Name: a novel microdissection approach to recovering mycobacterium tuberculosis specific transcripts from formalin fixed paraffin embedded lung granulomas
Uploaded: 2014-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
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R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, 및 P51OD011104 : 저자는이 연구의 지원에 대해 다음 NIH 상 / subawards을 인정하고 싶습니다.

사단 이미징 소프트웨어를 사용하여 1. 보정 Mesodissection 악기 사단 이미징 소프트웨어는이 문서의 나머지 부분에 대한 소프트웨어 또는 프로그램 중 하나라고한다. 이 단계는 정확하게 화상을 추적 할뿐만 아니라, 다수의 슬라이드 프레임을 정렬하는 데 필요하다. <ol><li> 악기와 컴퓨터를 켭니다. </li><li> 오픈 소프트웨어 및 &quot;보정기구&quot;를 선택합니다. </li><li> 조이스틱을 사용하여 스테이지 이동을 보정합니다. 왼쪽 상단 위치로 무대를 이동합니다. 프로그램의 1 단계를 눌러 &quot;설정&quot;. </li><li> 올바른 위치를 낮은 단계로 이동합니다. 프로그램의 2 단계를 눌러 &quot;설정&quot;. </li><li> 먼저 헤드 어셈블리를 높이기 위해 &quot;Z 버튼&quot;을 눌러 포부를 보정합니다. 조이스틱을 눌러 &quot;대기음 펄스&quot;버튼과 &quot;해부&quot;버튼을 플런저 제어봉까지 최고 위치에 도달. 프로그램의 3 단계에서 &quot;SET&quot;키를 누르면,. </li><li> 을 눌러 &quot;대기음 리셋과# 8221; 버튼을 누릅니다. 플런저는 4 단계에서 아래의 위치를​​ 눌러 &quot;설정&quot;에서 정지되면. </li><li> &quot;규모 탭&quot;을 클릭합니다. </li><li> 빈면에 교정 통치자를 놓습니다. </li><li> 필요한 경우 현미경 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 마우스를 사용하여 두 개의 스케일 바 사이에 선을 그립니다. </li><li> 2 단계. 보도 &quot;계산&quot;버튼을 표시 상자에 거리를 입력합니다. </li><li> &quot;십자&quot;탭을 클릭합니다. 1 모터 속도를 켭니다. </li><li> 헤드 어셈블리에 xScisor를 삽입합니다. &quot;z 축&quot;버튼을 누름으로써, Z 축 준비 위치로 니더 헤드 조립체. 참고 : 헤드 어셈블리 베스트 해부 악기의 큰 구조입니다. xScisor이 문서의 나머지 부분에 대한 소비 밀 비트라고한다. </li><li> 조이스틱 버튼을 &quot;해부 참여&quot;를 클릭합니다. 참고 :이 버튼이 조이스틱의 상단에 위치하고 있습니다. </li><li> 시각적으로 회전 중심을 정의합니다. 이렇게하려면 정의하여 회전 중심에 십자선의 중심을 이동프로그램의 1 단계에서 d 매개 변수. 십자선을 정렬하는 픽셀을 조정하기 위해 &quot;X&quot;와 &quot;Y 축&quot;바에서 아래 화살표를 사용합니다. &quot;완료&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> &quot;홈&quot;아이콘을 클릭합니다. 참고 :이 작업은 오른쪽 상단 모서리에있는 집 이미지로 표현된다. </li></ol> 2. 참조 이미지 만들기 <ol><li> 무대에서 H &amp; E 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 상단에 불투명 커버를 놓습니다. H &amp; E 슬라이드의 원하는 영역에 조이스틱을 움직여서 기기를 구동한다. 생성 된 이미지를 저장합니다. 참고 : &quot;캡처 참조&quot;탭 또는 &quot;해부&quot;탭 하나가이 단계를 완료하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 해부를 위해 조직을 맞 춥니 다 <ol><li> 홈 화면에서 &quot;조직을 해부&quot;옵션을 클릭합니다. </li><li> &quot;연산자&quot;, &quot;해부 접근 번호&quot;, &quot;참조 기탁 번호&quot;, &quot;xScisor 바코드 번호,&quot;&amp; #을 입력합니다8220; 해부 유체 로트 번호 &quot;,&quot;xScisor 크기 &quot;및&quot;설정 &quot;탭에서&quot;설명 &quot;. </li><li> &quot;조직을 찾아&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> 가져 오기 이전에 참조 이미지를 저장. </li><li> 무대에서 5 미크론 두께의 흠 FFPE 슬라이드를 놓습니다. 참조 화상에 도시 한 것과 같은 영역으로 스테이지를 이동. &quot;이미지 삽입&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> &quot;정렬&quot;탭을 클릭합니다. 흠없는 이미지에 대한 참조 이미지를 정렬하는 마우스와 관련된 화살표를 사용합니다. </li></ol> 4. 슬라이드에 주석 달기 <ol><li> &quot;주석&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> microdissected 될 슬라이드의 원하는 영역 주위에 원을 그리려면 마우스를 사용합니다. </li></ol> 5. 소모품 밀 비트로드 <ol><li> 유체 운동에 위아래로 여러 번 플런저를 잡아 당겨,​​ 여기에 원하는 버퍼, PKD 버퍼와 소모품 밀 비트를 입력합니다. 반드시 공기를 제외 할 수 있도록거품. </li><li> &quot;Z-축&quot;버튼을 눌러 Z 축 올립니다. </li><li> 기계로 소비 밀 비트를 넣습니다. 기계의 정상에 소비 밀 비트를 슬라이딩하여이 작업을 수행 할 있도록 소모품 밀 비트에 검은 색 줄까지 기기 라인에 흰색 선. 플런저가 올바른 위치로 낮출 수 있도록 압박 &quot;포부 리셋&quot;버튼을 클릭합니다. 참고 : 소모품 밀 비트를 밀어 쉽게해야합니다. 그렇지 않은 경우, 노치가 제대로 정렬되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 다시 &quot;Z 축&quot;단추를 눌러 니더 Z 축. </li></ol> 6. 조직을 해부하다 (그림 4) <ol><li> &quot;해부&quot;탭을 엽니 다. </li><li> 1 모터와 흡입 속도를 켭니다. </li><li> &quot;쇼 추적&quot;확인란을 선택합니다. 주의 : 이는 사용자가 박리 공정 동안 해부 영역을 시각화 할 수있다. </li><li> 해부 할 준비가 완료되면, 버튼을 &quot;참여&quot;뿐만 아니라 &quot;대기음 &amp; # 계속 보유8221; 버튼 조직을 절개하기 위하여 반 시계 방향으로 조이스틱을 이동시키면서. </li><li> 대기음이 &quot;전체&quot;탭이 빨간색으로 변합니다 때까지 반 시계 방향으로 절개를 계속합니다. </li></ol> 7. 소모품 밀 비트를 비우고 제거 <ol><li> 소모품 밀 비트의 끝에서 0.5 μL의 미세 원심 분리 튜브를 놓습니다. </li><li> 을 눌러 &quot;열망&quot;제어봉 신속의 미세 튜브에 샘플을 꺼냅니다. </li><li> 사용되는 소모품 밀 비트를 배출 증가 힘으로 누르십시오. </li><li> 플런저를 다시 잡아 당겨 조직 조각을 씻어. 소모품 밀 비트에 남아있는 샘플을 표현하기 위해 앞으로 플런저를 밀어 넣습니다. 조직 조각은 지금의 미세 튜브에 포함됩니다. </li></ol> 열 처리하여 테 K 소화 8.를 Lyse 샘플 <ol><li> 조직 샘플을 복구하는 단백질 분해 효소 K의 5 μg을 포함 70 μL의 TE 산도 8.5을 추가합니다. </li><li> 프로그램 히터 통에 샘플을 놓고. </li><li> 다음 설정에서 프로그램 히터 통을 사용하여 완전한 소화 : 1,500 rpm에서 30 분 동안 60 ˚ C; 1,500 rpm에서 15 분 동안 82 ˚ C; 450 rpm에서 1 분간 25 ˚ C. 샘플은 현재 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol>

