우리는 유용한 토론 MPIMP에서 RIKEN PSC 박사 Bjoern Usadel에서 교수 카즈키 사이토 감사드립니다. TT는 알렉산더 폰 훔볼트 재단의 화목에 의해 지원됩니다.

1. 샘플 준비 <ol><li> 식물 재료는 수확 즉시 냉동있다. </li><li> 냉동 식물 재료는 -80 ° C.에 믹서 분쇄기에 의해 가루 (또는 절구)와 팔콘 튜브 또는 Eppendorf 튜브에 저장됩니다 </li></ol> 2. 신진 대사 프로파일을위한 추출 <ol><li> 나누어지는는 2 ML Eppendorf 튜브에 식물 재료 냉동. </li><li> 냉동 식물 소재의 신선한 무게 밀리그램 당 추출 버퍼의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 25인가 -1에서 2 분 믹서 밀 하나의 금속 (또는 gilconia) 볼을 넣고 냉동 분말의 homogenize. </li><li> 12,000 rpm으로 10 분 원심 분리기. </li><li> 원심 필터를 NANOSEP하기 뜨는을 전송합니다. </li><li> 4,000 rpm으로 2 분을 원심 분리기. </li><li> 사용할 때까지 -20 ° C에서 새로운 Eppendorf 튜브, 그리고 저장소로 뜨는을 전송합니다. </li></ol> 3. LC-MS에 의한 신진 대사 프로 파일링 <ol><li> HPLC를 설정하고 열 오븐 및 샘플 트레이의 온도를 확인. </li><li> MS 조건을 설정하고 진공과 가열 모세관의 상태를 확인합니다. </li><li> MS 검출기의 M / Z 보정을 수행합니다. </li><li> LC-MS에 대한 추출물의 50 μl의 유리관에 전송합니다. </li><li> LC-MS에 추출물의 5 μl를 주입. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> Xcalibur 또는 Metalign 4를 구성하고 처리하는 데이터 분석을 선택합니다. </li><li> 표 봐도에서 화합물 클래스에 따라 귀하의 관심 감지 봉우리의 테이블을 준비합니다. </li><li> 표준 화합물의 공동 용출하여 봉우리를 식별합니다. </li><li> 주석은 MS이 분석, 문헌 조사, 신진 대사 데이터베이스를 검색합니다 (그림 2, 12,13)를 사용하여 봉우리를 발견했습니다. </li></ol> 5. 대사 경로의 예측 <ol><li> 검색된 화합물로 가능한 통로를 구축. 피크 주석을 사용하여 경로의 예측은 검색된 화합물의 화학적 구조에 기초해야대사 경로 13 효소 기능을 연결하는 예측하여의. 구조화 biosynthetic 단계는 정확한 피크 주석과 함께 실시되어야한다. 설탕 잔기와 adducted 위치 예측은 MS 분석에 의해 파악하는 것은 매우 어렵기 때문이죠 그러나 세부적인 화학 구조의 결정은, 예를 들어 설탕 잔기에 대해이 단계에서 필수가 아닙니다. 이러한 hexoside 및 pentoside 같은 설탕 유형의 결정은 프로젝트의 마지막 단계에서 설탕 기증자의 효소 분석에 의해 식별됩니다. 대부분 경로의 예측 건설은 작은 분자 같은 탈수 반응과 같은 일부 경우를 제외하고 큰 분자의 중간 그대로 수행해야합니다. 예를 들어 원자 분자량 목록, 16-H 사이의 차이에 대한 M / Z 및-OH 잔기 (산화), 14 M / Z (탄소 원자) 차이에 대한간에-OH 및-OMe (methylation)와 162m / Z ( hexose (글리코 실화)에 대한 MW-H 2 O)를 예측하는 데 유용합니다. 의 결정조직의 specificities의 상관 분석과 수정 유형은 대사 경로의 예측을하는 데 도움이됩니다. 이러한 KEGG 데이터베이스 (같은 일반적인 대사 경로의 데이터베이스 <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> )와 PlantCyc은 ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> )에 관심의 대사 경로의 예측에 매우 효과적입니다. </li></ol> 6. Arabidopsis Orthologous 유전자 ID를 가진 유전자 목록의 작성 <ol><li> 게놈 데이터베이스로부터 유전자의 ID 목록을 다운로드합니다. </li><li> , orthologous 유전자의 Arabidopsis 유전자 ID를 추가하여 타겟 공장의 경우 Arabidopsis 않습니다. </li><li> 귀하의 통로 -의 - 관심 유전자의 목록을 준비합니다. Arabidopsis 경로 데이터와 유전자 가족 데이터의 해설 테어 웹사이트 (에서 사용할 수 있습니다 <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). 당신은 Arabidopsis orthologous 유전자의 목록을 준비하면 이후 combi 수NE 그들. </li></ol> 7. 공동 표명 유전자 분석 <ol><li> 귀하의 통로 -의 - 관심 (표 II)에서 잘 알려진 유전자 쌍을 사용하여 상관 관계를 선택하여 경로에 대한 최고의 데이터베이스를 검색할 수있는 준비된 유전자의 ID 목록을 사용하여 테스트합니다. 공동 표현식 데이터베이스 또는 유전자 발현 데이터베이스가 여러분의 흥미에 공장에서 사용할 수없는 경우, Arabidopsis 공동 식은 데이터베이스는 Arabidopsis orthologous 유전자의 목록을 사용해야합니다. 보리의 경우, 쌀, 포플러, 밀, medicago와 대두, 식물 종의 공동 발현 분석 (표 II) 사용할 수 있습니다. </li><li> 귀하의 통로 -의 - 관심 잘 알려진 유전자의 연결을 기반으로 타겟 공동 표현식 네트워크 프레임 워크를 구축. </li><li> 서로 관련 후보 유전자 (귀하의 통로 -의 - 관심 잘 알려진 유전자의 연결 사이의 계수 가치의 대략적인 값 내에서 R &lt;0.4 ~ 0.90) 추가 및 홍보에 자신의 유전자 주석을 확인최상의 후보 유전자 (그림 3)을 찾는이 네트워크 연결에 edicted 가족. 