설명이 프로젝트는 내용이 전적으로 저자의 책임이며 반드시 아동 보건 인간 발달이나 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않는 태그를 아동 보건 인간 발달의 국립 연구소에서 부여 번호 R01HD050725 지원했습니다 보건 국립 연구소. 우리는 원고와 동영상을 자신의 입력을위한 Godenschwege 실험실뿐만 아니라 바바라 Schreader의 회원 감사합니다.

1. 복부 신경 코드의 해부 GF의 필링 해부와 염료는 실온에서 수행할 수 있습니다. 모든 해부는 추운 단계 (4 ° C) 호수가 세포 신진 대사를 느리게하고 더 이상 신경이 살아 유지하는 데 사용해야합니다. <ol><li> CO 2와 함께 성인 파리 (4 일간 이상)을 마취하거나 그들이 움직일 때까지 얼음에 그들을 진정. 얼음 Anesthetizing 것은 더 많은 시간을 (최대 30 분)이 필요합니다하지만, 이상에 대한 고정 파리를 유지합니다. </li><li> Sylgard 코팅 페트리 접시에 놓으세요 날아. 이것은 절개는 높은 배율 (80 - 100X) 절개의 stereomicroscope의 사용을 필요로합니다. </li><li> Vannas 가위와 다리, 코, 그리고 날개를 제거합니다. </li><li> Sylgard 요리의 방향으로 비행 등의 측면을 거친 포셉과 훌륭한 곤충 핀 (minutien 핀)을 최대 사용합니다. 먼저 복부를 핀 후 목을 약간 (그림 2 참조) 늘어 및 액세스할 수 있도록, 머리 뒤쪽, 목 양쪽에 두 개의 핀을 배치하여 약간 동물을 연장하다. </li><li> 신선하고 차가운 Drosophila의 호수에서 날아 잠수함. 가장 일반적으로 사용되는 Drosophila의 살린스는 절개를 위해, 그러나 여기서 우리가 구 및오다에 설명된 생리 2006 년 4 사용 충분합니다. 기포가 파리를 둘러싸고있는 것입니다. 주사기로 공기를 제거합니다. </li><li> 복부의 지느러미 끝에 짧은 수평 절개를합니다. 절개에서 시작, 흉부으로 복부의 지느러미 정중선을 따라 얕은, 직선 절단합니다. 다음 결합 방향으로 정중선을 따라 정확하게 최대한 흉부에있는 얕은, 세로 절단을 계속합니다. 이것은 VNC (그림 1)을 손상하지로 인하 얕은하기 위해 중요합니다. </li><li> 조심스럽게 흉부를 열고 두 미세 곤충 핀을 사용합니다. 몸이 핀을 사용하여 분리 반쪽 확산 및 비행 근육 (그림 2)을 통해 핀을 놓습니다. 표피의 추출 방지하기 위해 그림 2에서 묘사된 것처럼 흉부는 더 이상 열 수 없습니다. VNC의 직선 방향을 보장하기 위해 핀은 양쪽에 동일한 앞쪽에 후부 위치에 배치되어야합니다. </li><li> 염료 주입 적절한 영상을위한 VNC에 대한 액세스가 내장 의해 가려지지 수 있습니다. 따라서, 위, 창자, 심장, 그리고 생식기를 제거하는 집게와 가위를 사용합니다. VNC의 양쪽에 누워있는 침샘을 빼낸다. 부동 조직과 지방을 제거하는 새로운 식염수에 조심스럽게 절개를 씻어. </li><li> 자궁 경부 결합 (CVC) 아래에서 지방 시신을 제거합니다. 지방 몸은 높은 배율에서 가장 볼 수 있습니다. 주의 측면에서 조직을 파악하고 그것을 잡아 좋은 포셉를 사용합니다. </li></ol> 절개는 5~10분 이내에 수행할 수 있습니다. 신선한 차가운 호수를 사용하여 해부, 손상 신경 시스템은 적어도 하나의 시간 동안 살아 남아있게됩니다. 2. 세포내 GF 작성 이것은 절개 후 가능한 빨리 충전 염료를 수행하는 것이 좋습니다. <ol><li> 고정 무대 (그림 3)과 10X 공기 목적으로 똑바로 현미경 해부 비행과 Sylgard 접시를 놓습니다. 센터 염료 채우기 전극 홀더쪽으로 위치 파리의 사후 끝에있는 샘플. CVC에 차등 간섭 대비 (DIC) 모드와 포커스를 사용합니다. GFS의 큰 axons은 CVC의 등의 표면에 명확하게 표시해야합니다. </li><li> 1 % 농도 deionized H2O에서 루시퍼 옐로우 CH dilithium 소금을 희석. 약 저항에 필라멘트와 Borosilicate 유리 전극을 당기세요. MΩ 60-80. 유리 전극의 끝이 길고 날카로운해야합니다. 약 루시퍼 노란 솔루션에 전극 팁 반대 끝에있는 전극을 배치을 1 % 루시퍼 노란색 솔루션으로 전극의 끝부분을 입력합니다. 30-60초. 다음 염색과 LiCl 사이의 기포를 떠나지 해밀턴 주사기를 사용하는 3M LiCl과 전극 backfill. 머리 단계에 염료 채우기 전극을 연결합니다. </li><li> 식염에 염화 코팅 실버 와이어 접지 전극을 삽입하고 3D 유압 micromanipulator를 사용하여 VNC에 파리 병렬 위에 염료 채우기 전극을 배치. 