저자가 도움이 덧글에 대한 박사 알리스 테어 Garratt을 (최대 Delbrück 센터, 베를린) 감사하고 싶습니다. 이 작품은 독일 연구 협회 (DFG)의 공동 연구 센터 (SFB665)에 의해 지원되었다.

1. 해부 절차 참고 : 마우스의 실험적 사용이 공식적으로 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 지침을 승인 따라야합니다. <ol><li> 준비하기 전에, 해부 현미경을 설정하고 집게를 (내부 - 광택 조언을 두 중) 해부 크고 작은 가위, 큰 톱니 포셉, 곡선 포셉 및 뒤몽 제 5의 4 세트를 포함하여 해부에 필요한 수술 도구를하다 ( 자세한 내용은)는 특정 시약 및 장비의 테이블을 참조하십시오. 100 mm Sylgard - 코팅 배양 접시에있는 필터 종이를 놓습니다. 12 잘 판, 100 mm 페트리 접시와 12 ML 관의 우물에서 차가운 PBS를 붓고 얼음을 두십시오. 얼음 두 번째 12 잘 플레이트와 장소의 각 우물에 고정 버퍼의 피펫 2ml (PBS, pH를 7.4에서 4 % paraformaldehyde). </li><li> anesthetization 후, E12.5 (질 플러그 감지 E0.5로 지정)에 초과 임신 댐을 희생, 마우스를 장소세 종이 수건의 시트 및 70 % 에탄올로 복부 영역을 흡수에 미치는 복부 측면까지 함께. </li><li> abdominopelvic 구멍을 열고, 양국 자궁 뿔을 분리하고 차가운 PBS로 100 mm 요리 중 하나에 그들을 전송합니다. </li><li> 미세한 통제, 소형, 바로 가위로 이번에는 질 벽에의 세로 절개를하고 태반에서 각 amniotic SAC 버려야. </li><li> 벗겨내는 amniotic 각 배아에서 SAC와 탯줄은 자르고. </li><li> 작은 가위를 사용하여 배아를 참살하고 genotyping가 필요해야하는 경우 게놈 DNA의 격리를 위해 별도로 머리 또는의 일부를 넣어. 그 후, 차가운 PBS로 12 잘 판의 각 우물에 torsi을 전송. </li><li> PBS 몇 방울로 Sylgard 접시에 필터 용지를 습식 및 종이의 지느러미 측면과 배아 몸통을 위치. 더 나은 안정성을 위해, 시체에서 떨어진 꼬리와 사지를 펴. </li><li> 일하는약 16X의 확대와 해부 현미경, 신중하게 좋은 밀고 집게의 두 쌍이있는 척수 위의 배아의 피부를 꼬집어 부드럽게 그것을 갈가리 찢어. 중간에부터 꼬리 방향으로 첫째 진행 후 앞쪽에 편으로의 중간에서 다시 시작. </li><li> 건조하지 않도록 PBS의 두세 방울과 함께 수시로 배아가 젖었어. </li><li> 그것이 내부 - 광택 팁을 벌금 포셉의 날개와 수평 슬라이딩 운동에 의해 주변의 연골이 척추 칼럼에서 DRG와 척수를 분리 배아에서 제거됩니다 때 DRG를 방지하기 위해이 척수에서 출발 시끄러운 쓰레기 오토바이 경찰입니다. 배의 오른쪽 가운데에 시작, 앞쪽에 끝에 다음 꼬리쪽으로 길을 작동합니다. 그 후, 반대편에있는 절차를 반복합니다. 관련 DRG를 다 뜯어내고하지 않도록주의하십시오. </li><li> 배아에서 완전히 느슨하게 척수를 분리하려면 해당 cervic 데리러야외 미세 집게로 부분과 꼬리 끝 부분 한 조각에서 빼낸다. </li><li> 분리된 척추 고정 버퍼 가득 12 - 음 판의 우물에 첨부 DRG와 코드와 남은 배아에서 척수 코드의 준비와 진행 잠수함. </li><li> 척추 코드에게 얼음에 적어도 두 시간을 수정. </li></ol> 2. DRG의 뉴런의 DiI - 라벨링 <ol><li> 표시되는 각 척수 들어, micropipette를 끌어당기는 두 개의 유리 바늘을 준비합니다. ..., 2 열 = 600 벨 = 25 시간 = 175, 3 열 = 630, 벨 = 1 열 = 625, 벨 = 35 시간 = 175 : 우리는 셔터 모델 P - 97 전극 풀러 (프로그램 설정을 사용 30 시간 = 150). </li><li> 미세한 통제하에 3-5 시간은 에탄올에 DiI의 5 % (W / V) 솔루션의 각 유리 바늘의 끝부분을 찍어. 에탄올의 증발은 바늘에 DiI 크리스털의 얇은 레이어를 만듭니다. </li><li> 약 40x의 배율과 해부 현미경 작업, 그 V와 척수를 배치슬라이드에 entral 측면까지. 스프링 가위를 사용하여 나중에 (섹션 C를 참조) 거꾸로 개방 책 모드에서 준비 장착 있도록 floorplate을 통해 절단하여 전체 길이의 복부 측면에있는 코드를 엽니다. </li><li> 슬라이드에 지느러미 측면과 척수를 놓습니다. 그런 다음 수동으로 미세한 시각화에서 유리 바늘의 DiI 덮인 팁 및 척수의 한쪽 신중하게 피어스는 매초마다 DRG와 코드를 접근한다. DiI의 거의 흔적은 뉴런만이 소수의 라벨을 보장하기 위해 뚫었 DRG에서 볼 수 없습니다. 