계수 값의 임계값을 서로 관련 유전자의 네트워크 구조와 밀도에 따라 조정되어야한다. </li><li> 당신의 대상 경로에 대한 전문적인하다고 좁힐 수있는 유전자의 목록을 확인하십시오. </li><li> 당신의 후보 유전자의 장기 specificities 및 스트레스 반응의 유전자 발현을 확인합니다. </li></ol> 8. 새로운 경로를 예측하는 모든 정보의 통합 <ol><li> 예측 대사 경로에 공동 표현 분석의 쿼리에 사용되었습니다 잘 특징 유전자를 추가합니다. </li><li> 이 경로에 uncharacterized 부분을 확인, 예를 들어 효소 단계, 수송 단백질과 전사 요인을 uncharacterized. </li><li> 이러한 누락 uncharacterized 단계를 위해 가장 적합한 유전자 주석을 예측. </li><li> silico GE에의 신진 대사 프로 파일링 및 후보 유전자의 결과를 결합NE 표현은 예측 경로를 기반으로. </li><li> oxidised 화합물에 대한 P450, 사이드위한 acetylated 신진 대사, glycosyltransferase위한 acetyltransferase 예를 들어 유전자 기능에 따라 예측된 경로, 귀하의 후보 유전자를 마련. 아미노산 시퀀스의 Phylogenetic 트리 분석은 P450과 glycosyltransferase과 같은 몇 가지 다양한 유전자 가족을 위해 유용합니다. </li><li> 신진 대사 축적 및 후보 유전자의 유전자 발현 수준 간의 조직 specificities이나 스트레스 응답의 일관성을 확인합니다. </li><li> 기판 및 스트레스 반응 유전자를 제공하는 다른 신진 대사에 대한 연결을 확인합니다. </li></ol> 9. 바이오 자원을 이용한 유전자 식별을위한 실험 <ol><li> 후보 유전자 식별을위한 실험의 촉진을위한 bioresources의 가용성을 확인합니다. </li><li> 같은 KO 돌연변이 라이브러리 및 전체 길이 cDNA 라이브러리 등 바이오 자원을 이용한 유전자 기능의 식별을위한 실험을 수행합니다. 티overexpression의 식물과 한방의 돌연변이, 효소 분석 및 발기인 구속력 분석의 준비와 유전자의 기능 확인을위한 그 실험은, 당신의 예측에서 가장 좋은 후보 유전자에 대해 수행되어야한다. 단백질 속성의 특성화 및 그 변혁을위한 재조합 단백질 및 유전자의 복제를 준비하는 데 상당히 오래 걸리기 때문에 KO 돌연변를 사용하여 신진 대사 프로필을 확인 후 진행해야하는 가장 좋은 overexpression 공장의 준비를위한 재조합 단백질 분석. </li></ol> 10. 대표 결과 이 프로토콜에서 설명하는 통합 분석의 절차는 지정된 실험 목적 및 생물 학적 및 분석 조합의 선택에 따라 많은 가능성을 가지고 있습니다. 절차 및 실험 설계의 선택은 대상 경로, 화합물과 식물 종의 기초로 제대로 진행해야한다. 이 프로토콜에 설명된 통합 전략은 foc입니다<html> 여러 바이오 및 데이터 자원의 효율적인 사용과 식물 유전자 기능과 새로운 유전자 기능의 발견 주석에 사용됩니다. 예상 결과는 결정적인 예측의 유일한 케이스를 제공하겠다고 약속한다. 이 사실은 충분한 증거가 조합 프로파일에 의해 주어질 수 없다면 실험이 시작하지 말아야함을 나타냅니다. 이러한 이유로, 어떠한 경우에 RT-PCR에 의한 이러한 타겟 유전자 발현 프로 파일링 같은 추가 예비 실험, 유전자 기능의 예측을 지원할 수 있습니다. 예측의 정확도와 정확성이 높은 조합의 유사 콘텐츠의 질적 차이와 수에 따라 연결합니다. 또한, 좋은 후보자 및 유효한 결과는 경로의 정확한 예측에서 온 수 있습니다. 피크 주석은 예제 문헌 조사, 참고 식물 추출물, MS N 분석, 장기 특이성 및 돌연변이 분석 13 여러 방법의 조합에 의해 실시되어야한다. 1 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg &quot;/&gt; 1 그림. 통합 접근 방식을 통해 유전자 주석의 실험 흐름의 개요. 어떤 경우에는 프로젝트는 특별한 조건이나 조직에서 발견되는 소설 피크하며, 신진 대사 내에서 그 역할을 이해하고자하는 욕구의 발견과 함께 시작합니다. 다른 경우에는 프로젝트의 목적은 이러한 전사 인자와 같은 주요 규제 요인 유전자 식별하거나 발견이다. 실험 설계는 여러 기관에서 조직 샘플의 광범위한 사용하여 대상 경로의 신진 대사 단계의 명확한 차이를 보여주는 데이터 세트와 함께 계획이었습니다, 그리고 스트레스 조건에 노출 differentially 재배 식물이나 식물과에 자료를 쓰는해야 신진 대사 프로 파일링. 돌연변이와 유전자 변형 식물뿐만 아니라 QTL 은닉 번식 재료는 또한 이러한 연구에 적합한 유전 물질을 나타냅니다. 소설 경로의 예측은 정확로 신중하게 수행되어야이러한 여러분의 통로 -의 - 관심 유전자 발현 자료에 따르면 장기 증권 및 스트레스 반응 등 metabolotype의 다른 유형 피크 주석과 조합 방식. 마지막 단계에서, 신진 대사 및 성적표 프로파일은 결국, 웹 자원의 silico 분석과 heterologous 표현을 통한 유전자 발현의 체외 특성화에 결합하면, 그 함수의 유전자 후보와 해설의 확인을 가져다 줄 수있는 수행하여야한다 그리고 대사 경로 내의 위치. 약어 : QTL, 양적 특성의 Loci. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" /> 그림 2. 피크 해설을 위해 조합 접근법의 흐름을 작동합니다. 피크 식별 및 주석 표준 화합물에 의한 야생 유형의 비교 및 뮤턴트를 내라을위한 절차, 대상 최고의 다차원 질량 분광법은 순수 com의 질량 스펙트럼을 나타내는데이터베이스를 12 파운드. 약어 : DB, 데이터베이스, 펀치 노크 아웃, 1-D, 한 차원, 2 차원, 2 차원, NMR, 핵 자기 공명, 적외선, 적외선, MS N, 대량 양산 spectrometries. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" /> 그림 3. anthocyanin 경로의 예 공동 규제 네트워크 분석. Coexpression 분석은 프라임 (를 사용하여 수행되었다 <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> 3 개 8,2 ATTEDII 버전의 설정 데이터를 기반으로)을 Pajek 프로그램 ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). 