS의 작은 볼륨 (~ 0.5 ML)를 포함하는 소화 병에 즉시 귀 및 장소를 모두 잘라. </li></ul></li></ol> 2. 유선 / 피부 단일 세포 현탁액의 준비 <ul><li> 유방 땀샘 / 얼음 PBS의 작은 볼륨을 포함하는 소화 병의 피부를 놓습니다. 조직 한 다음 PBS로 세척을 피 X2이며, 경우 초과 PBS를 폐기하십시오. </li><li> 곡선 가위로 철저하게 이기다. </li><li> 20 ML의 collagenase 솔루션 (참고 : collagenase 솔루션의 양이 효율적으로 15 쥐 최대의 유방이나 종양 조직과 귀를 약 5g을 떼어 놓다 것)을 추가합니다. </li><li> 37 판을 저어에 즉시 배치 ° 15 분에 C 물 욕조 및 품다 중간 속도로 교반하면서. </li></ul> 참고 : 다른 조직을 소화하는 경우 최적의 배양 시간이 다를 수 있습니다. <ul><li> 반응을 중지하려면, 30 ML 차가운 DMEM + 10% FCS를 추가합니다. </li><li> 조직 / 미디어 혼합을 통해서 스트레인헥타르 70 μm 전지 스트레이너는 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 위치. </li><li> 4에 450 XG에서 5 분의 원추형 튜브를 원심 분리기 ° C. </li></ul> 3. 적혈구의 용해 참고 :이 희생되기 전에 쥐가 PBS로 마음 perfused 있다면이 단계가 필요하지 않습니다. <ul><li> 세포 펠렛을 방해하지 않으면 서, 진공에 부착 된 유리 피펫을 사용하여 표면에 뜨는을 대기음. </li><li> 상온에서 5 분 10 ML의 PharmLyse 솔루션과 배양에 RBC, resuspend 세포 펠렛을 lyse합니다. </li><li> FACS 버퍼 I.의 약 40 ML을 추가하여 PharmLyse 솔루션을 중화 </li><li> 4 ° C.에서 450 XG에서 5 분을위한 세포와​​ 원뿔 튜브를 스핀 </li><li> 표면에 뜨는을 대기음. </li></ul> 4. 내생 FC의 차단 <ul><li> 선택 사항 : 다음 단계에 해당하는 양을 결정하는 셀 수. </li><li> 1-3 ML FACS 버퍼 I에 Resuspend 세포 (O를 따라사용하려는 N 셀 번호 및 항체의 양). </li><li> 1시 50분 희석 (10 μg / ML)에 도달하고, 10-20 &#39;을 얼음에 품다 할 FcBlock (안티 - 마우스 CD16/CD32)를 추가합니다. 아니오 FcBlock 씻어 필요가 없습니다. </li></ul> 5. 더럽히는 것 <ul><li> 해제 - 스테인드 제어 및 단일 색상 컨트롤 (사용 형광 항체의 수에 따라)으로 사용할 eppendorf 튜브에 100 μl aliquots을보십시오. </li><li> 라벨 섬유 아세포로 : 1시 50분의 희석 (10 μg / ML)에 (형광에 직접 복합) 방지 PDGFRα를 추가합니다. </li><li> 다른 세포 집단 (예를 들면 면역 세포, 대 식세포, 내피 세포 등) 라벨 : 1시 50분 희석에, 표면 마커에 적절한 휘황 복합 항체를 추가합니다. </li></ul> 참고 : PDGFRα는 섬유 아세포에 대한 강력한 마커이지만, 그것은 어떤 이중 긍정적를 제외하기 위해 면역 세포와 상피 세포에 대한 항체를 포함하는 것이 좋습니다인구 및 따라서는 고립 된 섬유 아세포의 순도를 향상시킬 수 있습니다. <ul><li> 단일 색상 제어 eppendorf 튜브의 각 각 항체의 2 μl를 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 얼음에 1 시간에 대한 항체와 세포를 배양. </li><li> 세탁 방법은 다음과 같습니다 FACS 버퍼 I와 튜브를 작성하여 4 ° C.에서 450 XG에서 5 분에 스핀 </li><li> 약 2 X 10 6 세포 / ML, 또는 중 사용 가능한 FACS의 정렬과 정렬을위한 가장 적합한 농도의 농도에 I를 버퍼링 FACS에 표면에 뜨는, resuspend 세포를 대기음. </li></ul> 선택 사항 : 셀이 분류의 기간 동안 FACS 버퍼 II에 resuspended 될 수 있습니다. 이 세포 생존 능력을 향상시킬 수 있습니다. 그러나, 혈청의 요인에 노출, 테스트 및 고려해야 효과 유전자 발현을 할 수 있습니다. <ul><li> 셀 clumps을 방지하기 위해 튜브에 필터 셀 : 필터 상단으로 FACS 튜브에 표시된 셀을 전송합니다. </li><li> 죽은 세포를 제외하려면 7AAD을 (0.5 μg / ML) 추가 또는 형샘플에 idium의 요오드화물 (PI) (을 취소 스테인드 제어 제외). </li></ul> 참고 : 셀을 낭비하지 않도록하려면 FACS에 기록 후 해제 - 스테인드 샘플에 7AAD/PI을 추가하고 7AAD 전용 컨트롤로 다시 사용할 수 있습니다. <ul><li> 분석하는 동안 얼음에 샘플을 보관. </li></ul> 6. FACS에 의한 세포의 분리 (참고 : 프로토콜의이 부분은 ​​FACS의 정렬, 예를 들어 BD FACS AriaII, 또는 숙련 된 기술자의 도움을 운영에 이전 지식을 필요). <ul><li> FACS 정렬 소프트웨어 (BD ​​FACSDiva)를 사용, 앞으로 분산 (FSC), 측면 분산 (SSC), 7AAD, FITC, PE 및 레이블 셀 (그림 2)에 사용되는 다른 형광을 분석하기 위해 적절한 분석 음모를 준비합니다. </li><li> 셀 정렬 각 샘플을로드하기 전에 소용돌이가 간단히 세포를 resuspend합니다. </li><li> cel에서 게이트로, 총 세포 인구의 게이팅을 설정하기 위해 흠없는 샘플을 분석하여 시작난 파편, 그리고 autofluorescence이나 배경 착색을 결정합니다. </li><li> 전체 세포 인구에서 라이브 세포의 인구를 결정하고 게이트 흠없는 샘플 + 7AAD를 분석합니다. </li><li> 이러한 보상 등의 매개 변수를 결정하고 보정 각 단일 색상 제어를 분석합니다. </li><li> 정렬 게이트의 위치를​​ 정의하기 위해 스테인드 샘플을 분석합니다. </li><li> 일단 원하는 세포 인구에 대한 매개 변수 및 문이 설정되었으며, eppendorf 튜브 나 문화 매체 또는 RNA의 용해 버퍼를 (예 : RLT 버퍼 또는 Trizol 등)가 포함 된 15 ML 원뿔 튜브에 표시된 셀 인구 정렬 시작합니다. </li></ul> 참고 : 셀의 많은 정렬하는 경우가 세포 용해 버퍼를 희석하고 수율을 줄일 수 있습니다 동반 피복 유체의 큰 볼륨으로, RNA의 용해 버퍼에 직접 정렬하는 것은 권장하지 않습니다. <ul><li> 신선한 중간이나 RNA의 용해 버퍼 드에 정렬이 완료 된 후 다운 즉시 세포를 회전 및 이동실험의 목적에 대기 중입니다. </li><li> 문화 절연 셀에 순서대로 정렬하면 멸균 정렬을 수행합니다. 세포의 더 나은 복구를 들어, 페놀 레드 무료 DMEM + 5퍼센트 FCS 대신 FACS 버퍼 II를 사용하여 20 % FCS와 문화 매체에 세포를 수집합니다. </li><li> 배양은 섬유 아세포를 정렬하면 자신의 유전자 표현의 변화로 이어지는 섬유 아세포의 활성화에이 결과로 플라스틱 콜라겐 코팅 접시에 alwaysplate 결코 직접적으로. </li></ul>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