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	<li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+pathology.">Laser capture microdissection in pathology.</a> J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).</li><li>Esposito, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques:+laser+capture+microdissection--increasing+specificity+of+gene+expression+profiling+of+cancer+specimens.">Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens.</a> Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).</li><li>Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodissection+of+Paraffin+Embedded+Slide+Mounted+Tissue+Sections.">Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).</li><li>Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+and+laboratory+strains.">Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains.</a> J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).</li><li>Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculosis:+what+we+don't+know+can,+and+does,+hurt+us.">Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us.</a> Science. 328 (5980), 852-856 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodissection+of+fibrous+tissue.">Mesodissection of fibrous tissue.</a> AvanSciBio. , (2013).</li><li>Paige, C., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penitentiary+or+penthouse+condo:+the+tuberculous+granuloma+from+the+microbe's+point+of+view.">Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view.</a> Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).</li><li>Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granuloma+correlates+of+protection+against+tuberculosis+and+mechanisms+of+immune+modulation+by+Mycobacterium+tuberculosis.">Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis.</a> J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).</li><li>Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+immunopathology+and+mortality+despite+tissue+persistence+in+a+Mycobacterium+tuberculosis+mutant+lacking+alternative+sigma+factor,+SigH.">Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).</li><li>Mehra, S., Kaushal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+reveals+extended+roles+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+stress+response+factor+sigmaH.">Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH.</a> J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).</li><li>Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+transcriptional+profiles+and+the+physiological+states+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+an+extended+intracellular+infection.">Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection.</a> PLoS Pathog. 8 (6), (2012).</li><li>Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterium+tuberculosis+sigma+factor+sigmaB+is+required+for+full+response+to+cell+envelope+stress+and+hypoxia+in+vitro,+but+it+is+dispensable+for+in+vivo+growth.">The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth.</a> J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).</li><li>Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enduring+hypoxic+response+of+Mycobacterium+tuberculosis.">The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li></ol>

