이 절차의 목적은 순수 시프트 NMR로 식물 추출물을 분석하는 것입니다. 다음 프로토콜에는 다양한 식물 매트릭스, 바닐라 잎, 감자 괴경 및 케이프 구스베리 과일의 시료 전처리의 주요 측면과 최적의 순수 시프트 정신 및 SAPPHIRE 정신 스펙트럼을 기록하기 위한 자세한 단계별 NMR 절차가 포함되어 있습니다. proton NMR에 의한 대사 프로파일링은 이 혼합물의 각 대사 산물을 식별하기 위해 복잡한 생물학적 혼합물의 NMR 스펙트럼 내 무수한 신호에서 신호별로 신호를 분석하는 기술입니다.
목표는 식물 과학의 다른 중요한 영역 중에서 화학 분류학, 표현형, 관능적 특성, 원산지 명칭, 대사 반응과 관련될 수 있는 바이오마커를 묘사하는 것입니다. Proton NMR은 일반적으로 대사 프로파일링에 사용됩니다. 그러나 좁은 제품 스펙트럼 범위에 국한된 확장 다중성을 가진 많은 수의 신호는 광범위한 중첩으로 이어져 스펙트럼의 분석 및 해석을 복잡하게 만듭니다.
일반적으로 단일 공진은 1에서 5 헤르츠 범위의 폭을 갖습니다. 그러나 고도로 결합된 신호는 25Hz에서 50Hz까지 확산될 수 있으므로 신호 중복 가능성이 높아집니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 최신 순수 이동 NMR 방법을 적용하여 세 가지 다른 플랜트 시나리오에서 볼 수 있듯이 스펙트럼 해상도를 발표합니다.
샘플 준비, 식물 추출물 준비는 여러 가지 방법으로 수행할 수 있으며 절차는 매트릭스에 따라 다릅니다. 케이프 구스베리 열매는 먼저 균질화되어 주스가 되었습니다. 바닐라 잎은 그대로 사용되었고 감자는 산화되지 않도록 얇게 썰었습니다.
모든 경우에 재료는 동결 건조되고 분쇄 된 다음 추출되었습니다. 케이프 구스베리 과일과 감자의 경우, 초음파 처리에 의해 도움을 받아 추출에 물을 사용했습니다. 상층액은 원심분리에 의해 회수되었고, 임의의 액체는 동결건조 또는 스피드 vac에 의해 건조되었다.
건조 추출물을 옥살레이트 완충액에 재현탁시키고, 건조 상태로 증발시킨 후 TMSP를 함유하는 D2O에 재용해시켰다. 바닐라의 경우, TMSP와 중수소화 메탄올을 함유하는 중수소화 인산염 완충액을 사용하여 직접 추출하였다. 상층액은 또한 원심분리에 의해 회수되었다.
모든 샘플은 PTFE 주사기 필터를 통해 여과되었으며 NMR 튜브는 0.6ml의 여과된 용액으로 채워졌습니다. NMR 대사체학에서 시료 전처리가 핵심입니다. 이 절차는 아마도 수백 번 반복될 것이기 때문에 관찰된 차이가 샘플 준비 때문이 아니라 연구된 식물 간의 실제 차이에 의한 것임을 보장하기 위해 정확히 동일한 방식으로 준비해야 합니다.
순수 시프트 NMR. NMR 스펙트럼은 FID 신호의 푸리에 변환 후에 얻어집니다. FID 신호는 화학적 시프트 변조와 J 커플링 분할 패턴을 담당하는 J 커플링 변조의 두 가지 구성 요소로 분해될 수 있습니다.
J 커플링 변조는 J 커플링 리포커싱 요소에 의해 재초점될 수 있으며, 이는 활성 스핀이 영향을 받지 않는 동안 수동 스핀을 선택적으로 반전시킵니다. 두 번의 동일한 지연 후에 화학 J 커플 링이 완전히 재초점됩니다. anti-z-COSY 실험을 기반으로 하는 Psyche element는 가장 강력하고 민감한 광대역 재초점 요소 중 하나이며, NMR 대사체학에 적합한 특성을 가지고 있습니다.
