저자는 프로토콜을 개발하면서 도움이 의견 박사 Barletta 박사의 힘 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 원고의 도움이 토론 및 교정을 위해 웬디 오스틴 감사드립니다. 이 원고에 설명 된 작업은 네브라스카 - 링컨 산화 환원 생물학 센터 (부모 부여 # NCRR 2P20RR 017675, D. 베커, PI)의 대학에서 위에 나열된 각 조사자에 씨앗 파일럿 교부금의 지원을받는되었다. 또한, 우리는 연구 용품 및 본 출판물에 포함 된 NMR 기법을 표준화 씨 Halouska의 부분 급여 지원을위한 그녀의 R21 부여 (1R21AI087561-01A1)에서 자금을 제공하기 위해 박사 오필리아 Chacon 감사드립니다.

1. 프로토콜 텍스트 이 프로토콜은 M.에 NMR 방법론의 적응을 강조 결핵 (클래스 III 에이전트). M.을 실시 할 때 따라서 바이오 레벨 3 (BSL3) 관행 준수해야 매년 인증 실험실에서 결핵 연구. 실험실에서 생성 된 에어로졸에 노출이 미생물과 협력 요원에 의해 발생하는 가장 중요한 위험합니다. 다음 절차는 우리 기관에서 실시하고 있습니다 및 변형은 기관 바이오위원회의 권고에 따라있을 수 있습니다. 일반 직원은 보호 장비는 Tyvek 옷, bouffant 모자, 덧신, N95의 인공 호흡기, 눈 보호, 소매 및 니트릴 장갑의 두 쌍 구성됩니다. M. 관련된 작업 오픈 M.과 결핵 문화 및 / 또는 조작 결핵 용기는 타입 A2 또는 B2 생물학적 안전 캐비닛에 수행됩니다. 플라스틱으로 덮인 흡수 종이는 w에 위치표면을 orking. 폐기 또는 시설에서 제거 할 모든 자료 / 소모품은 두 개의 생물학적 가방에 배치하고 autoclaving하여 소독해야합니다. 작업 표면과 캐비닛 (FastPrep-24 용해 균질, 분광 광도계, 얼음 양동이 등)에서 활용 장비는 1 % Amphyl (tuberculocidal, bactericidal 살균제의, 그리고 virucidal 대리인) 각 작업 세션 후 소독을해야합니다. M.는 결핵 문화가 같은 냉동고, 인큐베이터, 원심 분리기, 그리고 냉장고와 같은 생물학적 안전 캐비닛의 외부에 위치한 큰 장비 운송을 위해 이중 억제 아래에 위치해야합니다. 원심 분리는 동봉 된 안전 컵 및 O-링 나사 톱 튜브 진행됩니다. BSL3 실험실 이외의 추가적인 분석을 위해, 세포가없는 추출물은 15 분 동안 95 ° C에서 살해 0.2 μm 필터 나 미생물 열을 통해 필터링됩니다.이 샘플은 사전 봉쇄로부터 제거에 집락 형성 단위의 부재를 확인하기 위해 도금입니다. <ol><li> 110 폴리 솔 베이트 80 (십대 초반 80 거리며 걷게을 방지하기 위해)를 포함하는 미들 7H9 전체 미디어 ML 국물 (MADC-TW) 또는 250 ML Erlenmeyer 플라스크에 적합한 매체입니다.을 전송 C-metabolites 13를 사용할 때 세중의 문화는 정기적으로 상태에 따라 재배, 10 동일한 문화는 1D 한 H NMR 프로파일에 대한 성장하고 있습니다. 두 조건 (예를 들어, 약물의 추가로 및 제외) 복제 당 문화의 두 볼륨이 성장하고 두 개의 동일한 문화로 분할 할 수 있습니다하십시오. 모든 시약 및 솔루션 조리법은 프로토콜의 끝 부분에 제공됩니다. </li><li> M.의 0.150 ML로 국물을 예방 결핵 50 % 글리세롤 주식 (얼음 해동 할 수 있습니다.) 아래 참고 1을 참조하십시오. </li><li> 문화가 37 성장하자 ° C 약 6 일 (OD 600 0.6-0.8) 100 rpm으로 흔들어. 아래의 2 내용을 참조하시기 바랍니다. </li><li> 더 항생제 대체 추가 또는 다른 치료가 필요 없으면, 문화는 수확 할 준비가 된 것입니다. 트리트먼트를 사용하는 경우, 계속바로 5 단계입니다. 오염 검사, phenotypic 분석, PCR 검사 : 각 플라스크에서 0.5 ML 샘플을 제거, 4에서 microcentrifuge 튜브 및 장소 ° 문화 적정 및 품질 관리에 대한 C로 전송할 수 있습니다. 