코드의 다른 측면에 대한 두 번째 바늘을 가져가라. 단 매초 DRG를 목표로하는 것은 개별 axons의 차별 복잡 수도 인근에서 DRG 분류 axonal 계획의 중복 방지. </li><li> 최소한 6 주위 온도에서 시간 또는 4 하룻밤 동안 짙은 어둠 속에서 고정 버퍼와 부화 척수를 반환 ° C가 디로 염색 시간을주고플라즈마 막 내의 축삭을 따라 ffuse. 척수에 부수적인 성장의 분석이 필요한 경우 긴 잠복기 (4 시에하는 데 이틀 ° C)에 대한 허용합니다. </li></ol> 3. 마운트 및 현미경 분석 <ol><li> 그 지느러미 면을 하나의 척수는 PBS의 드롭에서 coverslip에 아래 염료 확산, 위치 다음. 첨부된 DRG가 옆으로 올바르게 지향적이며, 뒤섞이다하지 않는 조심해. 초과 액체를 기음과 집게를 사용하여 거꾸로 오픈 책을 모드에서 코드를 버리고. </li><li> PBS를 사용하여 현미경 슬라이드에 대한 준비를 탑재합니다. </li><li> 분류 axonal 계획의 불필요한 배경 얼룩 형광 현미경 분석의 증가를 방지하기 위해서 마운트의 하루를 실시한다. 다음 4 어둠의 슬라이드를 유지까지 ° C. </li></ol> 4. 대표 결과 : 마우스의 척수는 수입 성의 PR를받습니다자궁 경부의 8쌍에서 ojections, 흉부의 13쌍, 60 척추 신경에 총 성례의 DRG의 요추와 4쌍 5쌍. 훈련 후에도 연결된 대부분의 DRG와 척수는 5 분 안에 배아에서 격리 수 있습니다. 이 절차는 E11.5에서 E13.5 마우스 배아에 연결된 DRG와 척수 코드의 격리에 적합합니다. 그러나, 최상의 결과는 E12.5에서 달성하고 있습니다. 여기에서 설명한 상표 절차의 전형적인 결과는 그림 3에 표시됩니다. 척수의 전체 길이 이상의 DRG의 라벨은 다음 여러 척추 레벨 (그림 4)에서 axonal 분기 동작을 계량하는 데 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> 그림 1. 제도 axonal 분기의 두 주요 모드를 묘사. 여기에 표시된대로 - - (A) 분기점으로 이어질 수 성장 원추의 활동에 의해 분기뿐만 아니라 복잡한 터미널 arbors 또는축삭 샤프트에서 (B) 부수 형성 (중간 분기). 후자 모드는 6,7 대뇌 피질과 thalamocortical axons을 예상의 지배 분기 유형입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> 그림 2 배아 척수로 DRG 뉴런의 수입 성의 전망은 axonal 분기 두 가지 유형의 표시 :. 분기점에 의해 DREZ (1)에서와 중간 분기 (2)에 의해 대기 기간 후에 발생하는 딸 지점의 민간인 피해 양식에서 axons 첫번째 지점을. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> 그림 3. 배아 마우스 DRG의 신경의 단일 axonal 궤도의 시각화. (A) 첨부 DRG와 척수는 E12.5 마우스의 배아에서 준비했습니다. 증가 확대에 야생 형 생쥐의 DiI - 레이블 DRG의 (스케일 바, 1mm.) (BD) 등의 전망이 표시됩니다. B의 모든 초 DRG는 labele입니다DiI로 D. 형광 이미지가 거꾸로 있으며, 꼬리는 왼쪽에 있으며, 측면 C와 D에서 맨 아래에 있습니다. C에서 axons의 작은 번호가 표시되고 더 높은 배율에서 T와 같은 가지의 존재는 척수의 DREZ에서 확인할 수 있습니다. (스케일 바, 250 μm의 (B), 100 μm의 (C)와 50 μm의 (D).) <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> 그림 4. T - 모양의 가지, 야생 형에서 단일 주동이의 혹은 꼬리 전환 및 C - 타입 natriuretic 펩티드 (CNP) - 결함 E13.5에서 생쥐의 부량. 계산 한 axons의 숫자는 각 유전자형에 대해 서로 다른 트렁크 수준 꺾쇠 괄호로 묶어 주어집니다. C 또는 R은 - 전환 - 전용 꼬리 또는 주동이의 방향으로 성장을, 각각. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> 그림 5. cGMP 신호 통로는 척수의 DREZ에서 감각 축삭의 분기점을 트리거합니다. 의 (A) 제도리간드 CNP, 수용체 guanylyl cyclase Npr2와 세린 / 배아 DRG의 뉴런에서 트레오닌 키나제의 cGKIα 구성된 cGMP 신호 경로. Npr2는 CNP에 의해 자극시 GTP로부터 cGMP 생성합니다. (B) DiI 야생 유형과 CNP - 결함 생쥐의 뉴런을 DRG의 단일 axons의 추적. (스케일 바, 25 μm의.)