조직 문화에 실험을 유익하게 생체에서 확인 할 수 있습니다 기능 원리를 제안 할 수 있지만, 그것은 문화 11,12의 세포의 유전자 발현에 큰 변화가 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 섬유 아세포의 유전자 발현 프로파일 링 할 때 조직 문화 단계를 피하기 위해, 우리는 할 수 있습니다 신선한 마우스 또는 인체 조직의 정상뿐만 아니라 암 관련 섬유 아세포의 분리.에게 프로토콜을 ?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong시약의&gt; 이름</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;<td<strong&gt; 코멘트 (선택 사항)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41,965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; 생물 산업</td&gt;<td&gt; 02-023 - 1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Col​​lagenase II</td&gt;<td&gt; 워싱턴</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Col​​lagenase IV</td&gt;<td&gt; 워싱턴</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease</td&gt;<td&gt; 워싱턴</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 셀 스트레이너 70 μm</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93,070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 정화 안티 - 마우스 CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 비아 프로브 (7AAD)</td&gt;<td&gt; 전자 Bioscience</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - 마우스 CD140a-PE (PDGFRa)</td&gt;<td&gt; 전자 Bioscience</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - 마우스 F4/80- FITC</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM w / O 페놀 레드</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31,053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 콜라겐 유형 I</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 354236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by fluorescence activated cell sorting (facs)