저자는 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없음을 개시한다.

Mesodissection 병원균의 광대 한 배열로 인한 병적 병변 슬라이드로부터 RNA 추출에 적용 할 수있는 기법이다. 이것은 사용자가 콘텐츠를 추적하고 정확하게 이미지를 정렬 필요성이다. 이 작업을 수행하기 위해 장비는 이미징 소프트웨어의 지침에 따라 보정해야합니다. 해부 할 때 해부하고 그 슬라이드와 영역이 정렬되지 않는 경우, 사용자는 장비를 다시 교정해야합니다. 해부 과정에서 또 다른 ?...

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>.

Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

샘플은 전통적으로 수동으로 전체 조직이나 바늘과 메스를 사용하여 슬라이드 하나에서 microdissected되었습니다. 이것은 그 조직의 부와 주변 조직의 2 항 사이의 명확한 분리를 필요로한다. 분자 프로파일 기술에서 현재 발전으로, 세포 수준에서 조직을 평가할 필요성이 증가되고있다. 때문에 수동 미세 절제의 제한, LCM 등의 기술이 큰 절연 정밀도 수 있도록하기 위하여 설립되었다. 이 기술은 다음과 같은 연구가 유전자 발현 프로파일 링과 같은 하류 분석법에 사용할 수있는 다양한 세포 및 슬라이드 타입으로부터 특정 세포 집단을 분리 할 수​​있다. 다운 스트림 분석에 매우 효과적이지만, LCM은 제한이없는 것은 아니다. 첫째, LCM은 비용과 시간이 소요되는 과정입니다. 또한, 때문에 RNA의 불안정한 특성으로 종종 LCM 샘플 2에서 고품질의 RNA를 얻기 위해 도전하고있다. 때문에 디에LCM의 sadvantages은, 미세 절제 기술의 새로운 발전은 여전히​​ 저렴하고 시간에 민감한 방법으로 연구자의 큰 숫자에 더 접근 할 수 있도록하기 위해 필요합니다. 사용할 미세 절제 기술의 하나의 발전은 mesodissection로 알려진 기술이다. 이 기술에서 기계 공장 관심 주석 조직 섹션을 사용하고 소모품 밀 비트 3에를 흡입한다. 다음에,이 샘플 포집 관으로 흡인하고 다운 스트림 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 시스템의 장점은 훨씬 적은 비용과 시간이 중요한 것이있다. 우리의 경험에서, 시스템 10 분의 폐 육아종 조직 부분의 절개를 할 수 있습니다. 한편, 기존의 LCM 가능성 프로세스를 완료하기 위해 시간을 필요로한다. 시스템은 오퍼레이터에 대한 주석의 비교뿐만 아니라 도구로 사용하는 기준 슬라이드를로드 할 수있다. 또한 보고서는 개요 일을 생성해부 된 슬라이드의 전자 영역입니다. mesodissection하는 두 가지 주요 단점이 있습니다. 복수의 셀을 추출하는데 효과적이지만, 그것은 하나의 세포를 분리하기 위해 도전. 또, 생성 된 화상의 정밀도는 다른 촬상 현미경을 사용하는 경우만큼 명확하지 않다. 결핵 (TB)는 주요 전염병 전세계 인류의 킬러와 Mtb의 감염의 결과입니다. 결핵균 에어로졸에 노출 된 개인의 대부분에서, 감염은 잠재적으로 제한됩니다. 매년 적어도 천만명에서, 활동성 결핵 4가 발생합니다. 잠복 감염시, Mtb의는 육아종로 알려진 병적 인 폐 병변 내에 포함되어 있습니다. 따라서 그것의 mtb 감염의 결과를 육아종 5 수준에서 결정되고 있다고 주장하고있다. 여기에서 우리는 mesodissection는 Mtb의에 의한 육아종을 microdissect하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 사용 된 슬라이드감염된 붉은 털 원숭이에서 FFPE의 폐 조직에서이다. 이 데모의 목적을 위해, 우리는 그 전체 육아종 해부 것이다. 또한 RNA가 회복 조직으로부터 추출 될 수 있다는 것을 보여준다. 이 기술은 다양한 다른 표본으로부터 조직 샘플에인가하고 하류 분석법 다양한 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>MeSectr</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Mesodissector</td></tr><tr><td>400 nm xScisors</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Other sizes available</td></tr><tr><td>THOR</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Programmable Heater-Shaker</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE extraction kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq FFPE System&amp;nbsp;</td><td>Nugen</td><td>7150</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel microdissection approach to recovering mycobacterium tuberculosis specific transcripts from formalin fixed paraffin embedded lung granulomas

