이 작품은 의생명 과학 (AKM)에 버로우즈 웰컴 경력 수상에 의해 지원되었다, 화이트홀 재단 연구 그랜트 (AKM), 슬로언 재단 원정대 (AKM), NIH EY019277 (AKM), 그리고 네이 자금, 비전 교육 그랜트 EY013319 ( EAK).

<ol><li> 두 광자 현미경, 뉴런은 형광 마커로 표시하는 준비를 사용하여 손상 두뇌의 뉴런을 시각화하는 데 사용됩니다. 실험 여기서 소개 우리는 계층, 5 피라미드 세포 1 라벨 GFP - M 유전자 변형 마우스 라인을 사용합니다. 레이어 5 피라미드 세포는 피아의 수준 아래에 300 μm의 깊이 dendrites과 돌기 쪽이의 시각화를 허용, 표면 레이어로 돌기 프로세스를 프로젝트. 대체 접근법은 바이러스 마커를 (어리 외를 참조하십시오., 조브에 제출)를 사용하여 레이블 셀 수 있습니다. </li><li> 무균 수술을 70 % 에탄올과 압력솥 도구를 사용하여 작업 영역을 소독. 깨끗한 드레싱과 표면을 운영 커버. </li><li> IACUC 승인 절차를 사용 Avertin의 4 분의 1 분량 (0.0075 MG / ML)가 따랐다. 펜타 닐 칵테일 (;, midazolam 5 MG / kg metatomadin 0.5 MG / kg 펜타 닐 0.05 밀리그램 / kg)로 쥐를 마취 진통제와 함께 생쥐를 Pretreat, buprenorphine은 (0.5 밀리그램 / kg) (SQ) subcutaneously 관리. 꼬리 / 발가락 공략 테스트 반응에 의해 마취 비행기의 수준을 모니터링합니다. </li><li> 37.5에서 동물을 유지 ° C 첨부된 직장 온도계와 가열 담요를 사용합니다. </li><li> 밖으로 건조에서 눈을 방지하기 위해 눈 안과 연고를 적용합니다. 수술 중 광원으로부터 눈을 보호하기 위해 종이의 작은 시트와 후드 눈. </li><li> 가위를 사용하여 눈 머리 뒤쪽 (귀 뒤쪽)에서 머리를 제거합니다. </li><li> 70 % 에탄올의 연속적인 응용 프로그램과 함께 동물의 머리의 정상을 청소, betadine 스크럽과 betadine 솔루션으로 따라갔다. </li><li> 눈 정중선 (몇 군데하게됩니다 반구에 따라 다름) 중 하나를 오른쪽 또는 왼쪽 귀 최대 뒤에 L - 컷 절개를합니다. 피부를 통해 접어 거리 수술 사이트에서. 피부가 이미징 세션 다음 봉합한다로 피부를 제거하지 마십시오. </li><li> 좋은 집게를 사용하면 부드럽게 관심의 영역에서 피부를 당겨 멀리. </li><li> 부드럽게 청소 포셉 또는 microsurgical 블레이드와 두개골의 노출된 영역에서 골막 멀리 다쳤어요. 면봉을 사용하여 완전히 골막 멤브레인을 건조하고 그것이 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 두개골에 10 % 산화철 클로라이드의 작은 금액을 적용합니다. 두개골 (11 참조) 접착제의 적절한 준수를 보장하기 위해 완전히 건조하는 것이 중요합니다. 포셉 또는 microsurgical 블레이드를 사용하여 부드럽게 멀리 말린 골막 막을 다쳤어요. </li><li> 스테인리스 스틸 헤드 플레이트 (그림 1 참조)과 부착 두개골에 접시의 이미지 창 주위 cyanoacrylate 접착제의 얇은 레이어를 적용합니다. </li><li> 솜 면봉 스틱의 나무 끝​​을 사용하여 이미지 창 안쪽 솔기에 접착제를 적용, 이미징 플레이트와 두개골의 곡률 사이의 모든 간격을 작성​​해야하고. </li><li> 창에 접착제 가속기의 드롭 놓습니다. 빠르게 멀리 목화 면봉이나 김 닦아와 함께 여분의 접착제 가속기를 닦으십시오. 접착제가 완전히 드릴링 전에 확정되어야합니다. </li><li> 0.7 mm 스테인레스 스틸 버와 부착된 치과 드릴을 사용하여 이미지 윈도우의 두개골을 얇은 시작합니다. 0.9 % 멸균 생리의 가끔 응용 프로그램과 함께 대체 드릴링이 두개골에 너무 많은 열을 발생하지 않도록합니다. </li><li> 치과 드릴로 두개골 표면에 걸쳐 작은 스트로크를 사용하여 두개골의 얇은 4X4 mm의 창. 뭉툭한 끝 포셉와 두개골의 두께를 테스트합니다. 두개골 표면은 부드러운 압력으로 약간 들여쓰기됩니다. 이미징을위한 최적의 두개골 두께는 10 ~ 30 μm의 수 있습니다. </li><li> 두개골이 얇은이고 윈도우, 모든 파편의 두개골에 호수 장소를 청소하는 경우. 해부 범위에 장착된 디지털 카메라로 이미지 창을 사진에 담아보세요. 