암 관련 섬유 아세포은 (CAFs) 특히 유방 암에, 많은 암의 종양 기질 내에서 가장 눈에 띄는 세포 유형으로, 그들의 눈에 잘 띄는 존재는 종종 가난한 예후 (豫后)의 1,2와 연결되어 있습니다. CAFs는 stromal 섬유 아세포의 활성화 subpopulation 있으며, 그 중 많은 myofibroblast 표시 α-SMA 3 표현한다. CAFs 지역 조직 섬유 아세포에서뿐만 아니라 골수 유래 세포 개발 종양으로 모집하고 종양 microenvironment (4)의 영향 아래 CAF의 표현형을 채택에서 유래. CAFs는 종양 세포 증식, 혈관 신생, 그리고 침략 5-8을 조장하는 신호를 통해 ​​종양 개시, 성장과 진행을 촉진하기 게재되었습니다. 우리는 CAFs는 초기 사전 neoplastic 단계 9시 시작, 종양 - 홍보 염증을 중재하여 종양 성장을 향상 것을 보여 주었다. 키 역할 CAFs의 증가에도 불구하고 증거가 종양 성장을 촉진에서 재생공부 CAFs은 종양 microenvironment 10 공동 기존의 여러 하위 유형이있는 CAF 특정 마커 및 이들 세포의 광대 한 이질성의 부족으로 인해 지속적 도전했다. 또한, 체외에서 섬유 아세포를 공부하는 것은 자신의 유전자 발현 프로파일은 종종 조직 배양 11,12에서 변경 있다는 사실에 의해 방해된다. 이 문제를 해결하기 위해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 섬유 아세포의 편견 유전자 발현 프로파일을 허용하기 위해 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 13,14의 이전 프로토콜을 기반으로하는 방법을 개발했습니다. 우리 접근 방식은 신선한 마우스와 인간의 조직에서 섬유 아세포를 분리 할 수​​있는 표면 마커로 PDGFRα을 사용에 의존하고 있습니다. PDGFRα이 넘치게 일반적인 섬유 아세포와 CAFs 9,15 모두에 의해 표시됩니다. 이 방법은 등의 일반적인 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구,의 고립하지만이 α-SMA으로 제한 할 수 있습니다 + myofibroblasts을 활성화. 절연 섬유 아세포는 할 수 있습니다특성화 및 tumorigenesis 동안 CAFs에서 발생하는 유전자 발현의 진화 비교에 사용됩니다. 사실, 우리와 다른 사람들은 16 정렬 세포에 의해 고립 된 섬유 아세포의 표현 프로파일을 발표했다. 이 프로토콜이 성공적으로 피부, 유방, 췌장과 폐 조직에서 섬유 아세포의 매우 풍부한 인구를 분리 및 프로필하기 위해 수행되었다. 또한, 우리의 방법은 작동 실험을 수행하는 문화 CAFs하려고 할 때 종종 큰 장애물입니다 종양 세포에 의한 오염을 방지하기 위해, 정렬 세포의 배양 할 수 있습니다.