미세 절제는 십년에 대한 DNA, RNA 및 단백질 수준에서의 조직 검사를 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 오늘 사용되는 가장 일반적인 미세 절제 기법입니다. 이 기술에서, 레이저 focally 탈수 조직 섹션 1 위에 놓 열가소성 막을 용해하는 데 사용됩니다. 조직 절편 복합체이어서 들리고 막으로부터 분리된다. 이 기법은 조직 검사를 위해 성공적으로 사용될 수 있지만, 시간 소모적이고 비싸다. 또한,이 기술을 이용하여 절차의 성공적인 완료 따라서 그 사용을 제한하는, 레이저의 사용을 필요로한다. mesodissection라는 새 더 저렴하고 실용적인 미세 절제 방식은 LCM의 함정에 가능한 솔루션입니다. 이 기술은 밀에 장착 된 슬라이드 조직 샘플에서 원하는 조직을 MESO-1/MeSectr 시스템을 채택에 동시에 원하는 조직 샘플을 복구하는 유체 분배 및 흡인하면서소모품 밀 비트. 해부 과정을 시작하기 전에, 사용자는 (FFPE) 포함 된 포르말린 고정 파라핀 (H &amp; E) 기준 슬라이드 스테인드 헤 마톡 실린 및 에오신으로 밀어 맞 춥니 다. 그 후, 오퍼레이터는 소망 해부 영역에 주석 및 해당 세그먼트를 해부로 진행한다. 이 프로그램은 절개의 아카이브 이미지를 생성합니다. mesodissection의 가장 큰 장점은이 실험에서 세대를 샘플링하기 위해 설정 10 분 거리의 평균을 복용, 슬라이드를 해부하는 데 필요한 짧은 기간입니다. 또한,이 시스템은 훨씬 더 효과적인 비용과 사용자 친화적이다. 약간의 단점은 레이저 캡처 현미경처럼 정확하지 않습니다 것입니다. 이 문서에서 우리는 mesodissection은 결핵균 (Mtb의)에 의해 발생 FFPE의 육아종에서 슬라이드에서 RNA를 추출하는 방법을 보여줍니다.

상기 프로토콜은 FFPE 조직 슬라이드에서 RNA를 추출하는 새로운 mesodissection 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜의 효능은 다양한 감염 단계에서 Mtb의 감염 NHP에서 폐 육아종의 FFPE 슬라이드를 통해 표시됩니다. 1-3 악기. 그림 4의 이미지 들이고 해부 프로세스가 발생하는 방법을 묘사하고 소프트웨어. 표 1에 의해 생성 된 결과...

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A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

미세 절제가 광범위하게 조직 내에서 DNA, RNA, 단백질의 시험을 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만 새로운 밀링 기술 mesodissection는 최근 유효하다. 우리는 mesodissected 포르말린 고정 파라핀 결핵균 육아종의 내장 조직 슬라이드에서 RNA 추출을 보여줍니다.

