우리는 분석 개발이 원고에 대한 비판적 의견과 관련하여 도움이 알베르토 Severini과 바네사 Goleski 감사드립니다. 이 작품은 캐나다의 보건 기관 및 산업 연구 지원 프로그램 (캐나다 국립 연구위원회)에 의해 재정 지원되었다. 추가 지원은 서스캐처원 출판물 기금의 대학에서 얻은 것입니다.

이 방법은 Dumonceaux 외에 보고된 연구에 사용되었습니다. J. Clin. . Microbiol 47 4067-4077, 간접 : 10.1128/jcm.00112-09 (2009). 전체 절차를 묘사한 도식 다이어그램 그림 1에 표시됩니다. 1. 비드 커플링 이것은 (표 2 참조) 폴리스티렌 Luminex 비즈에 oligonucleotide 프로브를 연결에 사용할 방법을 설명합니다. 볼륨은 시험 기준에 대한 새로운 캡처 프로브의 평가를위한 약간 적응되며 이러한 볼륨은 괄호 안에 표시됩니다. <ol><li> -20 ° C의 dessicator에서 1 - 에​​틸 -3 - (3 - dimethylamiopropyl) carbodiimide HCL (EDC) 분말을 제거하고 실내 온도로 따뜻하게. </li><li> 그리고 약 20 초 vortexing 20 초 동안 waterbath sonicator에서 sonciation하여 microspheres를 Resuspend. </li><li> (이것은 5x10 6 또는 1.25x에 해당 Eppendorf 튜브에 microspheres 400 μl (100 μl)를 전송10 6 microspheres). Luminex는 튜브에 고집과 구슬 복구를 방해에서 uncoupled 구슬을 방지하기 위해 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브 (예 : Eppendorf 단백질 LoBind 튜브, 카탈로그 번호 0030 108.094)의 사용을 제안합니다. 우리는 우리가 일반적으로 사용하는 표준 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 튜브를 (예 : VWR 카탈로그 번호 87003-298)을 사용하여 문제를 발견하지 않았습니다. </li><li> 1 분 14,000 XG에 펠릿. 제거하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> (N - Morpholino) ethanesulfonic 산성 (MES) 산도 4.5 - 방 - 온도가 0.1 M이 50 μl의 microspheres (12.5 μl)를 Resuspend. </li><li> 10 MG / 물 속에 ML에서 EDC의 새로운 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 다음 10 MG / ML 물을 추가 분석 규모 EDC의 50-10 MG 무게하여이 솔루션의보다 한 ML을 준비합니다. </li></ol></li><li> 5&#39; - 아미노 C12 - 수정한 캡처 microspheres에 oligonucleotide (표 2)와 vortexing으로 섞어 1 nmol을 추가합니다. 1 nmol 200 μm의 oligo 5 μl입니다뉴클레오 티드. </li><li> 5 초 동안 vortexing하여 microspheres과 혼합 신선한 EDC 솔루션 2.5 μl를 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 30 분 동안 상온에서 부화. </li><li> EDC 솔루션 (단계 1.6) 취소하고 (단계 1.6) 위와 같이 물 10 밀리그램 / ML EDC의 새로운 샘플을 준비합니다. </li><li> 5 초 동안 microspheres과 와동 신선한 EDC 솔루션의 또 다른 2.5 μl를 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 30 분 동안 상온에서 부화. </li><li> 십대 초반 0.02 % 20 일 ML을 추가하여 비즈 씻으십시오. 구슬을 resuspend하는 소용돌이 (선택뿐만 아니라 20 초 동안 sonicate). </li><li> 14,000 XG 1 분 원심 분리기. 제거하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 0.1 %의 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) 1 ML를 추가하여 다시 비즈 씻으십시오. 구슬을 resuspend하는 소용돌이 (선택뿐만 아니라 20 초 동안 sonicate). </li><li> 14,000 XG 1 분 원심 분리기. 제거하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 100 μl (25 μl) (TE) 버퍼 [10m에 비즈를 ResuspendM 트리스 - CL 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0]. </li><li> 주식 농도를 결정하는 혈구계이나 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운터에서 구슬을 열거합니다. </li><li> 100 구슬 / TE 버퍼에 μl의 최종 농도 각 비드를 diluting하여 Microsphere 마스터 믹스를 준비합니다. 수영장은 분석의 원하는 플렉스 (예 : 10 - 플렉스 분석에 대한 각 비드의 100/μl의 최종 농도 10 가지 결합 구슬을 혼합)에 해당하는 구슬을 결합. </li><li> 4 Microsphere 마스터 믹스를 저장 ° C를 어둠 속이라서. 이러한 조건 하에서 보관하면 혼합물은 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. Chaperonin 60 보편적인 대상 (cpn60 UT) 단일 가닥의 amplicon 생산 및 생성. <ol><li> 각 샘플에 대한 중합 효소 사슬 반응 (PCR) 제품를 생성합니다. phosphorothioate과 비오틴 - 수정 5 &#39;프라이머 세트 (표 1) 포함합니다. 믹스에 볼륨과 농도에 대한 표 3을 참조하십시오. </li><li> PCR이 완료 직후, T7 전 2 μl를 (20 세대) 추가각 PCR 튜브 (PCR 버퍼는 T7 반응으로 충분)로 onuclease. 상온에서 반응 품어 (를 ~ 22-25 ° C) 40 분. </li><li> 이 부화의 끝에서, 0.5 M의 에틸렌의 12.5 μl를 추가 tetraacetic 산성 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 산도 8.0 믹스를 디아민. 