염료 채우기 전극은 현재 각각을 통과 하이퍼 또는 depolarizing하여 전극에서 부정적 또는 긍정적으로 청구 염료 출시하기 위해 현재의 합격 수있는 앰프에 연결되어 있어야합니다. </li><li> 40x 물 침지 렌즈로 전환하여 GFS 중 하나에 염료 작성 전극의 끝부분을 낮추십시오. GF의 axons은 CVC의 등의 표면에 가까이하다. GF에 전극을 삽입하기 위해 앞으로 (머리 방향) 운동을 사용합니다. </li><li> epifluorescent 빛을 광원을 변경하고 루시퍼 옐로우 필터로 전환합니다. GF에 루시퍼 노란색을 삽입하기 위해 앰프와 염색 채워 전극에 hyperpolarizing 전류를 적용합니다. 색소 주입의 수량은 일에 의해 제어할 수 있습니다현재의 전자 금액은 전류가 전달되는 기간뿐만 아니라 전달. 사출 사이트 또는 손상 GF 밖으로 밝혀 지던에서 염료를 방지하기 위해, 그것은 1-5분 이상 낮은 전류 (약 3-5 NA)를 사용하여 주입하는 것이 좋습니다. </li><li> VNC의 GF 터미널 (그림 4A) 분명하게 볼 수있을 때까지 현재 적용됩니다. postsynaptic 뉴런의 시냅스 횡단 얼룩 들어, 염료도 postsynaptic 뉴런에서 볼 수있을 때까지 현재의 전달로 진행합니다. 현재 끄고 염료 채우기 전극을 제거합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 : 대표 염색 루시퍼 황색 한 GF에 대한 채우기 그림 4A에 표시됩니다. 이미지가 현미경에 장착된 현장 카메라를 사용하는 니콘 요소 소프트웨어에서 이미지를 스택으로 인수되었다. 이 예제에서는 현재 약 2 분 동안 전극 통과되었다. GF는 철저하게 채워되고 흉부에 큰 GF 단자가 잘 (그림 4A, 타원형) 표시됩니다. 루시퍼 노란색은 갑 분기점을 통과하는 정도로 작은 있지만 아무 postsynaptic 뉴런이 경우에는 표시되지 않습니다. 신호가 감지 너무 약한 때문에 염료가 GF에 충분히 주입하지 않은 경우 다음 횡단 시냅스 postsynaptic 뉴런의 채우고 볼되지 않을 수 있습니다. GFS (그림 4B, 화살표 머리)에 postsynaptic 뉴런은 같은 Neurobiotin과 같은 소규모의 연결을 추적하는을 사용하여보다 안정적으로 시각하실 수 있습니다. 이분에 대한 depolarizing 현재 2 M 칼륨 아세테이트 용액에 7 % Neurobiotin을 주입하는 것은 강하게 postsynaptic 뉴런 레이블을하기에 충분합니다. Neurobiotin 서로 다른 파장의 염료에 결합 Streptavidin를 사용 공촛점 현미경에 대한 시각하실 수 있습니다. Neurobiotin은 형광 염료가 아니므로, 같은 용액에 Rhodamin - Dextran 또는 알렉사 hydrazides의 공동 주사는 GF (그림 4C, Boerner 및 Godenschwege에서 2010 년 5)에 성공적으로 주사를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 비행의 도식 그림은 옆으로 볼. 흉부는 내부 구조를 시각화하기 위해 세로 절개와 함께 표시됩니다. 해부 동안 지느러미 길이 비행 근육 (DLMs, 파란색)은 비행 근육으로 복부 자리 복부 신경 코드 (VNC, 딥 레드), 손상없이 절단되었습니다. 직감 (녹색)은 VNC 위에 자리잡고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 해부 파리의 도설 볼 수 있습니다. 두 개의 핀이는 파리를 위치로 머리 뒤에 배치됩니다. 비행 근육 (DLM)를 통해 부착된 핀은 흉부가 열려시오. 내부 장기는 복부 신경 코드 (VNC)을 노출 제거되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 염료 작성 설정. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4.) 루시퍼 노란색으로 가득 한 GF를 보여주는 VNC의 후부 부분의 Z - 투영. 이미지가 즉시 염료가 현장 카메라로 작성 후 인수되었다. 야생 형 동물에서 흉부에있는 터미널 (타원형)이 명확하게 볼 수 있습니다. B) GF 염료의 공촛점 이미지는 야생 타입 비행에 Neurobiotin로 기입하십시오. GFS (화살표)와 GFS (화살표 머리)에 postsynaptic 뉴런 모두 표시됩니다. Streptavidin은 Cy3로 결합과 Neurobiotin이 시각되었습니다. C) 야생 형 GFS의 공촛점 이미지 Alexa555 가득.