아래 3 참고를 참조하십시오. 이 시점에서 6 단계로 진행합니다. </li><li> 셰이커에서 플라스크를 제거하고 원하는 치료 (예, 약물이나 신진 대사를 추가)을 수행합니다. 장소는 추가 기간 (예를 들어, 6-18 시간)에 대한 흔드는 및 배양에 다시 플라스크. 이 시간의 끝에서 또 다른 1.0 ML의 나누어지는을 가지고 OD 600 결정합니다. 각 플라스크에서 0.5 ML 샘플을 제거, 4에서 microcentrifuge 튜브 및 장소 ° 문화 적정 및 품질 관리에 대한 C로 전송할 수 있습니다. </li><li> 5 분을위한 얼음에 장소는 문화. 이 단계 후에는 전체 나머지 프로토콜에 걸쳐 얼음에 세포를 두십시오. 수확 2,000 XG와 4에서 원심 분리하여 문화 ° C benchtop의 원심 분리기를 사용하여 50 ML 튜브에 15 분을위한. 각 문화는 25 ML 각 (1 총없이 네 튜브가 필요합니다00 ML은 2D 1 충분한 신호 대 노이즈를 얻기 위해 필요합니다 H-13 C 문화 당 50 ML은 1D 한 H NMR 실험에 필요한 NMR 실험). </li><li> 위에서 설명한 원심 분리 매개 변수에 의해 얼음처럼 차가운 ddH 2 O (약 15 ML 처음으로 10 ML 두 번째)와 각 셀 펠렛 두 번 씻으십시오. 두 번째 세척의 경우 회전하기 전에 같은 튜브에 10 ML의 aliquots 조화를 이루고 있습니다. 1.0 ML ddH 2 O (세포 펠렛 볼륨을 조정해야합니다)의 최종 볼륨에서 세포 펠렛을 Resuspend. 거리며 걷게 무료로 하나의 세포 현탁액이 단계에서 원하는 경우, 전지가 잠시 sonicated 및 / 또는 27 게이지 바늘을 통해 세 번 통과 할 수 있습니다. 또한, 세포 펠렛은 -80 ° C에서 냉동 및 추가 처리까지 저장할 수 있습니다. 후자의 경우, 냉동 펠릿은 resuspension하기 전에 얼음에 해동됩니다. 위의 언급 1.0 ML ddH 2 O의 최종 볼륨에서 셀 알약을 Resuspend. </li><li> TransfeLysing 매트릭스 B를 (0.1 mm의 실리카 분야) 포함 2.0 ML 스크류 캡 튜브에 R 1.0 ML 세포 현탁액. 바이오 캐비닛 내부의 FastPrep-24 용해 균질를 놓습니다. 유지는 튜브의 상단에 판을 말씀 확보, 샘플 홀더에 샘플을 놔. 6m / 초의 속도 설정에서 균질에서 60 초에 샘플을 처리합니다. </li><li> 15,000 XG과 4에서 microcentrifuge에서 샘플을 돌려 ° C 펠렛 세포 파편과 그대로 셀에 10 분을위한. </li><li> 멸균 튜브에 주사기 필터 (0.2 μm)를 통해 표면에 뜨는 및 패스 샘플을 제거합니다. MADC 한천의 샘플 플레이트 0.1 ML (또는 10% 예를 들어 같은 샘플의 대표 분율은) 더 실용적 세포가 있는지 확인합니다. 조사는 또한 하나 이상의 여과 단계를 수행 및 / 또는 잠재적 인 바이오 안전성 문제를 방지하거나 식별 할 수 있도록 실시간 죽은 착색 절차를 사용하여 추출물에서 가능한 세포의 존재를 확인할 수 있습니다. 저장하는 에탄올 드라이 아이스 욕조에서 샘플을 고정-80 ° C에서 사람들이 NMR 시설에서 동결 건조하여 처리 할 준비가 될 때까지. </li><li> 2개월 후, 식민지 형성 단위의 부재를 확인하기 위해 번호판을 확인합니다. 더 CFU의이 발견되면, 샘플은 BSL3 실험실에서 촬영 될 수 있습니다. 또한 분석은 일반적으로 다중 사용자를 제공하며, 특별한 억제 요구 사항에 따라 작동하는 표준 NMR 시설에서 수행됩니다. </li><li> 건조에 샘플을 Lyophilize 다음 NMR 버퍼와 microcentrifuge 튜브에 전송 0.7 ML에 resuspend. 13,000 X g에서 3 분을위한 원심 분리기. 0.6 ML와 5 밀리미터 NMR 튜브에 전송을 제거합니다. 