이것은 단일 좌초 PCR 제품의 ~ 64.5μl 총을 제공합니다. </li></ol> 3. oligonucleotide 결합 폴리스티렌 비즈로 단일 좌초 PCR 제품의 하이브 리다이 제이션. <ol><li> 60 Prewarm 악기 ° C 분석 중에 하이브 리다이 제이션 온도를 유지합니다. 악기의 소프트웨어를 사용하여 플랫폼 히터 전원을 켜고 hybridized 비드 혼합을 포함하는 PCR 스타일의 번호판을 맞는 황동 가열 블록을 사용해야합니다. </li><li> 피펫과 Resuspend Microsphere 마스터 믹스 (단계 1.20)는, Eppendorf 튜브에 해당하는 금액을 분배 캡 튜브, 2 분 waterbath sonicator에 sonicate. 양자 택일로, 비드 resuspe에서 절대 일관성을 보장하기 위해nsion은 microsphere 마스터 믹스는 다음 폴리 프로필렌 Eppendorf 튜브에 원하는 금액을 분배, 위와 같이 sonication을 vortexing 후, pipetting하여 resuspended 수 있습니다. </li><li> 로우 프로파일 96 - 웰 플레이트 Thermowell PCR (표 2)의 적절한 우물에 단일 좌초 PCR 제품 17 μl (단계 2.2) 분배. 각 자에게 resuspended, sonciated 비드 혼합 33 μl를 추가합니다. 실리콘 커버 (표 2)와 커버하고 부드럽게 누릅니다. </li><li> 의 프로그램 thermocycler에 접시를 넣고 10 분, 5 분, 60 ° C에 대해 95 ° C 60 ° C 잠깐 만요, 60 ° C 5 분, 끝. 프로그램을 시작합니다. </li><li> streptavidin - phycoerythrin (SA - PE) 솔루션 신선하게, 당신은 (여러 우물이 추가 확인) 물론 당 25 μl가 필요합니다. 0.1 %의 Sarkosyl,, 50 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0 주식 SA - PE (1 MG / ML) 1X tetramethylammonium 염화 (TMAC) 버퍼 (3 M TMAC와 1시 50분 20 μg / ML을 diluting하여 SA - PE 솔루션을 확인하십시오 , 4 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0). </li><li> thermocycler가 60 ° C 대기 단계에 도달하면,, 뚜껑을 열고 실리콘 커버와 (thermocycler의 접시를 잡아 당기지 말라) 각 잘 직접 SA - PE 솔루션을 추가, 제거. , 실리콘 커버를 교체 thermocycler의 뚜껑을 닫고 프로그램을 재개한다. </li><li> 프로그램이 완료되면, 접시를 꺼내 빠르게 읽을 수 BioPlex 컴퓨터로 전송할 수 있습니다. 플레이트는 10 분 이내에 읽을 수 있어야합니다. 60 ° C에서 읽기, BioPlex이 온도 prewarmed되었는지 확인하십시오. 프로브 높이로 사용 악기에 대한 사용자 설명서에 설명된 활용 접시를 수용할 수 있도록 조정되었음을 확신한다. </li><li> 정확한 비드 및 신호 감지, BioPlex에있는 게이트 설정은 사용중인 microspheres의 종류에 따라 설정해야합니다. 자기 microspheres는 5,000-25,000의 설정을 요구하면서 BioRad의 폴리스티렌 구슬은 4,335-10,000의 게이트 설정을 필요로합니다. 기자 게인 값을 증가 고등 PMT 설정을 사용하여 번호판을 실행하는 옵션도 있습니다. 이것이 내가 할 수배경 신호도 증가 될 것이다 ncrease 낮은 신호의 강도 그러나 그것이 중요하다고는 적절한 대조군을 포함합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 이 분석을 개발하고 구현하는 우리의 목표 중 하나는 가능한 한 간단하고 유선형으로 만드는 것이었다. 따라서 합리적인 기간에 완료할 수 분석을 개발하기 위해 T7의 exonuclease 처리 시간과 하이브 리다이 제이션 시간을 포함하여, 중요한 포스트 증폭 단계를 최적화. 그림 2A에 나타난 amplicon의 T7 처리는 대부분의 프로브이 짧은 또는 전혀 T7 치료로 거의 신호를했다 등, 신호 생성을 위해 필수적입니다. 신호는 신호 증가 둔화되는 시간에, 약 40 분까지 선형적으로 증가했다. 신호의 저하는 primers의 phosphorothioate 수정이 targe을 방지하는 매우 효과적인 것을 나타내는 T7 처리 시간이 2 시간에서 심지어는 관찰되지 않았습니다t 스트랜드의 저하는 15 설명했다. 우리는 전체 프로토콜 시간을 최소화하기 위해 T7 처리 시간 40 분 선택,하지만 T7 치료가 훨씬 오래 갈 수있는 그림 2A에서 분명하다. 우리는 또한 신호 생성 (그림 2B)에 하이브 리다이 제이션 시간의 효과를 결정하고 10 분 최대 신호에 대한 충분한 것을 발견, 신호에 아니 더 증가로 심지어 하이브 리다이 제이션 4 시간 후에 관찰되었다. 따라서 10 분 하이브 리다이 제이션 단계는 전반적인 분석 시간을 최소화하기 위해 다시 선정되었습니다. 마음에와 같은 InstaGene (바이오 - RAD)로 신속한 DNA 추출 기술과 함께 이러한 결과로, DNA 추출, PCR, 그리고 Luminex 분석을 포함한 전반적인 분석은 4-5시간에 완료하실 수 있습니다. 경계의 메모에서 Luminex 또는 BioPlex 실행하는 동안 폴리스티렌 구슬 집합의 수준은 분석의 효율성에 큰 영향을 줄 수 있습니다. BioPlex 소프트웨어는 발생 비즈 집합의 수준을 표시합니다하나 이상의 구슬이 레이저 경로와 집계에서 하이브 리다이 제이션 신호의 배제의 결과에 감지됩니다. 명백한 비드 집계는 하나의 구슬에 맞는 크기를하지 않은 미립 물질로 인해 수 있으며, 심지어는 공기 방울로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 이벤트 중 하나에서 비드 집계, 공기 방울, 또는 입자의 신호가 삭제됩니다. 대부분의 경우, 우리는 그 구슬 집합이 최소한의 것입니다 (그림 3A)와 각 구슬 100 집계 이벤트의 타겟 레벨이 쉽게 달성됩니다 찾습니다. 때때로, 그러나, 구슬은 집합의 중간 (그림 3B) 또는 심각한 (그림 3C) 수준을 보여줍니다. 이러한 경우에는 데이터의 대부분은 무시되기 때문에, 악기는 100 종류의 구슬 당 행사와 그 결과를 도달 문제가 의심 수 있습니다. sonication 단계 (단계 3.2) 비드 집계를 최소화하기위한 것입니다. 