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	<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li><li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites.">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li><li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord.">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord.">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li><li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding:+implications+for+target+recognition+and+&amp;quot;waiting+periods&amp;quot;.">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &amp;quot;waiting periods&amp;quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li><li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li><li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+(CNP)+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons.">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li><li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons.">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li><li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones.">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

DiI 라벨에 대한 고정 조직의 사용과 함께 준비의 용이성과 함께 axonal 지점 형성의 두 가지 유형으로 구성된 틀에 박힌 프로젝션 패턴 분기 axonal 연구에 유리한 모델을 DRG 붙어있는 배아 척수를합니다. 코팅 유리 바늘을 사용하여 DiI 미세한의 응용 프로그램이 있습니다 - DRG 뉴런의 작은 그룹의 시각화함으로써 개별 axons과 분기 패턴의 분석 - DRG의 대량 라벨과는 달리 인치 설명한 방법은 더욱 더 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Stereomicroscope Stemi DRC </td><td> 자이스 혈구 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인산 버퍼 용액 (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182 - 50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 머크 </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> 표준 외과 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> 톱니 표준 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> 추가 벌금 홍채 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> 곡선 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 5 번 좋은 팁 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 제 5 미러 마무리 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas - 튀빙겐 봄 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 종이 </td><td> 피셔 과학 </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> 세계 Precission 악기 </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mm 배양 접시 </td><td> Greiner </td><td> 663,102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ML의 폴리 프로필렌 튜브 </td><td> 칼 로스 GmbH의 </td><td> ECO3.1 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 12 물론 문화 플레이트 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 머크 </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> / 브라운 micropipette 풀러 P - 97을 불타는 </td><td> 셔터 악기 (주) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilicate 유리 모세관 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DiI는 (1,1 &#39;- Dioctadecyl - 3, 3,3&#39;, 3&#39; - tetramethyl - 퍼클로레이트를 indocarbocyanine) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 468,495 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 SuperFrost 플러스를 슬라이드 </td><td> 칼 로스 GmbH의 </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 커버 풀렸는데 </td><td> 칼 로스 GmbH의 </td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