긍정적인 상관 관계는 (R &lt;0.5) 네트워크 연결을하기 위해 사용됩니다. 레드 노드 : 열두 anthocyanin 효소 유전자 (At5g13930, CHS, TT4, chalcone의 synthase; At3g55120, C안녕, TT5, chalcone isomerise; At3g51240, F3H, TT6, flavanone 3-hydroxylase; At5g07990, F3&#39;H, TT7, 플라 보노이드 3&#39;-hydroxylase; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, 플라 보노이드 3 - O-glucosyltransferase, At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol 환원 효소, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, anthocyanidin synthese; At4g14090, A5GT, anthocyanin 5 - O-glucosyltransferase, At5g54060, A3G2 &quot;XT, putative anthocyanin 3 - O-glucoside 2&quot;- O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, anthocyanin 5 - O-glucoside 6 &#39;&#39; &#39;- O-malonyltransferase, At1g03940, A3GCouT, anthocyanin 3 - O-glucoside 6 &quot;- O - P-coumaroyltransferase) 및 anthocyanin 생산을위한 두 전사 요인 (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2)는 후보 유전자를 찾기 위해 사용되었다 R의 계수와 임계값과 후보 유전자가 &quot;세트의 교차로&quot;에 의해 발견된 검색 &lt;./ 그들이 쿼리 모든 유전자 (천 anthocyanin의 biosynthetic 유전자)에 의한 집합의 교차에 의해 쿼리 0.50을보기 &gt;&gt;. 서로 관련 후보 유전자 (68 유전자)와 쿼리 유전자 (14 유전자)를 포함하여 공동 표현식 네트워크, R&gt;는 0.50이 국회베이스를 이용한 &quot;세트의 상호&quot;에 의해 다시 만들어진 검색했습니다. 프라임 데이터베이스 및 네트워크에서 &#39;. NET&#39;파일과 함께 서식이 있었다 출력 파일은 Pajek 소프트웨어를 사용하여 그립니다. 파란색 노드는 anthocyanin의 유전자와 상호 후보 유전자를 나타냅니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 종 </td><td> 주요 신진 대사 보조 </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolate, flavonol, anthocyanin, sinapoyl 유도체 </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonol, anthocyanin, 살리실산 유도체 </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonol, anthocyanin, 탄닌, stilbene </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonol, anthocyanin, glycoalkaloid는 관련 chrologenate, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum의 </td><td> Flavonol, anthocyanin, nicotianamide, acylsugar를 관련 chrologenate </td></tr><tr><td> Oryza sativa 로구나 </td><td> Glycoflavone, anthocyanin, 스테롤 유도체 </td></tr><tr><td> Zea 년 5 월 </td><td> Glycoflavone, anthocyanin, benzoxazinone, 스테롤 유도체 </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> 아이 소플라본, anthocyanin, 사포닌, </td></tr><tr><td> japonica 로터스 </td><td> 이소플라본, flavonol, anthocyanin, 사포닌, </td></tr></tbody></table> 모델 식물 수종의 표 전 주요 보조 metabolites. <table border="1"><tbody><tr><td> 공동 표현 데이터베이스 </td><td> 주소 </td></tr><tr><td> 공장 교차 사양이거야 </td><td></td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> 행성 </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> 식물 종 </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> 바 </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> 주문 </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> 프라임 </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa 로구나 </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> 쌀 배열 데이터베이스 </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> 표 II. silico 공동 발현 분석에 사용할 수있는 유전자 발현 데이터베이스.