또는 동결 건조 된 샘플은 비 biohazardous 정기적으로 샘플 같은 외부 시설에 우편으로 발송 될 수 있습니다. </li><li> NMR 데이터가 즉시 수집됩니다. 모든 예방 조치에도 불구하고, 활성 효소는 여전히 존재할 수 있으며 샘플은 오랜 기간 동안 일반적으로 안정되지 않습니다. 샘플 m에 대한 ° C 실온에서 또는 4에서 탈락 할 때 NMR 스펙트럼의 변화는 눈에 띄는 아르일주보다 광석. 또한, NMR 데이터 수집이 샘플을 무작위로 각 카테고리에서 선택 치료 및 약물 치료를 문화, 가끔 있습니다. NMR의 스펙트럼가 수집되기 전에 특정 범주가 더 이상 지연을 가지고 있기 때문에 불필요한 편견을 방지 할 수 있습니다. 모든 치료 샘플 NMR의 스펙트럼은 약물 치료를 샘플에서 첫번째 수집하고 원인이 된 경우 데이터에 편견이 발생합니다. 샘플은 즉시 NMR에 의해 분석 할 수없는 경우, 샘플은 -80 ° C.에서 1 ML Eppendorf 튜브에 보관해야합니다 </li><li> 이러한 잠금, 심, 조정하고, 90 ° 펄스 길이의 최적화와 같은 몇 가지 일상적인 단계를 포함 후퇴-120 샘플 체인저, 악기 보정,에 샘플을 삽입 한 후 검색 결과의 품질을 최대화하기 위해 필요합니다. 하나의 샘플은 90 ° 펄스 길이를 보정하고 나머지 샘플 악기를 조정하는 데 사용됩니다. , 잠금 shimming, 모든 샘플에 대한 NMR 데이터 수집이 자동으로 쓰겠다고합니다g ICONNMR 및 gradshim. </li><li> 1D 1 H NMR 스펙트럼은 여기 조각을 사용하여 물 억제와 함께 Bruker zgesgp 펄스 시퀀스를 사용하여 수집됩니다. 32K 데이터 5482.5Hz의 스윕 폭 포인트 128 스캔,​​ 16 더미 스캔의 총 사용됩니다. 2D 한 H-13 C HSQC 스펙트럼은 Bruker hsqcetgp 펄스 시퀀스를 사용하여 수집됩니다. 5000.0 Hz의 스윕 폭 2,048 데이터 포인트의 총 직접 한 H 치수 함께 수집하고, 간접 13 C 치수를 따라 18864.9 Hz의 스윕 폭 64 데이터 포인트입니다. 스펙트럼은 소음에 좋은 신호를 얻기 위해 128 스캔 및 16 더미 스캔으로 수집됩니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig1.jpg" /> 그림 1. 실험 절차의 흐름 다이어그램이 그려져 있습니다. NMR 버퍼 50 MM 칼륨 인산 버프의 주식 솔루션50 μM의 TMSP과 어 : <ul><li> 2.17 g K 2 HPO 4 (인산 칼륨 이염 기성) </li><li> 1.70 g KH 2 PO 4 (인산 칼륨 일 염기의) </li><li> 7.86 MG 나트륨-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D, 98 %)) </li><li> &quot;100 %&quot;D 2 O 500 ML에 디졸브 </li><li> 최종 솔루션은 산도 7.2 (교정)에 있어야합니다 </li></ul> MADC-TW 또는 MOADC-TW (1 L) <ul><li> 4.7 g 미들 7H9 국물베이스 </li><li> 900 ML ddH 2 O </li><li> 두 ML의 글리세롤 </li><li> 25 분의 구성 요소와 압력솥을 섞는다. 다음 솔루션을 터치하고 추가 할 수 차가운 액체 </li><li> 100 ML ADC MOADC를 준비 할 때 MADC 또는 100 ML의 OADC를 준비 할 때 </li><li> 2.5 ML 20% 십대 초반 80 (또는 비 metabolizable 20 % Tyloxapol 1 ML) </li><li> 10 ML 1 % cycloheximide </li></ul> ADC (1 L) <ul><li> 20g D (+) - 포도당 </li><li> 50g BSA 비율V </li><li> 8.5 g NaCl </li><li> 800 ML ddH 2 O </li><li> 함께 용해 량 1 L로 조정하고 0.2 μm 필터로 소독. 4 ° C.