여기서 우리는 lipophilic 추적 1,1 &#39;- dioctadecyl - 3, 3,3&#39;, 퍼클로레이트 (DiI 1) 3&#39; - tetramethylindocarbocyanine를 사용하여 잘 퍼지는 얼룩하여 배아 척수로 DRG 뉴런의 작은 그룹의 탄도를 레이블에 기술을 제시 . 유전자가 변이된있는 마우스 라인의 사람과 야생 타입의 axonal 경로의 비교는 신경 시스템의 배선에 필수적인 메커니즘입니다 axonal 분기의 제어 후보 단백질의 기능 역할에 대한 테스트를하실 수 있습니다. Axonal 분기되므로 정보의 병렬 처리를위한 물리적 기초를 제공하고, 복수의 타겟과 연결하는 개별 신경 세포 수 있습니다. axonal 성장의 중간 타겟 지역에 파급 효과가 터미널 arborization 구분할 수 있습니다. 또한, axonal 지점 형성의 다른 모드는 성장 원추의 활동 (분할 또는 지연 브래지어의 여부 분기 결과에 따라 분류있을 수 있습니다nching) 또는 과정에서 축삭 축에서 민간인 피해의 신진부터 중간 분기 2 (그림 1)했다. DRG에서 뉴런의 중심 예상 axonal 분기 두 가지 유형의 연구를하는 유용한 실험 시스템을 제공합니다 : 자신의 수입 성의 axons시 10 분 13 일 (E10 - E13) 배아 일 사이에 척수의 지느러미 루트 항목 영역 (DREZ)를 도달할 때 틀에 박힌 패턴의 T 또는 Y 형 분기를 표시합니다. 두 결과의 딸 axons 다음 코드의 dorsolateral 여백에서 각각 주동이의 또는 꼬리 방향으로 진행하고 대기 기간 민간인 피해는 특정의 릴레이 뉴런에 회색 물질 (중간 분기) 및 프로젝트를 침투 이러한 줄기 axons에서 새싹 후에만 그들은 더 이상 (터미널 분기) 3 arborize 척수의 laminae. DiI의 tracings은 PR에 나타나 척수의 지느러미 루트 항목 영역에서 성장 콘 감을 잡을수있다그 분기점을 제안 분할의 ocess이 성장 원추 자체 4 (그림 2) 분할로 인해 발생하지만, 다른 옵션은 물론 5 논의되었습니다. 이 비디오는 DRG가 첨부된 떠나는 E12.5 생쥐의 척수를 해부하다하는 방법을 첫째 보여줍니다. DiI의 표본 작은 금액의 다음 고정은 모세관 튜브에서 나온 유리 바늘을 사용하여 DRG에 적용됩니다. 부화 단계 후, 표시된 척수는 형광 현미경을 사용하여 개별 axons을 분석 거꾸로 오픈 책을 준비로 마운트됩니다.

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DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

쥐 척수로 감각 afferents의 틀에 박힌 예상 단일 axons의 추적을 통해 axonal 분기를 공부하기 위해 쉽게 액세스할 실험 시스템을 제공합니다.

마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 Axonal 공부 DRG 뉴런의 DiI - 라벨링

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.8K 조회수.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine. 쥐 척수로 감각 afferents의 틀에 박힌 예상 단일 axons의 추적을 통해 axonal 분기를 공부하기 위해 쉽게 액세스할 실험 시스템을 제공합니다.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

성인 전체 마운트 준비 Drosophila</em장 섬유 염료 주입을위한> 복부 신경 코드

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

마우스에 있는 Laminectomy 및 척수 창 이식

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

척수 자극에 대한 운동 뉴런 반응의 이해

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

저자 스포트라이트: Advancing Spinal Cord Stimulation - Exploring the cellular responses of motor neurons through patch-clamp electrophysiology (척수 자극의 발전 - 패치클램프 전기생리학을 통한 운동 뉴런의 세포 반응 탐구) 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...