또한, 희석 microsphere 마스터 믹스 (단계 1.20)로 비즈를 저장하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 우리는 hybri로부터 제외 TMAC을 알고있다dization 버퍼는 - 대신 SA - PE의 희석제 (3.5 단계)에 추가하면 - 비드 집계를 최소화하는 데 도움이됩니다. 더욱이, 우리는 이것을 테스트하지 않은 반면, Luminex 또는 BioRad에서 사용할 수있는 최신 자기 비즈가 집계하는 경향이보다 적게 표시 것으로 생각되고 있습니다. G.을 대상으로 5 플렉스 Luminex 배열의 응용 프로그램의 결과 vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, 그리고 L. 해당 그람 스테인드 질 면봉은 얼룩과 함께 gasseri는 그림 4에 표시됩니다. 이 샘플은 여러 시간 지점에서 한 개인에서 찍은. 시간 0에서, 개인은 그램 얼룩에 따라 BV 진단 (그림 4A)과 배열, G.의 대표 생물의 같은 샘플에서 Luminex 결과 (그림 4B)가 표시되었습니다 vaginalis은 가장 널리 동안 A. vaginae와 L. iners도 긍정했다. 9 일 후, 개인은 여전히​​ BV 긍정과 S되었다G.위한 ignal vaginalis가 대폭 증가가 있었을 때, A. vaginae와 L. iners은 여전히 긍정했다. 그람 양성 bacilli가 뭉개진에서 감지되기로 G.에 대한 신호를하면서 중요한 것은,이 시간 이후에 개인은 (그림 4A) 정상 microbiota로 전환 시작 vaginalis은 감소하고 L.위한 신호 iners (그림 4B) 증가했다. 그램이 G.을 감지하는 데 실패 얼룩 있지만,이 방법 (G.의 vaginalis 및 / 또는 A. vaginae에 대한 긍정적인 샘플 BV는 긍정적인 것으로 간주되었다) 13 BV 우리의 원래 정의에 의해,이 개인은 모든 시간 지점에서 긍정적인 BV되었습니다 후자의 두 시간 포인트에서 vaginalis. Luminex 방법은 여기서 설명으로 동향에 쉽게 시퀀싱 기반 방법에 비해 수 있으며, 유기체의 정체성과 풍부한에 대한 추가 정보를 제공하면서 Luminex 분석의 결과는 일반적으로 그램 얼룩 13 증명할. <img src=고도 유지를 &quot;/ files/ftp_upload/3344/3344fig1.jpg&quot;= &quot;그림 1&quot;/&gt; 그림 1. 복잡한 임상이나 환경 시료의 microbiota 프로필을 결정하기위한 Luminex 프로토콜의 도식 다이어그램. 프로토콜은 관심의 샘플에서 추출되었습니다 템플릿 DNA와 함께 시작합니다. (1)을 사용하여 템플릿 DNA에서 PCR 제품을 생성 스트랜드 특정 biotinylated, 수정되지 않은 cpn60 UT PCR primers (표 1)과 함께 phosphorothioate - 수정 cpn60 UT PCR의 primers, (2)이있는 microbiota 대표하는 PCR 제품 풀을 생성 비오틴을 한 가닥의 수정을 phosphorothioate (3) phosphorothioate - 수정 가닥을 저하되므로 비오틴과 5 &#39;끝에 수정 단일 좌초된 DNA를 생성 수 없습니다 T7의 exonuclease와 이중 좌초 PCR 제품을 다이제스트 (4) 커플 종 특정 cpn60 UT 프로브로 폴리스티렌 비즈 - 각 구슬은 고유한 스펙트럼 주소 (구슬 색깔로 표시)를 갖는다는 것 ILuminex 또는 바이오 플렉스 계기로 뚜렷한 S는 (5) 관심이 샘플에서 종 특정 oligonucleotide 결합 구슬의 제품군에 생성된 단일 좌초 PCR 제품을 잡종 (6)에 바인딩 streptavidin - phycoerythrin 공액 추가 biotinylated 단일 좌초 PCR 제품 및 하이브 리다이 제이션의 지표 역할을하고 있지만, (7) Luminex 또는 바이오 플렉스 악기를 사용하여 스펙트럼 주소 (구슬 정체성)와 하이브리드화 신호 강도를 확인합니다. 최소한 100 구슬은 각 구슬 정체성에 대한 집계되고 phycoerythrin 신호의 평균 형광 강도 (MFI)은 출력으로보고됩니다. 최대 100 개의 서로 다른 종류의 구슬을 동시에 평가할 수 있지만 세 비드 종류의 차별을 보여주는 분석이 그림입니다. (8) PCR의 MFI가 동일한 예제에서 생성된 복제하는 경우는 (1 꼬리 학생의 T - 테스트, P &lt;0.05) 주어진 구슬에 대한 부정적인 컨트롤보다 훨씬 큰, 예제는 그 생물에 대해 긍정적인 것으로 간주됩니다.<html><img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Luminex 분석 매개 변수의 최적화. Peptostreptococcus의 anaerobius을 타겟으로하는 다섯 가지 프로브는 P. 포함하여 질과 연관된 것으로 알려진 20 박테리아의 복제된 cpn60 UT를 포함 plasmids를 구성된 혼합 템플릿에서 생성된 amplicons과 함께 사용되었다 anaerobius. (A). T7의 exonuclease 처리 시간의 효과. 위에서 설명한 프로토콜은 다음했지만 T7의 exonuclease과 치료 시간 전에 하이브 리다이 제이션 및 평균 형광 강도 (MFI) 모든 프로브에 대한 결정되었습니다하기 위해 다양한되었습니다. (B). 하이브 리다이 제이션 시간의 효과. 위에서 설명한 프로토콜은 하이브 리다이 제이션 시대의 다양한 이어했다. 프로브의 동일한 세트 및 평균 형광 강도 (MFI)가 모든 프로브에 대한 결정되었다에서 같은 템플릿에서 생성된 amplicon와 함께 사용되었습니다. &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. BioPlex 소프트웨어를 사용하여 비드 집합의 결정. 세 가지 예제는 비드 집합의 수준 (5 %) (A) 허용되는 BioPlex의 실행에 주어집니다, (B) 경계선 (50 %) 및 ​​(C) 허용되지 않는 (80 %). <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 동일한 개인에서 가져온 샘플에서 순차 BV 진단에 5 플렉스 Luminex 배열의 응용. (A). BV 각 샘플을 평가하는 데 사용되는 전통적인 진단을 보여주는 그람 스테인드 슬라이드. (B). 5 플렉스 Luminex 배열의 응용 프로그램 준비하고 (A)에 표시된 동일한 사 샘플이 프로토콜에 설명된대로 실행. 그의 MFI 신호 박테리아 타겟은 우리의 정의 (1 꼬리 학생의 T - 테스트, P &lt;0.05)이 별표 (*)로 표시됩니다에 의해 상당히 긍정했다.