에 저장 </li></ul> 또한, OADC (1L)를 준비하는 1 %의 올레 산 (아래의 제조법은 250 ML 배치하게)의 플러스 50 ML 위에 나열된 모든 구성 요소를 추가 할 수 있습니다. 함께 용해 량 1 L로 조정하고 0.2 μm 필터로 소독. 병은 4 ° C.에 알루미늄 호일과 가게에서 포장해야 <ul><li> 2.5 g의 올레 산 </li><li> 250 ML 0.2M NaOH </li><li> 55에서 가열하여 해동 올레 산 (냉장에 굳은) ° 10 분 및 60 분에 교반과 NaOH 용액 및 열 추가를위한 C. 알루미늄 호일에 싸서 아르 멸균 유리 병에 저장합니다. 4에 parafilm 및 매장과 인감 병 ° C. </li></ul> 선호 경우, 카탈라아제 강화와 상업 BD BBL 미들 ADC 또는 OADC을 구입할 수 있습니다. 1 % Cycloheximide (100ml) </STRONG&gt; <ul><li> 1g cycloheximide </li><li> 100 ML ddH 2 O </li></ul> 용해와 0.2 μm 필터로 소독. 4 ° C.에 저장 주의 : cycloheximide는 극단적 인 손질 때문에 독성이 있습니다. 20 % (V / V) 십대 초반 80 (100ml) <ul><li> 20 ML 십대 초반 80 </li><li> 80 ML ddH 2 O </li></ul> 20% w / V 솔루션을 준비하기 위해, 또는 십대 초반 80 20g (밀도 1.06 g / ML 약 18.9 ML)를 무게. 55 열 솔루션 ° C 30 분 분해하고, 완전히 혼합되도록. 0.2 μm 필터로 액체를 살균. 상온에서 최종 솔루션을 저장합니다. 20 % (V / V) Tyloxapol (100ml) <ul><li> 20 ML Tyloxapol </li><li> 80 ML ddH 2 O </li></ul> 20% w / V 솔루션을 준비하기 위해, 또는 Tyloxapol 20 G (밀도 1.1 g / ML 약 18.2 ML)를 무게. 디에 30 분에 55 ° C까지 열 솔루션ssolve, 그리고 완전히 섞는다. 0.2 μm 필터로 액체를 살균. 상온에서 최종 솔루션을 저장합니다. 참고 1 : M.의 글리세롤의 주식을 결핵은 다음 프로토콜을 사용하여 준비가되어 있습니다. M.의 스타킹 결핵 <ul><li> M. 성장 채도 50 ML MADC의 결핵 (OD 600 = 1.5-2.0) 37의 ° C 흔들어 조건 (100 RPM)에 따라. 변형에 따라이 7~14일 소요됩니다. </li><li> 펠렛 문화에 대한 15 분에 대해 4 ° C에서 2,000 XG에서 샘플을 봐. 표면에 뜨는 제거합니다. </li><li> 살균 50 % 글리세롤 6 ML에 Resuspend. </li><li> 4 코닝 극저온 용 시험관 및 레이블 적절에 나누어지는 1.5 ML. </li><li> -80에서 에탄올 / 드라이 아이스 욕조, 매장에서 바로 플래시 동결 튜브 ° C. </li></ul> 주 2 : Inoculating 부담 H37Rv (-80 °까지 1.5 세 C 주식) MADC 미디어의 70 ML에이 &lt;OD 600 산출/ Innova 40 쉐이커에 흔들어 조건 (100 RPM)에서 37 ° C에서 성장 5 일 후 약 0.6의 하위&gt;. 3 참고 : 문화 오염을 테스트하려면 조사는 표준 풍부한 중간에 문화 나누어지는의 예방 및 야간 부화 후 성장의 부재를 확인 수 있습니다. 일상적으로, 문화는 식민지의 형태를 관찰 및 위상 대비 현미경으로 검사 MADC 한천에 도금되어 있습니다. 설명에 따라 원하는 경우, 문화는 PCR을 사용하여 검증 할 수는 6,110 프리 머입니다. 3 2. 대표 결과 잘 준비가되어 샘플도 2에 도시 된 것과 유사한 NMR 스펙트럼을 얻을 수 있습니다. 이 스펙트럼은 M.의 표현입니다 결핵 야생 형 신진 대사 수영장을 보유하고 있습니다. 확인 metabolites는 직접 또는 간접적 D-알라닌 경로와 연결되어 있습니다. 