더 많은 인구를 조사하는 것은 기계 중심의 변형과 함께 이루어지며, 이로 인해 실제 변동은 자연 다양성에서 비롯됩니다. 여기서는 다운스트림 통합 분석을 위한 기술적 변동을 줄이는 방법을 시연합니다. 이 기술의 장점은 얼굴 분리 기반 추출을 포함하며, 각 분석 플랫폼에서 다양한 대사 산물의 분석을 제공하면서 전신 오류를 제거하고 생물학적 분산을 유지합니다.
일단 유전자형 및 표현형 정보가 얻어지면, 이 방법은 모든 생명의 왕국에 있는 임의의 다양한 자연 집단에 적용될 수 있다. 20 밀리리터 수확 튜브를 시작하려면 튜브를 균질화하고 라벨을 붙이기 위해 두 개의 다섯 밀리미터와 두 개의 여덟 밀리미터 직경의 금속 비드를 추가하십시오. 이어서, 액체 질소로 탈전을 채우고, 수확 직후 신선한 잎 및 뿌리 조직 샘플을 액체 질소로 절단하여 플래시 동결시킨다.
추가 처리를 위해 수확된 생물학적 샘플을 섭씨 80도에 보관합니다. 튜브 홀더를 액체 질소로 미리 냉각하십시오. 다음으로, 조직을 25 헤르츠에서 1분 동안 분쇄하여 균질한 분말을 얻었다.
동결을 반복하고, 조직이 균질하게 분쇄되지 않은 경우 분쇄하십시오. 50밀리그램의 신선한 식물 재료를 미리 냉각된 라벨이 붙은 두 밀리미터 안전 잠금 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 계량 공정 중에 식물 재료가 동결된 상태로 유지되도록 합니다. 1 밀리리터의 미리 냉각 된 추출 혼합물 1 ~ 50 밀리그램의 분취량을 샘플에 첨가하고, 얼음 위에 보관하기 전에 튜브를 잠깐 와류하십시오.
샘플을 섭씨 네 도에서 10분 동안 800배 G의 궤도 진탕기 상에서 인큐베이션하고, 이어서 10분 동안 빙냉식 초음파 처리 욕조에서 초음파 처리하였다. 다채널 피펫을 사용하여 500 마이크로리터의 추출 혼합물도 샘플에 첨가하고, 간단한 볼텍싱으로 추출물을 혼합한 다음, 혼합물을 섭씨 4도에서 5분 동안 11, 200회 G에서 원심분리한다. 원심분리 후, 분리된 상부 지질 함유 상 500 마이크로리터를 미리 표지된 1.5 밀리리터 세이프 락 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 나머지 상부 상을 제거하였다.
분리된, 1.5 밀리리터 세이프 락 마이크로원심분리 튜브는 150 마이크로리터의 하부 반극상 네 GCMS 및 300 마이크로리터의 반극상 네 U-H-P-L-C MS 분석을 전달한다. 용매 증발을 위해 진공 농축기를 사용하여 가열하지 않고 추출된 모든 분획을 농축하고 건조된 분획을 섭씨 20도에 저장한다. 초고성능, 액체 크로마토그래피, 질량 분광법, 또는 H-P-L-C MS용 샘플을 제조하기 위해 건조된 반극성 분획을 메탄올과 물의 혼합물 180 마이크로리터에 재현탁시킨다.
이어서, 반극성 상을 2분 동안 초음파 처리하고, 1분 동안 11, 200배 G에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 90 마이크로리터의 상청액을 유리 바이알로 옮기고 두 마이크로리터의 추출물을 부은 LCMS 샘플에 주입한다. 섭씨 40도에서 유지되는 역전 상 C18 컬럼에서 대사산물 분획화를 수행하고, 유출물 A 및 B의 점진적인 변화로 분당 400 마이크로리터의 유동을 수행하고, 102,1500 질량 대 전하 비율의 질량 범위를 갖는 음성 이온화 모드에서 시험 블랭크 및 품질 관리 샘플의 질량 스펙트럼을 획득한다.
반극성 대사산물 샘플의 경우, 음성 및 양성 이온화 모드에서 데이터 의존적 탠덤 질량 분광법에서 풀링된 QC 샘플을 실행합니다. 얻은 질량 스펙트럼을 주석에 사용하십시오. 내부 표준의 분포를 확인하여 데이터 집합의 정규화를 수행합니다.
단일 또는 다중 내부 표준의 신호를 수정하여 데이터를 정규화합니다. 다음으로, 크로마토그램으로부터 수득된 피크 강도를 정확한 샘플 중량에 걸쳐 보정한다. 다중 배치 시리즈에서 강도 드리프트를 보정하려면 R.게놈 전체 연관 연구 또는 GWAS를 수행하기 전에 R.을 사용하여 국부적으로 추정된 산점도 평활화와 같은 QC 기반 보정 방법을 수행하고, 5% 미만의 작은 대립유전자 빈도 및 10% 이상의 누락률에 대한 유전자형 데이터를 필터링합니다.
이렇게 하면 저주파 바이어스를 피할 수 있습니다. 환경 요인으로부터 기인하는 편향을 제거하려면 R 패키지 LME four를 사용하고 실험 반복을 통해 정규화된 각 특징에 대해 최상의 선형, 편향되지 않은 예측 또는 블롭을 계산합니다. R.The 여러 일반적인 콩 종에 걸친 지질 데이터는 서로 다른 배치에서 두 QC 샘플의 원시 염기 피크 크로마토그램을 기반으로 표시됩니다.
신호 강도의 변동이 특정 지질 부류에 대해 관찰되었다. 체계적 오류는 원시 데이터에 대해 주성분 분석이 수행되었을 때 더욱 분명해졌습니다. 국부적으로 추정된 산점도 평활화를 포함하는 정규화 절차는 QC 샘플의 클러스터링으로 이어졌다.
개별 클러스터로 해부할 때, 일곱과 여덟 개의 배치에서 기계 구동 오류가 정상화되기 전에 명확해졌고, 이는 수정되었다. 정상화 후 형질전환된 개별 대사체 클러스터를 GWAS에 사용하였고, 여러 형질 마커 연관성을 산출하였다. 대표적인 분석에서, 상이한 화합물 클래스는 상이한 색상으로 강조 표시되고, 다수의 화합물 클래스와 연관된 마커는 그의 가장 가까운 유전자로 표시된다.
데이터 정규화 및 변환은 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 시스템 오류를 수정하고 분포의 정상성을 보장하기 위해 적절한 수정이 수행되었는지 확인하십시오. 분석 변이에 대한 보정을 수행함으로써, 대사 상관 분석 및 표현 데이터로의 통합과 같은 몇 가지 통합 접근법을 수행하여 복잡한 특성을 밝힐 수 있습니다.