<ol>
	<li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li><li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+the+littoral+zone:+lactobacilli+losing+the+plot.">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li><li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis:+a+public+health+review.">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).</li><li>Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravaginal+practices,+bacterial+vaginosis,+and+women's+susceptibility+to+HIV+infection:+epidemiological+evidence+and+biological+mechanisms.">Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms.</a> Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).</li><li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+recurrent+bacterial+vaginosis.">Managing recurrent bacterial vaginosis.</a> Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).</li><li>Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+diagnosing+bacterial+vaginosis+is+improved+by+a+standardized+method+of+gram+stain+interpretation.">Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation.</a> J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).</li><li>Ison, C. A., Hay, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+simplified+grading+of+Gram+stained+vaginal+smears+for+use+in+genitourinary+medicine+clinics.">Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics.</a> Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).</li><li>Money, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).</li><li>Schellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+chaperonin-60+universal+target+as+a+tool+for+determining+microbial+community+composition.">Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).</li><li>Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+diversity+of+the+vaginal+microbiota+in+HIV-infected+and+HIV-uninfected+women+with+or+without+bacterial+vaginosis.">Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis.</a> J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).</li><li>Brotman, R. M., Ravel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready+or+not:+the+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).</li><li>Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres.">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li><li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480:+Application+in+viral+molecular+diagnostics.">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li><li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization.">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li><li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cpnDB:+A+Chaperonin+Sequence+Database.">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li><li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy.">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target.">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