또한, 피크 농도의 크기는 신진 대사 농도에 비례 제시세포 추출물 인치 따라서 치료 문화, 약물 치료, 그리고 돌연변이 변종 사이의 최대 농도의 변화는 metabolites과 신진 대사 경로에 섭동을 표시 할 수 있습니다. M. 결핵 1D 한 H NMR 스펙트럼은 트리플 공명, Z-축 기울기 저온 탐침이 장착 Bruker 이동이다 500 MHz의 분광계에서 수집되었다. 스펙트럼은 CA가 포함되어 있습니다. 이 아미노산, 뉴클레오티드 전구체, 그리고 glycolytic 및 시트르산 중간체를 포함한 40-50 metabolites를 식별하고 계량화 할 수 있었는지에서 400m 봉우리. Bruker 아이콘 소프트웨어와 후퇴-120 샘플 체인저는 NMR 데이터 수집을 자동화하는 데 사용되었다. 1D 1 H NMR 스펙트럼은 효율적으로 (후속 주요 구성 요소 분석 (PCA) 또는 직교 부분 최소 제곱 판별 분석에 유물을 유도 할 수 있습니다 기본 수집에 대한 필요성을 제거, 평면 기준을 용매 제거하고 유지하기 위해 여기 조각 4를 사용 수집 된 OPLS - DA). A 1D 일 H NMR 스펙트럼은 5482.5 Hz에서와 32K 데이터 포인트의 스펙트럼 폭을 25 ° C에서 수집됩니다. 16 더미 스캔 및 128 스캔의 총 스펙트럼을 얻기 위해 사용되었습니다. ACD 연구소 1D NMR 프로세서 소프트웨어는 반 자동으로 모든 1D 한 H NMR의 스펙트럼을 처리하는 데 사용되었습니다. 스펙트럼은 푸리에는 변형 단계적으로, 그리고 TMSP 정상 (0.0 ppm으로)에 참조했습니다. NMRpipe 소프트웨어 패키지는 개별적으로 2D 한 H-13 C NMR 스펙트럼을 처리하는 데 사용하고 NMRDraw으로 분석되었다. Bruker FID 데이터 파일이 처음 NMRpipe로 인식하는 파일 형식으로 변환 한 후 스펙트럼을 푸리에는 변형 된, 단계는 수정 및 제로가 가득 찼다. 1D 1 H NMR 스펙트럼 및 2D 한 H-13 C NMR 스펙트럼에서 관찰 NMR 피크는 1 H 각각 0.05과 0.50 ppm으로, 13 C 화학적 이동 허용 오차, 그리고 매디슨 Metabolomics 컨소시엄 데이터베이스 (MMCD를 사용하여 특정 metabolites에 할당 ) <suP&gt; 5 BioMagResBank, 6과 인간 Metabolome 데이터베이스. 특히 7, 1D 및 2D NMR의 스펙트럼은 NMR 화학 변화의 피크 목록 다음 인간 Metabolome 데이터베이스에 업로드하는 위치를 수동으로 피크 선택됩니다. 인간 Metabolome 데이터베이스에 의해 식별 metabolites는 NMR의 resonances 일치하고 신진 대사 네트워크에 속하는 수를 최대화 모두에 근거하여 NMR 스펙트럼에 할당됩니다. 각 화합물이나 대사는 일반적으로 여러 CH 쌍과 상응 여러 NMR의 resonances 있습니다. 따라서, 실험 NMR 스펙트럼에서 관찰 아르 이러한 NMR의 resonances의 더 많은, 더 많은 가능성이 대사가 존재합니다. 마찬가지로, 동일한 경로와 연관 여러 metabolites를 식별하는 것은 올바른 과제 확률이 높아집니다. metabolites과 신진 대사 경로의 존재는 유전자와 Genomes (KEGG) 8의 교토 백과 사전과 MetaCyc 데이터베이스 확인했습니다. 9 Mycobacterium smegm는atis는 M.에 유용한 모델 시스템입니다 결핵 및 기타 mycobacterial 병원체. M.의 다른 설명한 바와 같이, 샘플 smegmatis도 sonication에 의해 중단 될 수 있습니다. (10) <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig2.jpg" /> 그림 2. Mycobacterium의 결핵 세포 추출물의 1D 한 H NMR 스펙트럼. 대표 metabolites과 관련된 NMR 피크가 표시됩니다. 약어는 다음과 같습니다 AMP, 아데노신 모노 포스페이트, α-kg, α-ketoglutarate, GLU, Glutamate, 그리고 알라, 알라닌.

