이 프로토콜은 무린 유방암에서 섬유아세포와 관련된 1차 암을 성공적으로 분리하고 배양하여 종양 마이크로 환경을 표적으로 설계된 새로운 나노입자를 선별할 수 있게 한다. 1차 CAF는 종양 기질의 체외 연구를 위한 가장 신뢰할 수 있고 생리적인 모형을 나타냅니다. 이 프로토콜에서는 최적의 수율을 달성하는 방법을 설명합니다.
시작하려면 종양 해리를 위한 소화 믹스를 준비하고 튜브를 단단히 닫은 후 용액에 3~5mm 종양 조각을 담그십시오. 튜브를 거꾸로 뒤집어 종양의 모든 조각이 튜브 의 바닥에 캡을 향하고 있는지 확인합니다. 그런 다음 적절한 하우징에서 기계적 해리에 튜브를 부착하고 거친 종양을 위해 특별히 설계된 해리 프로그램을 실행합니다.
달리기 후 튜브를 분리하고 거꾸로 놓고 샘플을 섭씨 37도에서 40분 동안 부드러운 흔들림으로 배양합니다. 그런 다음 적절한 하우징에서 해리에 튜브를 다시 부착하고 거친 종양에 대한 해리 프로그램을 두 번 실행하여 절차의 끝에 큰 조직 조각이 남아 있지 않도록합니다. 50 밀리리터 튜브에서 40 미크론 세포 스트레이너를 통해 샘플을 필터링합니다.
그런 다음 RPMI 1640 배지 및 원심분리기의 10 밀리리터로 필터를 세척합니다. 원심 분리 후 PBS, 0.5%BSA 및 2개의 밀리머 EDTA로 구성된 PBE 버퍼에서 펠릿을 다시 중단하고 Trypan Blue로 세포를 계산합니다. 멸균 이중 증류수로 20X 바인딩 버퍼 스톡 솔루션을 희석하여 데드 셀 제거 바인딩 버퍼를 복구합니다.
1X 결합 버퍼와 원심분리기의 5밀리리터로 셀을 세척합니다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 0.1 밀리리터의 죽은 세포 제거 미생물로 7세포까지 10밀리리터로 재보중단하고 실온에서 15분 동안 배양한다. 인큐베이션 중에 후드 아래에 자기 스탠드를 준비하고, 팁을 아래로 가리키며 강자성 분리 열을 걸어 놓습니다.
콜드 바인딩 버퍼0.5 밀리리터로 열을 상화하고 솔루션이 흐를 때까지 기다립니다. 인큐베이션 후, 비드 및 셀 서스펜션에 400 마이크로리터의 냉바인딩 버퍼를 추가합니다. 전체 부피를 컬럼에 적재하고 15 밀리리터 튜브에서 유출물을 수집합니다.
콜드 바인딩 버퍼의 0.5 밀리리터로 열을 네 번 세척하고 동일한 튜브에서 총 유출물을 수집합니다. 비암 관련 섬유아데스의 고갈을 위해, PBS로 촉촉한 70 마이크론 세포 스트레이너를 사용하여 세포 현탁액을 필터링하고 세포를 원심분리한다. 상체를 제거하고 차가운 PBE 버퍼의 80 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
비 종양 관련 섬유아세포 고갈 칵테일의 20 마이크로리터를 추가합니다. 잘 섞고, 어둠 속에서 15 분 동안 섭씨 4도에서 샘플을 배양하십시오. 구슬이 있는 인큐베이션 동안 마그네틱 스탠드에 강자성 고갈 컬럼을 준비합니다.
냉간 PBE 버퍼의 두 밀리리터로 컬럼을 상화하고 용액이 흐를 때까지 기다립니다. 인큐베이션 후 400 마이크로리터의 버퍼를 비드 및 셀 서스펜션에 추가합니다. 전체 부피를 컬럼에 적재하고 15 밀리리터 튜브에서 유출물을 수집합니다.