신호 생성의 특이성은 매우 중요합니다, 당신은 신호가 진정되는 유기체에서 발생 amplicon의 검출을 반영 관찰 확신해야합니다. 이러한 PrimerPlex (프리미어 Biosoft)와 같은 소프트웨어는 효율적으로 잡종을 것입니다 프로브를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다,하지만 그들은 나 이외의 대상 종에 간 잡종 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. 범용 PCR primers의이 프로토콜에 설명된대로 사용하면 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide 이름 </td><td> 회사 </td><td> 순서 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, 또는 기타 </td><td> 비오틴 - OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> 비오틴 - OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, phosphorothioate - C, E, phosphorothioate - G, F, phosphorothioate - A, I, 이노신, Y, C 또는 T, R, A 또는 G, K, T 또는 G, S, C 또는 G. </td></tr></tbody></table> 범용 cpn60 PCR에 대한 수정 oligonucleotides의 표 1. 시퀀스. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름</td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 1 - 에​​틸 -3 - (3 - dimethylamiopropyl) carbodiimide HCL (EDC) </td><td> 찌르다 </td><td> 22,980 </td><td></td></tr><tr><td> 형광등 폴리스티렌 비즈 : MicroPlex Microspheres (Luminex) 또는 바이오 플렉스 COOH 비드 (바이오 RAD) </td><td> Luminex 또는 바이오 RAD </td><td> 바이오 방사선 : 171 - 506xxx 엑스 비드 식별자에 해당하는 위치를 </td><td> 자기 구슬이 oligonucleotide 커플링 사용할지고 있으며 특정 이점을 제공할 수 있습니다. 이 작가에 의해 시도되지 않았습니다. </td></tr><tr><td> 캡처 oligonucleotides (5 &#39;아미노산 C12 수정) </td><td> Invitrogen, IDT, 또는 기타 </td><td> 여러 </td><td> Desalted 순도 수준이 허용됩니다. 질 면봉을 특징하는 데 사용되는 캡처 프로브의 시퀀스는이 프로토콜은 13의 기반이되는 원고에 제공됩니다. </td></tr><tr><td> T7exonuclease </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin - R - phycoerythrin (SA - PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S - 866 </td><td> 고순도 SA - PE를 구하는주의, 본 카탈로그 번호 권장합니다 </td></tr><tr><td> Thermowell 96 잘 PCR 플레이트 </td><td> 어부 </td><td> CS006509 </td><td> 96 - 웰 thermocycler 및 BioPlex 기계 모두에 맞게 </td></tr><tr><td> Thermowell 밀봉 매트 </td><td> 어부 </td><td> CS006555 </td><td> 다시 사용할 수 있으며, 비눗물로 씻어도 잘 린스 및 건조 </td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td> 시그마 </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> 바이오 플렉스 또는 Luminex 악기 </td><td> 바이오 방사선 또는 Luminex </td><td> 바이오 방사선 : 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> 프로브 설계를위한 PrimerPlex 소프트웨어 </td><td> 프리미어 Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Luminex 프로브 드를위한 제안다른 소프트웨어 플랫폼을 사용할 수 있지만, 서명 </td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약과 장비. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> μl / 분석 </td><td> μl/100 assays </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 10X PCR 버퍼 (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 50 MM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2.5 </td><td> 250 </td><td> 2.5 MM </td></tr><tr><td> 10 MM dNTP </td><td> 일 </td><td> 100 </td><td> 0.2 MM 각 </td></tr><tr><td> H279BP, 25 μm의 </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 NM </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 μm의 </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 NM </td></tr><tr><td> H280, 25 μm의 </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 NM </td></tr><tr><td> H1613,25 μm의 </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 NM </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 44.5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 수정된 cpn60 UT primers (표 1) PCR을위한 혼합을 제안했다. 분석은 템플릿 DNA와 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 (Invitrogen) 0.5 μl (2.5U) 5 μl에 대해 설정되어 있습니다. 일반적으로 대량의 준비 (100 assays에 대한 충분한 예) 및 -20 ° C.에 저장됩니다