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temporal+expression+profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+in+mice.">The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).</li><li>Forgue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+metabolic+profiling+of+Aspergillus+nidulans+to+monitor+drug+and+protein+activity.">NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity.</a> J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).</li><li>Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+by+numbers:+acquiring+and+understanding+global+metabolite+data.">Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.</a> Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).</li><li>Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+Metabolomic+Profiling+in+Mice+Infected+with+Mycobacterium+tuberculosis.">NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).</li><li>Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis.">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates.">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function:+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase.">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li><li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection.">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis.">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li><li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1.">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria:+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system.">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li><li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+(LC-MS)+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery.">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li><li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy:+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox.">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li><li>Simpson, R. J., Inglis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).</li><li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis.">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li><li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis:+an+unexpected+frontier.">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li><li>Who. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Organization.">Health Organization.</a> Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).</li><li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensively+drug-resistant+tuberculosis.">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

연구의 상당수는 M.의 transcriptomic 및 proteomic 프로필을 분석 한 체외 및 생체 조건에서의 다양한 미만의 결핵. 11-16 궁극적으로 유전자 발현 및 효소 활동의 변화는 작은 분자량 분자의 농도의 변화로 이어집니다. 이 화합물의 전체 설명은 metabolome을 구성합니다. 따라서, 신진 대사 경로에 마약과 다양한 성장 조건의 효과는 metabolomic 분석 다음 될 수 있습니다. 17,18</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> ADC 농축 </td><td> BD BBL 미들 </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> 절대 후퇴-120 샘플 체인저 </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bruker 이동이다 NMR </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz의 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP1600-100 </td><td> 분수 V </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> Allegra X-15R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> 원심 분리기 튜브 </td><td> 코닝 </td><td> 430291 </td><td> 50 ML 멸균 폴리 프로필렌 </td></tr><tr><td> 극저온 튜브 </td><td> 코닝 </td><td> 430488 </td><td> 2.0 ML 멸균 폴리 프로필렌 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG 과학 </td><td> C-1189 </td><td> 유독 한 </td></tr><tr><td> D (+) - 포도당 </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> 중수소 산화물 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Erlenmeyer 플라스크 </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> 살균, 평면 기지, 폴리 카보네이트, 0.22 μm PTFE 막 환기 캡 </td></tr><tr><td> 플래시 프리즈 플라스크 </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ML </td></tr><tr><td> 건조기를 고정 </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4.5 L Benchtop </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> 보육기 </td><td> 뉴 브런 즈윅 </td><td> Innova 40 </td><td> Benchtop 흔드는 </td></tr><tr><td> Lysing 매트릭스 B </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> 용해 기계 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 에프astPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> Microfuge 22R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> 미들 7H9 국물 </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> NMR 튜브 </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> OADC 강화 </td><td> BD BBL 미들 </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> 올레산 </td><td> 시그마 </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> 이염 기성 인산 칼륨 </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 칼륨 일 염기의 </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> 회 전자 - Microfuge 22R </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> F241.5P </td><td> 봉인 및 폴리 프로필렌 </td></tr><tr><td> 회 전자 - Allegra X-15R</td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> SX4750 </td><td> 바이오 인증 표지가있는 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> 캠브리지 동위 원소 </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> 분광 광도계 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> 분광 광도계 큐벳 </td><td> 생명선 </td><td> LS-2410 </td><td> 1.5 ML의 폴리스티렌, 2 맑은 편 </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 309585 </td><td> 살균, 3 ML Luer - 무사히 다녀 오게 </td></tr><tr><td> 주사기 필터 </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> 0.2 μm 멸균 셀룰로스 아세테이트 </td></tr><tr><td> 십대 초반 80 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation of mycobacterium tuberculosis extracts for nuclear magnetic resonance metabolomic studies