PBE의 두 밀리리터로 컬럼을 두 번 씻으시다. 동일한 튜브에 총 유출물을 수집하고 유출물을 원심분리합니다. 암 관련 섬유아세포의 긍정적인 선택을 위해, 차가운 PBE 완충제의 80 마이크로리터에서 펠릿을 다시 놓아.
그런 다음 종양 관련 섬유아세포 마이크로비드의 20 마이크로리터에서, 어둠 속에서 15 분 동안 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다. 인큐베이션 하는 동안, 자기 스탠드에 강자성 분리 열을 준비 하 고 차가운 PBE 버퍼의 0.5 밀리 리터와 그들을 평형. 인큐베이션 후, 비드 및 셀 현탁액에 PBE의 400 마이크로 리터를 추가합니다.
전체 볼륨을 컬럼에 로드하고 레이블이 없는 셀이 15 밀리리터 튜브로 흐르게 합니다. 0.5 밀리리터의 PBE 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하고 동일한 튜브에 총 유출물을 수집합니다. 자석에서 컬럼을 제거하고 1.5 밀리리터 튜브에 놓습니다.
PBE 의 밀리리터 1밀리리터를 열에 넣고 플런저를 기둥으로 밀어 내밀어 셀을 플러시합니다. 원심 분리 후, DMEM의 적절한 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 조직 배양 판에 세포를 시드한다. 현미경의 밑에 세포 밀도를 확인하고, 세포가 고착되고 성장할 수 있도록 37섭씨, 5%이산화탄소에 접시를 놓습니다.
4T1 루시파라제 세포를 암컷 마우스의 유방 지방 패드로 주입하여 이식 후 5일 후에 검출 가능한 종양 질량의 성장을 주도하였다. CAF 격리에 적합한 희생 창을 찾기 위해, 한편으로는 종양 크기와 생물 발광 이미징, 그리고 새로운 종양 궤양 및 괴사 사이에 최적의 타협이 모색되었다. 20일은 격리 과정 이후에 세포 회수를 최적화하는 시점으로 설정되었다.
수집된 실행 가능한 세포의 패널, 비 종양 관련 섬유아세포의 고갈 및 종양 관련 섬유아세포의 농축에서 CAF의 인구를 격리하기 위해 2개의 더 많은 통로가 필요했습니다. CAF 세포는 섬유아세포의 전형인 대형 스핀들 모양의 형태를 밝혀냈으며, 4T1 종양 세포와 달랐다. FAP 표현은 다섯 구절을 통해 다음 기본 CAF 문화는 원래의 특성을 유지 확인.
미생물을 가진 잠복기의 지속 시간 및 온도가 유지되지 않았을 때, 다른 형태를 가진 클론은 고립된 문화 사이에서 찾아냈습니다. 이 오염 물질 세포는 더 빨리 성장하고 1 차 CAF 배양에 지배. 인간 페리틴 Hfn-FAP 기능성 나노 약물과 결합하는 CAF는 맨HFN에 비해 1대 1, 1대 5 항체 단편 농도가 3배 증가했습니다.
반대로, 종양 4T1 세포의 경우, 베어 HFN은 기능성 HFN보다 더 높은 결합을 보였다. 격리된 CAF의 수율 불순물을 증가시키기 위해 버퍼를 차갑게 유지하고, 구슬로 잠복시간을 존중하며, 최종 농축 단계 전에 컬럼당 최대 4개의 종양을 당깁니다. 격리된 CAFs는 생체 내 전임상 실험을 진행하기 전에 결합, 섭취 및 약리학적 효능의 용어로 여러 후보 나노 약물을 선별하는 데 사용할 수 있습니다.
CAF 절연은 나노 입자가 종양 미세 환경을 표적으로 하는 데 사용될 수 있는지 시험할 수 있었습니다. 따라서 화학 요법과 시너지 효과로 일하는 새로운 표적 치료법으로 가는 길을 열어주기도 합니다.