조직 섬유 아세포의 높은 풍부한 인구의 고립 된 섬유 아세포 결과의 표시로 PDGFRα을 사용합니다. 정렬 후 순도의 수준은 후 정렬 분석 (그림 2A)에 의해 정량 99 %이다. 셀 - 특정 제어 유전자의 상대적 표현 (그림 2B)에 의해 비 섬유 아세포 세포를 오염 수의 비율을 추정하는 것은 일반적으로 0.1-0.6 %의 오염을 보여줍니다. 순도 수준은 절연 섬유 아세포 9 고품질의 t...

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Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

암 관련의 섬유 아세포 (CAFs)는 확산, 혈관 신생 및 염증을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진한다. 여기 우리는 표면 마커로 PDGFRα를 사용하여 셀 정렬에 의해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 정상 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다.

형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

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Research

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Biology

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

35.5K 조회수.  Tel Aviv University. 암 관련의 섬유 아세포 (CAFs)는 확산, 혈관 신생 및 염증을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진한다. 여기 우리는 표면 마커로 PDGFRα를 사용하여 셀 정렬에 의해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 정상 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다.

비디오: Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

의 분리 및 정제 Drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

연구

생물학

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification of bacterial taxa that transform specific pools of DOC in nature poses a technical challenge. 
Here we describe an approach that couples bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation, fluorescence activated cell sorting (FACS), and 16S rRNA gene-based molecular analysis that allows culture-independent identification of bacterioplankton capable of degrading a specific DOC compound in aquatic environments. Triplicate bacterioplankton microcosms are set up to receive both BrdU and a model DOC compound (DOC amendments), or only BrdU (no-addition control). BrdU substitutes the positions of thymidine in newly synthesized bacterial DNA and BrdU-labeled DNA can be readily immunodetected 1,2. Through a 24-hr incubation, bacterioplankton that are able to use the added DOC compound are expected to be selectively activated, and therefore have higher levels of BrdU incorporation (HI cells) than non-responsive cells in the DOC amendments and cells in no-addition controls (low BrdU incorporation cells, LI cells). After fluorescence immunodetection, HI cells are distinguished and physically separated from the LI cells by fluorescence activated cell sorting (FACS) 3. Sorted DOC-responsive cells (HI cells) are extracted for DNA and taxonomically identified through subsequent 16S rRNA gene-based analyses including PCR, clone library construction and sequencing.

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Environmental bacterioplankton are incubated with a model dissolved organic carbon (DOC) compound and a DNA labeling reagent, bromodeoxyuridine (BrdU). Afterward, DOC-degrading cells are separated from the bulk community based on their elevated BrdU incorporation using fluorescence activated cell sorting (FACS). These cells are then identified by subsequent molecular analyses.

Bromodeoxyuridine (BrdU) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

쥐 포탈 섬유아 세포의 분리에 의한<em&gt; 현장에서</em&gt; 간 재관류

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

거대한 바이러스 혼합물 분리를 위한 형광 활성화 세포 분류에 대한 대체 전략으로서의 단일 세포 마이크로 포부

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Scleractinian 세포 인구의 격리를 위한 형광 활성화 세포 분류

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...