Mycobacterium 결핵은 세계적 규모의 인간의 사망의 주요 원인입니다. 모두 다 (MDR)과 광범위하게 - (XDR) 약제 내성의 변종의 출현은 현재 질병 관리 노력을 탈선 위협하고 있습니다. 따라서, 현재보다 더 효과적인 의약품 및 백신을 개발하기 위해 긴급한 필요가있다. M.의 게놈 결핵은 10 년 이상 알려져 아직 유전자 기능과 본성에 대한 지식의 중요한 차이가 있습니다되었습니다. 많은 연구가 이후 유전자 발현의 글로벌 패턴에 마약, oxidants, 그리고 성장 조건의 효과를 결정하기 위해 transcriptomic 및 proteomic 수준 모두에서 유전자 발현 분석을 사용했습니다. 궁극적으로, 이러한 변경 사항의 최종 응답은 몇 천 작은 분자량의 화학 물질을 포함하여 세균의 대사 구성에 반영됩니다. 치료 또는 TR하거나, 야생 유형 및 돌연변이 변종의 대사 프로파일을 비교특정 약물과 함께 eated 효과적으로 목표 식별을 허용 할 수 및 안티 결절 활동으로 소설 억제제의 발전으로 이어질 수 있습니다. 마찬가지로, metabolome에 두 개 이상의 조건​​의 영향도 평가 할 수 있습니다. 핵 자기 공명 (NMR)은 신진 대사 중간체를 식별하고 정량화하는 데 사용됩니다 강력한 기술입니다. M.의 준비를 위해이 프로토콜의, 절차 NMR metabolomic 분석을위한 결핵 세포 추출물이 설명되어 있습니다. metabolites의 보존을 최대화하기 위해 차가운 온도를 유지하면서 세포 문화는 적절한 조건 및 필요한 바이오 레벨 3 억제, 1 수확에서 성장하고, 기계 용해를 받게됩니다. 세포 lysates가 회복되며, 소독, 그리고 매우 낮은 온도에서 저장 필터링. 이러한 세포 추출물에서 Aliquots이 가능한 세포의 부재를 확인하기 위해 집락 형성 단위 미들 7H9 한천에 도금되어 있습니다. 37 번 부화 두 달 ° C, 경우에 따라 더 바이올라 없습니다수 식민지가 관찰되며, 샘플은 하류 처리를위한 밀폐 시설에서 제거됩니다. 추출물은 동결 건조 된 진정제를 맞았을 버퍼에 resuspended하고 통계 분석의 대상이되어 spectroscopic 데이터를 캡처, NMR 장비에 주입되어 있습니다. 설명되어있는 절차는 (1D) 한 차원 1 H NMR 및 2 차원 (2D) 1 H-13 C NMR 분석 모두에 적용 할 수 있습니다. 이 방법론은 크로마토 그래피 방법보다 더 신뢰할 수있는 작은 분자량 대사 식별 및 세포 추출물 신진 대사 작품보다 안정적이고 민감한 양적 분석을 제공합니다. 절차의 변화가 세포 용해 단계에 따라 설명이 병렬 proteomic 분석을 위해 적용 할 수 있습니다.