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

세균성 vaginosis (BV)는 Gardnerella vaginalis에, Atopobium vaginae 포함한 세균 종의 숫자에 의해 지배 microbiota에 락토 - 지배와 다른 1-3에서 &quot;정상적인&quot;microbiota에 변화가 특징입니다 되풀이 polymicrobial 증후군이다. 이 조건은 HIV 취득 사를 포함하여 부정적인 건강 결과의 범위와 관련된이며, 그것은 임상 오 관리하기 어려울 수 있습니다. 또한, BV의 진단은 다양한 수치 기준 6,7에 대한 채점 아르 질 면봉 얼룩의 그램 얼룩의 사용에 의존하고 있습니다. 이 진단은 간단하고 저렴하고, 자원 제한 설정에 잘 적합하지만, 그것은 주관적인 해석에 관련된하고 질 microbiota 8 구성에 대한 자세한 프로파일을 제공하지 않는 문제를 고생하실 수 있습니다. 최근 깊은 순서 노력과 함께 풍부하고 다양한 질 microbiota 감을 잡을수있다BV 11,12의 분자 진단에 대한 잠재적인 공격 대상 숫자의 식별 결과가 정상 9,10 간주됩니다 그 개인에 비해 BV 진단 아르 개인에서 가져온 샘플 사이의 명확한 차이. 이러한 연구는 유용한 정보의 부를 제공하지만, 깊은 시퀀싱 아직 임상 설정에서 진단 방법으로 실용적되지 않습니다. 우리는 최근 빠르게 Luminex 플랫폼 13 감지 oligonucleotide - 결합 형광 구슬을 사용하여 멀티 플렉스 형식으로 질 microbiota를 프로 파일링하는 방법을 설명합니다. 이 방법은, 현재 그램 얼룩 기반의 방법처럼 신속하고 간단하지만 프로브 디자인 연구 순서에서 발생하는 분자 지식을 악용의 추가 이점을 추가합니다. 이 방법은 따라서 높은 특이성과 민감도 광고와 BV를 진단하는 데 사용할 수있는 질 면봉에 존재하는 주요 미생물을 프로파일하는 방법을 제공한다세미 양적 및 빠른 방법으로 종의 존재와 풍부한에 대한 추가 정보를 제공하면서 그램 얼룩이 ared. 이 멀티 플렉스 방식은 물론 현재 단일 샘플 14 5 ~ 6 가지 assays 제한됩니다 특히 생물에 대한 현재의 양적 PCR의 assays의 시야 밖으로 확장됩니다. 중요한 것은 방법이 질 면봉에 박테리아의 검출에 국한되지 않고 쉽게 빠르게 관심 거의 모든 미생물 커뮤니티의 프로필에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 최근 폐수 처리 공장에 사용하기 위해 진단 도구의 개발이 방법론을 적용하기 시작했다.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