순수 시프트 실험은 화학적 시프트 기록 중 J 커플링 진화를 재초점을 맞추는 것을 기반으로 합니다. 이것은 전형적으로 J 커플링 재초점점을 이동시키기 위해 지연을 증가시킴으로써 달성된다. 화학적 이동이 J 커플링보다 더 높은 주파수로 진화함에 따라 동핵 분리 실험을 인터페로그램 방식으로 기록할 수 있습니다.
인터페로그램 획득은 J 커플링 진화의 재초점 지점을 사용하여 FID를 작은 청크로 기록하는 것으로 구성되며, 항상 획득된 청크의 중심과 일치합니다. 분리된 FID는 연속된 각 청크를 연결하여 구성됩니다. NMR 데이터 수집 설정, 샘플을 NMR 분광계로 전송합니다.
프로브 헤드를 튜닝 및 일치시키고 샘플을 잠그고 끼웁니다. 90도 하드 펄스를 보정합니다. 표준 1D 양성자 NMR 스펙트럼을 실행합니다.
정신 실험. Bruker TopSpin 라이브러리에서 리셋 psyche 1D 펄스 시퀀스를 선택합니다. 스펙트럼 폭을 5킬로헤르츠로 설정합니다.
이완 회복은 최소 1초 또는 2초로 지연됩니다. 더미는 16으로 스캔합니다. 스캔 횟수를 64 또는 128로, 블록당 복소 데이터 포인트 수(64 또는 128)는 원하는 처프 펄스 플립 각도 여기를 설정합니다.
감도와 낮은 재결합 아티팩트 사이의 좋은 방법은 처프 펄스 대역폭에 대해 10킬로헤르츠인 상수를 61에서 20도로 설정하는 것입니다. 하드 펄스 길이를 이전에 보정된 볼륨으로 설정하고 psyche shape 펄스 길이를 30밀리초로 설정합니다. Crp_psyche 선택합니다.
Psyche 요소에 대한 20 모양 펄스. 사이키 요소 동안 적용되는 펄스 필드 구배의 강도는 일반적으로 프로브에 따라 구배의 최대 강도의 1에서 4% 사이로 설정됩니다. RECT를 선택합니다.
그래디언트 형상 펄스의 경우 1입니다. 순수 시프트 FID를 재구성하기 위해 획득할 블록의 수를 설정합니다. 일반적으로 블록당 64개 또는 128개의 복합 포인트가 있는 16개 또는 32개의 블록은 충분한 디지털 해상도를 제공하고 스펙트럼을 실행하며 데이터를 처리합니다.
Bruker의 proc_reset AU 프로그램과 푸리에 변환을 사용합니다. 제로 필링(zero filling)과 사인 벨 아포다이제이션(sine bell apodization)을 사용하여 스펙트럼을 변환하는 것이 좋습니다. Psyche는 의사 2D 인터페로그램 실험입니다.
일반적으로 순수 화합물 분석에서 5-20밀리초 범위의 각 블록을 획득하는 동안 작은 J 커플링 진화에서 도착하는 주기적인 측면 스팬 아티팩트의 소프트웨어이며, 이러한 아티팩트는 일반적으로 부모 피크의 5% 미만을 나타내기 때문에 무시할 수 있습니다. 그러나 복잡한 혼합물에서 일부 대사 산물의 측면 스팬 아티팩트는 덜 농축된 대사 산물의 신호보다 크거나 클 수 있어 대사 분석의 정확성을 손상시킬 수 있습니다. 이러한 인공물은 Morris Lab SAPPHIRE psyche experiment에서 개발 된 SAPPHIRE psyche라는 정신 실험의 수정을 사용하여 효율적으로 제거 할 수 있습니다.
디커플링된 스펙트럼을 얻기 위해 펄스 시퀀스는 각 블록의 중간에 있는 J 커플링에서 FID 재초점의 작은 덩어리를 획득합니다. 그러나 각 블록 중에 작은 J 커플링 진화가 발생하고 주기적인 측대역 아티팩트가 생성됩니다. SAPPHIRE psyche 실험은 J 재초점점의 이동에 의해 달성되는 체계적인 위상 조절에 의해 이러한 주기적 아티팩트가 제거되는 규칙적인 psyche sequence의 수정입니다.