복구하는 새로운 미세 절제 접근<em&gt; 결핵균</em폐 육아종 임베디드 포르말린 고정 파라핀에서&gt; 특정 성적 증명서

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

a-novel-microdissection-approach-to-recovering-mycobacterium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

8.0K 조회수.  Tulane National Primate Research Center.  미세 절제가 광범위하게 조직 내에서 DNA, RNA, 단백질의 시험을 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만 새로운 밀링 기술 mesodissection는 최근 유효하다. 우리는 mesodissected 포르말린 고정 파라핀 결핵균 육아종의 내장 조직 슬라이드에서 RNA 추출을 보여줍니다. 

비디오: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

연구

의학

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the tumor immune landscape. Although standard immunohistochemistry is suitable for studying tissue architecture, it is limited to the analysis of a small number of markers. Conversely, techniques such as flow cytometry can evaluate multiple markers simultaneously, although information about tissue morphology is lost. In recent years, multiplexed strategies that integrate phenotypic and spatial analysis have emerged as comprehensive approaches to the characterization of the tumor immune landscape. Herein, we discuss an innovative technology combining metal-labeled antibodies and secondary ion mass spectrometry focusing on the technical steps in assay development and optimization, tissue preparation, and image acquisition and processing. Before staining, a metal-labeled antibody panel must be developed and optimized. This hi-plex image system supports up to 40 metal-tagged antibodies in a single tissue section. Of note, the risk of signal interference increases with the number of markers included in the panel. After panel design, particular attention should be given to the metal isotope assignment to the antibody to minimize this interference. Preliminary panel testing is performed using a small subset of antibodies and subsequent testing of the entire panel in control tissues. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are obtained and mounted on gold-coated slides and further stained. The staining takes 2 days and closely resembles standard immunohistochemical staining. Once samples are stained, they are placed in the image acquisition instrument. Fields of view are selected, and images are acquired, uploaded, and stored. The final stage is image preparation for the filtering and removal of interference using the system&#39;s image processing software. A disadvantage of this platform is the lack of analytical software. However, the images generated are supported by different computational pathology software.

In the era of cancer immunotherapy, interest in elucidating tumor microenvironment dynamics has increased strikingly. This protocol details a mass spectrometry imaging technique with respect to its staining and imaging steps, which allow for highly multiplexed spatial analysis.

포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 사용하여 종양 미세 환경에 대한 이해 확대

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

암 연구학

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

결핵 분자 세균 부하 분석 (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

면역학 및 감염병학

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>형광 현미경 분석을 위한 폐의 곰팡이 포자 국소화 보존

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and bronchioles, branch until terminating in the alveolar airspace where gas exchange occurs. Infections originating in the bronchioles or alveoli elicit distinct host responses and disease manifestations. Therefore, understanding precisely where spores naturally localize in the lungs, particularly soon after infection, expands opportunities for investigation of host-pathogen interactions. Herein, we detail an in-situ analysis of lungs from mice infected with Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&#916; arthroconidia. Conventional methods for histological preservation involve liquid inflation of the airways with a fixative solution, which displaces the natural location of aspirated fungal particles, pushing spores from proximal bronchioles to terminal airspaces.
Conversely, this method of air-inflation with blood vasculature perfusion-fixation preserves the physiologic position of fungal spores within the bronchioles. Moreover, we describe a simple approach to cryopreserving, embedding, and imaging lung specimens. We also share high-throughput computational techniques via the open-source QuPath program to analyze the spatial distribution of fungal spores within the lung. The method presented here is simple and quick, requires minimal equipment to perform, and can be easily adapted for use with many respiratory fungal infection models.

<meta charset="utf8"></head><body>기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

We present a method for a fungal pathogenesis model that preserves the natural positioning of fungal spores in the lung airways for analysis via fluorescent microscopy.

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA 및 DNA 추출 모두 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 코어의 제조

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Agarose-embedded vibratome section을 사용한 혁신적인 폐 이미징

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

저자 스포트라이트: Agarose Embedded Lung Tissue Section을 사용한 공간 단백질 발현 연구 

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...

복구하는 새로운 미세 절제 접근

요약

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복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화

포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 사용하여 종양 미세 환경에 대한 이해 확대

결핵 분자 세균 부하 분석 (TB-MBLA)

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

RNA 및 DNA 추출 모두 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 코어의 제조

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편