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	<li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays.">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li><li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMe:+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics.">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li><li>Araujo, W. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+storage+metabolome:+profiling+the+barley+vacuole.">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li><li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis.">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

transcriptomics 및 metabolomics 기술이 몇 년 동안 사용되었음을 감안할 때, 유전자 주석을 도와 주었던 metabolomics를위한 데이터 통합​​의 과정은 일반적으로 알려지지 않은 신진 대사를 대표하는 소설 최고의 식별로 시작합니다. 이 사실은 신진 대사 봉우리의 양적 분산 또는 생합성 대한 책임 것으로 생각 소설 후보 유전자를 평가하는 것입니다 다음 단계로 이어집니다. 이 프로토콜에 설명된 전략은 그러나, 세 가지 주요 문제 I) 피크 주석의 어려움, II) 경로 예측의 복잡성, 3) 유전자 발현 데이터의 유전자 정보와 품질의 해상도를 가지고 있습니다. 첫 번째 문제를 대응하기 위해, 최대 주석은 표준 물질 또는 MS N 분석, 참조 추출물, 돌연변이 분석, 신진 대사 데이터베이스 검색 및 문헌 조사 (그림 2, 12)의 조합적인 접근 이용한 정보의 공동 용출과 함께 진행되어야한다. s에 대한econd 문제는 경로 예측은 정확 피크 주석에 의해 얻을 수 있습니다. 신진 대사 축적이 관련 유전자의 유전자 표현과 상호되어야하지만,이 조직 특이성의 신진 대사 프로 파일링 또한, 지원 피크 주석이 될 수 있습니다. 따라서 다른 조직과 성장 조건의 조합 프로파일이 두 번째 문제에 대한 도움이 될 수 있습니다. 유전자 정보의 해상도에 관한 세 번째 문제는 시퀀스 데이터의 진행에 따라 달라집니다. 게놈 시퀀스를 완료하지 않고 모델 식물의 경우에는 다른 모델 식물에서 orthologous 유전자를 사용하여 공동 표현 분석에 유용합니다. 아미노산 서열에 대한 상세한 정렬 비교 및​​ phylogenetic 트리 분석은 다른 수종에 모형 유기체를 연결하는 데 지원할 수 있습니다. 이 프로토콜은 모든 신진 대사에 적합합니다. 그것은 잘 강력한 transcriptional C의 대상이 될 특징 중급 및 보조 신진 대사의 분석에 가장 효율적인ontrol 1,5,11,16. 몇 가지 예제, 유황 동화에서 수행되어야 성공한 공동 발현 분석, β-산화, 측쇄 체인 아미노산 저하, 엽록소 분석하고, 라이신 catabolism 3에 대한 유전자, 세포 벽 대사 10,7 및 계단식 14 신호 빛합니다. 통합 유전체학, metabolomics 및 정보학을 통한 유전자 기능의 해설 전사 인자의 biosynthetic 유전자와 직접적인 조절을 위해뿐만 아니라 생리적 과정과 반응을 이해하는 데뿐만 아니라 (예를 들어 그림 3. 14 참조). 모델 식물에서 작물 종에 대한이 접근법을 개발하기 위해 식물 종 전체의 신진 대사 비교는 몇 가지 일반적인 신진 대사의 강력한 접근이다. 동일한 화합물이 다른 식물 종으로 감지하고, 경우 예를 들어, 일부 orthologous 유전자 이러한 식물 수종에서 발견되며, orthologous 유전자를 사용하여 크로스 종 공동 표현식 분석 stron에게 제공할 수 있습니다당신의 예측을위한 g 지원. 이 접근법은 이외에 포플러, medicago, Arabidopsis에서 수행할 수 같은 식물 종의 공동 발현 분석 (6, 플래닛에 의한 보리, 쌀, 밀과 대두 등 중요한 작물 : <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . 드 /</a> ; 9, COP : <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/가</a> ;) 15 예제를 참조하십시오.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 증류수 ULC / MS 마치고 </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acetonitrile (ACN) ULC / MS 학년 </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> 메탄올 (MeOH) ULC / MS 학년 </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> 액체 크로마 토그래피를위한 개미의 산성 (HCOOH) ULC / MS 학년 </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> 표준 화합물 </td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td> 선형 이온 트랩 (IT) ESI-MS 시스템 FINNIGAN-LTQ </td><td> 써모 Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC 시스템 서베이 </td><td> 써모 Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> C18 분석 칼럼 루나 (2), 2.0 밀리미터 직경 150 밀리미터 길이, 100의 기공크기가 3 mm의 구형 입자 </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur 소프트웨어 </td><td> 써모 Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics

전체 게놈 시퀀스를 사용할 수있는 등 한방의 돌연변이, 야생 accessions 및 고급 번식 집단 등의 바이오 자원을 풍부하게하는 모델 식물 종의까지 확대 수를 감안할 때, 유전자의 기능적인 해설을 위해 상승 부​​담이 있습니다. 이 프로토콜에서는 결합된 공동 발현 유전자 분석을 이용한 식물 유전자 기능의 주석은, metabolomics 및 정보학은 (그림 1) 제공됩니다. 이 접근법은 metabolomics 통해 목표 화합물의 신분으로 특정 대사 과정에 참여하지 않은 주석이 유전자의 식별 가능성이 허용하는 것으로 알려진 함수의 대상 유전자를 사용하여 이론에 근거한다. 전략은 손쉽게있는 이들 없음에도 불구하고 모두 순방향 및 역방향 유전자 접근 방법에 의해 생성된 인구에서이 정보를 적용하기위한 개진하고 있습니다. 추론으로이 접근법은 또한 신규 또는 특정 SE를 나타내는 미지의 봉우리를 특성화하는 방식으로 사용할 수 있습니다제한된 조직, 식물의 종 또는 현재 식물의 신진 대사를 이해하는 중요한 시험이다 스트레스 치료에서 condary metabolites.