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

의 metabolomic 프로필<em&gt; Mycobacterium 결핵</em&gt; 국물 문화의 성장 후 결정됩니다. 조건이 미생물의 대사 프로필에 영양 보조제, oxidants, 그리고 안티 - 결핵 요원의 효과를 테스트하기 위해 다양한 수 있습니다. 추출 준비를위한 절차 1D 모두 적용됩니다<sup&gt; 1</sup&gt; H 및 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C NMR 분석.

의 샘플 준비<em&gt; Mycobacterium 결핵</em핵 자기 공명 Metabolomic의 연구&gt; 압축을 풉니 다

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

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15.2K 조회수.  University of Nebraska-Lincoln. 의 metabolomic 프로필 Mycobacterium 결핵 국물 문화의 성장 후 결정됩니다. 조건이 미생물의 대사 프로필에 영양 보조제, oxidants, 그리고 안티 - 결핵 요원의 효과를 테스트하기 위해 다양한 수 있습니다. 추출 준비를위한 절차 1D 모두 적용됩니다 1 H 및 2D 1 H- 13 C NMR 분석.

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Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

Microtiter 플레이트 형식의 맛을 희석하여 첫 번째와 두 번째 라인 의약품 Mycobacterium 결핵의 복합 항균 자화율 테스트

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

연구

면역학 및 감염병학

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

의 성장 결핵은 Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

자연의 전송에 결핵 말라리아 동시 감염을 연구하는 실험 모델 결핵균와 변형체 berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

다중 약물 내성을 보여<em&gt; 결핵균</em&gt; 증폭 마이크로 어레이

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

복구하는 새로운 미세 절제 접근<em&gt; 결핵균</em폐 육아종 임베디드 포르말린 고정 파라핀에서&gt; 특정 성적 증명서

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

에 대한 기능성 연구를위한 3D 인간의 폐 조직 모델<em&gt; 결핵균</em&gt; 감염

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

18FDG PET/CT 영상 공부 결핵균 감염 및 비 인간 영장류에서 치료 도구로 서의 분석

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...