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	<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect+Drosophila+melanogaster.">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Boerner, J., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Average+shape+standard+atlas+for+the+adult+Drosophila+ventral+nerve+cord.">Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+synaptic+transmission+in+adult+Drosophila+Kenyon+cells+in+sity.">Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity.</a> J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).</li><li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+for+the+Drosophila+ventral+nerve+cord+standard+in+neuronal+circuit+reconstruction+and+in-depth+analysis+of+mutant+morphology.">Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology.</a> J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).</li><li>Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conderved+role+for+Drosophila+Neuroglian+and+human+L1-CAM+in+central-synapse+formation.">A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation.</a> Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).</li><li>Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+distinct+from+highwire+for+the+Drosophila+ubiquitin+conjugase+bendless+in+synaptic+growth+and+maturation.">A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation.</a> J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).</li><li>Storkebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+mutations+in+the+tyrosyl-tRNA+synthetase+gene+recapitulate+in+Drosophila+features+of+human+Charcot-Marie-Tooth+neuropathy.">Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recordings+from+the+Drosophila+giant+fiber+system+(GFS).">Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Giant+Fiber+Pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

신경 계통은 플라이 본체에서 추출하지 않고 해부를하실 수 있습니다. 이 두 장점을 가지고 먼저, 해부 신경 시스템에 약간의 손상을 초래하고, 둘째, 대부분의 신경은 근육과 감각 기관에 붙어있어. 로 설명 절개를, 공연하는 것은 GFS의 정직 염료 라벨에 대한 샘플을 준비합니다. 편리, GFS에 postsynaptic motoneurons은 근육에 붙어있어. Axons 따라서, 더 이상 신경이 살아 유지 피해가 있습니다. 또한, 신?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td> 다우 코닝 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td> AmScope </td><td> SM - 2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Vannas 가위 극상의 </td><td> 아카데믹 인스 트루먼 트의 </td><td> VS1023 </td><td></td></tr><tr><td> 더몬트 집게 Dumontstar 55 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> 아우 스터 리츠의 곤충 핀 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 26002-10 </td><td> Ø 0.1mm </td></tr><tr><td> Borosilicate 유리 전극 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B100F - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 수직 피펫 풀러 700c </td><td> 데이비드 Kopf 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 700C </td><td></td></tr><tr><td> 루시퍼 옐로우 CH dilithium 소금 </td><td> 시그마 </td><td> L0259 </td><td> H 2 O에 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 고정 스테이지 입식 현미경 &amp; 카메라 </td><td> 니콘 </td><td> FN - 1 &amp; DS - U2 카메라 </td><td></td></tr><tr><td> 계획 플루어 10X 에어 목표 </td><td> 니콘 </td><td> CFI 계획 플루어 16mm 10X NA 0.3 WD </td><td></td></tr><tr><td> 플루어 40X 물이 목표 디핑 </td><td> 니콘 </td><td> CFI 플루어 40X W NA 0.80 WD 2.0mm </td><td></td></tr><tr><td> 3D 유압 Micromanipulator </td><td> Narishige 국제 </td><td> 모델 MW0 - 3 </td><td></td></tr><tr><td> 증폭기 </td><td> 악기를 얻기 주식 회사 </td><td> 모델 5A </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount preparation of the adult drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection

뉴런의 axonal와 돌기 형태를 분석하기 위해서는의 연결 구조의 정확한 라벨을 얻기 위해 필수적입니다. 노 조직 손상이 거의 잘 레이블 샘플을 준비하는 것은 그러므로 돌연변이 변이의 식별을 허용, 우리는 세포 형태를 분석하고 서로에게 개별 샘플을 비교할 수 있습니다. 시연 절개 방법에서 신경 시스템은 성인 플라이 내부에 대부분 남아있다. 지느러미 절개를 통해 복부와 흉부 열리고 있으며, 대부분의 내부 장기가 제거됩니다. GF 셀 본문과 dendrites을 포함하고있는 두뇌 손상 머리에이 남아있는 동안 복부 신경 코드 (VNC)와 거대한 섬유 (GFS) 1의 큰 axons를 포함하는 자궁 결합 (CVC)의 단지 등의 측면이 노출 . 이 준비에서 VNC 대부분의 신경들은 근육에 연결되어 유지됩니다. 해부 다음, 형광 염료와 함께 거대한 섬유 (GF)의 세포내 작성이 증명됩니다. CVC에서는 GF의 axons는 등의 표면에 위치하고 있으며 따라서 차등 간섭 대비 (DIC) 광학 장치와 현미경으로 쉽게 시각하실 수 있습니다. 이것은이 사이트에서 염료와 GF의 axons의 주입은 VNC에서 axons과 단말기를 포함한 전체 GF 레이블을 수 있습니다. 이 방법은 신경이 epifluorescent 현미경으로 기입 후 즉시 군데 수 있도록 GFS의 안정적이고 강력한 얼룩을 초래합니다. 또는 형광 신호는 높은 해상도 공촛점 현미경에 적합한 표준 immunohistochemistry 절차 3을 사용 강화 수 있습니다.

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Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

<em&gt; 생체내에</em성인&gt; 해부<em&gt; Drosophila</em&gt; 복부 신경 코드 (VNC)이 증명됩니다. 이 특별한 절개 방법은 고해상도 이미징을위한 형광 염료와 함께 거대한 섬유 뉴런의 후속 라벨을 허용 VNC 거의 손상을 초래합니다.

성인 전체 마운트 준비 Drosophila</em장 섬유 염료 주입을위한> 복부 신경 코드

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

18.9K 조회수.  Florida Atlantic University.  생체내에 해부 Drosophila 복부 신경 코드 (VNC)이 증명됩니다. 이 특별한 절개 방법은 고해상도 이미징을위한 형광 염료와 함께 거대한 섬유 뉴런의 후속 라벨을 허용 VNC 거의 손상을 초래합니다.

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Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

연구

신경과학

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

의 거대한 섬유 패스에서 Electrophysiological 레코딩 D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

를 사용하여 화합물 Bioactivity위한 이점 Nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 Axonal 공부 DRG 뉴런의 DiI - 라벨링

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

전신 탈염 신경 근육 정션 분석을위한 트랜스 대 복부 근육의 해부

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

<em&gt; 체외</em근육의 구 심성의 소성 특성을 연구&gt; 성인 마우스 근육 - 신경 준비

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

성인 전체 마운트 준비 Drosophila 복부 신경 코드