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Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

신진 대사를 통해 유전체학, 공동 발현 유전자 분석 및 대상 화합물의 식별의 조합은 유전자 기능 주석을 제공합니다.

결합 지노 믹스, Metabolomics와 정보학 통해 식물 유전자 기능의 주석

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K 조회수.  Max-Planck-Institut. 신진 대사를 통해 유전체학, 공동 발현 유전자 분석 및 대상 화합물의 식별의 조합은 유전자 기능 주석을 제공합니다.

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

연구

생물학

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

β - glucuronidase (거스)을 기반으로 세포를 파괴 분석

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

커튼에서 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 분석

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

형광 현미경으로 Stromule 주파수를 시각화

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

mirMachine: A One-Stop Shop for Plant miRNA Annotation

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of gene expression, miRNAs play key roles in various cellular pathways, including both development and response to a/biotic stress, such as drought and diseases. Having high-quality reference genome sequences enabled identification and annotation of miRNAs in several plant species, where miRNA sequences are highly conserved. As computational miRNA identification and annotation processes are mostly error-prone processes, homology-based predictions increase prediction accuracy. We developed and have improved the miRNA annotation pipeline, SUmir, in the last decade, which has been used for several plant genomes since then. 
This study presents a fully automated, new miRNA pipeline, mirMachine (miRNA Machine), by (i) adding an additional filtering step on the secondary structure predictions, (ii) making it fully automated, and (iii) introducing new options to predict either known miRNA based on homology or novel miRNAs based on small RNA sequencing reads using the previous pipeline. The new miRNA pipeline, mirMachine, was tested using The Arabidopsis Information Resource, TAIR10, release of the Arabidopsis genome and the International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC) wheat reference genome v2.

Herein, we present a new and fully automated miRNA pipeline, mirMachine that 1) can identify known and novel miRNAs more accurately and 2) is fully automated and freely available. Users can now execute a short submission script to run the fully automated mirMachine pipeline.

미르머신: 식물 miRNA 주석을 위한 원스톱 상점

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

BIFC-FRET-FLIM 분석체에 의한 MADS 박스 전사 계수의 두 단백제와 칼슘 센서 단백질 간의 삼자 상호 작용 결정

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.