우리는 oligonucleotide 결합 형광 구슬을 사용하여 샘​​플 내에 미생물의 검출을위한 다양한 방법을 설명합니다. 샘플 내의 모든 생물에서 Amplicon는 프로브 결합 구슬의 패널에 hybridized입니다. Luminex 또는 바이오 플렉스 악기는 비드 타입과 하이브 리다이 제이션 신호를 각 비드를 쿼리하는 데 사용됩니다.

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

multiplex-detection-bacteria-complex-clinical-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K 조회수.  Agriculture and Agri-Food Canada. 우리는 oligonucleotide 결합 형광 구슬을 사용하여 샘​​플 내에 미생물의 검출을위한 다양한 방법을 설명합니다. 샘플 내의 모든 생물에서 Amplicon는 프로브 결합 구슬의 패널에 hybridized입니다. Luminex 또는 바이오 플렉스 악기는 비드 타입과 하이브 리다이 제이션 신호를 각 비드를 쿼리하는 데 사용됩니다.

비디오: Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to the best of these authors' knowledge, no method has been developed to allow for the in situ visualization of the 
bacteria in histological sections.
While bacterial localization has been determined in vivo in previous studies using plate counts 3, radiometric labeled 4, 
or bioluminescent bacteria 5, most of these studies have only been performed at the gross organ level, with one exception 6. This limitation 
is of particular concern because E. ictaluri has a complex infection cycle 1,7, and it has a variety of virulence factors 8,9. 
The complex interaction of E. ictaluri with its host is similar in many respects to Salmonella typhi 10, which is in the same taxonomic family.
Here we describe a technique allowing for the detection of bacteria using indirect immuno-histochemistry using the monoclonal Ed9 antibody described by Ainsworth et al.11.
Briefly, a blocking serum is applied to paraffin embedded histological sections to prevent non-specific biding. Then, the 
sections are incubated with the primary antibody: E. ictaluri specific monoclonal antibody Ed9. Excess antibodies are rinsed away and the FitC 
labeled secondary antibodies are added. After rinsing, the sections are mounted with a fluorescent specific mounting medium. 
This allowed for the detection of E. ictaluri in situ in histological sections of channel catfish tissues.

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Here we describe a procedure allowing the labeling of Edwardsiella ictaluri in situ in histological sections from channel catfish Ictalurus punctatus using indirect immunohistochemistry with monoclonal antibodies Ed9 as a primary, and fluorescent FitC labeled antibodies as a secondary. This allowed for the detection of the bacterium using fluorescent microscopy.

의 검출을위한 형광 단백질 화학의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기에 ( I. punctatus) 샘플

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

임상 항체 샘플 Phagocytic 활동 결정

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

16S rRNA의 타겟팅 디곡신 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

사용 환경 샘플에서 새로운 Faustoviruses의 분리에 대한 신속한 전략<em&gt; Vermamoeba의 vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

타액 항체 멀티 플렉스 면역을 개발하는 것은 환경 병원체의 인체 노출을 측정하는

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.