각 위상 변조를 추가한 후 잔류 J 커플링 진화가 크게 억제되어 훨씬 더 깨끗한 순수 시프트 스펙트럼을 생성합니다. SAPPHIRE psyche 펄스 시퀀스를 선택하고 펄스 시퀀스 매개변수를 설정합니다. 이 시퀀스는 Bruker의 레퍼토리에 없지만 시퀀스 및 처리 프로그램은 Manchester NMR 방법론 그룹 웹 사이트에서 얻을 수 있습니다.
표준 매개변수는 다음 값, 5킬로헤르츠 스펙트럼 폭, 최소 1초 또는 2초의 이완 지연으로 설정됩니다. 더미 스캔 16회, 증분당 8회 또는 16회 스캔, D2는 14밀리초로 설정됩니다. 이 매개변수는 이완 T2가 각 J 변조 증가와 함께 일정하게 유지되도록 합니다.
원하는 처프, 펄스, 플립 각도, 여기 값, 펄스 대역폭을 설정합니다. 하드 펄스 길이를 이전에 보정된 값으로 설정하고 사이키 모양 펄스 길이를 30밀리초로 설정합니다. 사이키 요소에 대한 PSYCHE_Saltire_10kHz_30m 모양의 펄스를 선택합니다.
psyche element 동안 적용되는 pulse field gradient의 강도를 설정합니다. 그라디언트 모양에 대해 RECT. 1을 선택합니다.
F2에서 Sapphire J 변조 증분 수를 설정하고, 일반적으로 8증분은 측파대 아티팩트를 탁월하게 억제합니다. 다음 표현식을 사용하여 선택한 F3 스펙트럼 윈도우 값에서 계산된 F1 및 F2 스펙트럼 윈도우를 설정합니다. SW1 이상으로 설명되는 순수 시프트 블록 지속 시간은 일반적으로 20에서 40밀리초 사이로 설정됩니다.
순수 시프트 블록의 수를 설정합니다. SAPPHIRE psyche는 첫 번째 블록의 디커플링 위상 변조를 보상해야 하므로 추가 블록을 추가해야 합니다. 일반적으로 17개 또는 33개의 블록은 충분한 디지털 해상도를 제공합니다.
데이터를 처리하고 pm_pshift 및 pm_fidadd AU 프로그램에서 실행한 다음 푸리에 변환을 수행하며, 제로 필링을 사용하여 스펙트럼을 변환하고 벨 아포디제이션을 할당하는 것이 좋습니다. 그 결과, SAPPHIRE psyche 실험은 세 가지 다른 식물 매트릭스에서 볼 수 있듯이 결합된 공명을 멋진 선명한 단일항으로 축소하여 스펙트럼 해상도를 높입니다. 바닐라 잎, Physalis Peruviana 과일 및 SAPPHIRE Psyche 복합체 다중성을 가진 감자 괴경 예를 들어, 40 헤르츠를 통해 확장되는 거의 연속적인 신호를 생성하는 호모시트릭산의 고도로 결합 된 수소는 3 개의 날카로운 단일체로 붕괴되었습니다.
해당 지역의 다른 신호를 가릴 수 있는 혼잡을 줄입니다. 획득 분해능은 또한 2.6 내지 2.8 PPM 사이의 고도로 중첩된 영역을 명확하게 분리하는 것을 용이하게 했으며, 여기서 호모시트르산은 락톤이고 사과산 공명이 나타납니다. 예를 들어, 일반 양성자 NMR에서 글루코사이드의 신호와 겹치는 바닐라의 주요 바이오마커는 이러한 뛰어난 분해능 향상으로 인해 SAPPHIRE 스펙트럼에서 더 잘 식별되었습니다. 결론.
Pure shift는 식물 대사체학을 위한 탁월한 새로운 도구입니다. 스펙트럼 분해능이 크게 증가하여 대사 산물을 더 쉽게 식별하고, 더 미세한 상관 관계 메트릭 분석을 수행하고, 다변량 분석을 더 잘 해석할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 NMR 분석을 위해 다양한 계획 추출물을 준비하는 방법과 최적의 순수 시프트 정신 및 SAPPHIRE 정신 스펙트럼을 기록하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