두뇌 vasculature의 사진과 사용 이후의 영상 세션에 대한 이미징 플레이트 곳으로 위치를 찾는데 도움이됩니다. </li><li> 2 - 광자 장비에 동물을 운송. 동물은 전체 영상 세션 동안 가열 담요 (직장 프로브)에서 유지됩니다. 참고 : 진정제를 맞았 는데도 있지만, 동물의 핵심 체온이 대뇌 피질의 손상 또는 사망 가능성의 결과 가열 장치의 부재에 크게 변동합니다. </li><li> 마이 타이 레이저, 최대 전력 및 수정할 올림푸스 Fluoview 공촛점 단위에 대한 10W 고체 펌프와 함께 두 개의 광자 현미경이 사용됩니다. 시스템은 깊은 조직 이미징에 최적화되어 있으며 두뇌에서 형광의 최대한의 검출을 허용하는 최대한 외부 감지기는 목표에 가까이 설치됩니다. 올림푸스 LUMPlan 층 / IR 20X/0.95NA 목표 렌즈가 사용됩니다. 0.9 %의 염분이 목적을 위해 이미징 잠수하는 동안 사용됩니다. </li><li> 이 현미경을 사용하고, 낮은 디지털 줌 (1 개)은 밝게 표시 뉴런을 포함하는 영역을 식별합니다. </li><li> 현미경 아이 조각에 부착된 디지털 카메라를 사용하여 이미지 영역의 사진을 가져가라. 또는 혈액 vasculature 패턴을 스케치. 이것은 다시하는 것이 필요합니다이후 시점에 동일한 이미지 위치를 설정합니다. </li><li> 돌기 분지의 범위를 보여주는 뇌 (보통 ~ 200 μm의를 스팬)의 전체 가시 범위를 통해, 낮은 배율 스택 (5 μm의 단계 x20 목표, 512x512 픽셀) 구합니다. 참고 :이 낮은 배율 이미지가 혈관과 dendrites 모두 젊은 성인 동물들의 구조를 유지하는 등 이후 시간 지점에서 이미지 영역을 찾습니다하는 데 사용됩니다. </li><li> 이미징 소프트웨어 (Fluoview, V. 5.0, FV300)를 사용, 8 배 디지털 확대를 향상시킬 수 있습니다. X, Y 좌표 (팬 좌표) 필요한 경우를 조정하고 위치 및 돌기 쪽이 구조를 포함한 상세한 돌기 형태를 보여줍니다 높은 배율 스택을 수집합니다. 각 스택 컬렉션, 즉 이동 좌표, 수집, Z - 단계 크기 및 스택에서 단계의 숫자의 범위에 관한 자세한 메모를 가져가라. 이후 시점에서이 dendrite 또는 축삭를 다시 방문할 경우 이러한 노트가 사용됩니다. </li><li> 이미지에 따라 부드럽게 두개골 표면에서 판을 분리하여 헤드 플레이트를 제거합니다. 포셉을 사용하여 두개골에 남아있는 잔여 접착제를 제거하고 0.9 % 멸균 식염수에 두개골 표면을 닦으십시오. # 6 suturing 스레드를 사용하여 함께 두개골을 통해 피부를 봉합. 70 % 에탄올로 영역을 닦아주십시오. 이후 수술 복구하는 동안 통증을 완화하기 위해, 0.1 MG / kg Buprenorphine의 진통, SQ를 관리할 수 있습니다. </li><li> 가열 램프 아래에 깨끗한 케이지에 넣어 동물이 깨어나면 및 모바일 때까지. 원래 케이지로 동물을 반환합니다. </li><li> 나중에 지점 (우리 이미징 시간 포인트가 2 일로부터 떨어져 여러 달 동안에 어디 에나있을 수 있음)에서 reimage 동물하려면, 실밥을 제거할 이상과 같은 무균 방법을 사용하여 머리에 피부를 다시 엽니다. 원래 이미지 위치를 찾습니다 두뇌 vasculature (첫 번째 수술 날짜에 촬영)의 디지털 이미지를 사용합니다. Reaffix 스테인리스 스틸 headplate (10-12 단계). 부드럽게 이미징 시간 지점 간의 다시 성장있을 수있는 뼈를 멀리 얇게하는 microsurgical 블레이드를 사용합니다. 경우, 필요한 치과 드릴 얇은. 지우기 이미징 파편의 창을 0.9 % 멸균 생리의 드롭을 적용합니다. </li><li> 두 광자 현미경을 동물을 운반하고 원본 이미지 필드를 찾습니다. 도움 첫번째 이미지 세션 중에 찍은 디지털 사진을 사용합니다. </li><li> Fluoview 프로그램을 열고 원래 낮은 배율 이미지를 엽니다. 접사 컴퓨터 화면과 스케치에 대한 투명성 시트 투명 펜을 사용하여 주요 혈관 패턴. </li><li> 라이브 이미지를 열고 투명 필름 스케치 패턴 혈액 vasculature를 재개. </li><li> 구조 확대할 8X를 reimage하려면 이전 이미지 세션에서 원하는 수집한 스택을 엽니다. 컴퓨터 화면에 부착된 구조 (glial, 돌기, 즉 axonal) 투명 필름에을 스케치. </li><li> 라이브 이미지에서 8 배속으로 확대하고 냄비를 설정 첫날 이미징 매개 변수를 조정합니다. 낮은 배율 위치를 정렬의 정확성에 따라, 또한 약간 이미지의 각도를 조정해야 할 수도 있습니다. 원하는 구조가 발견되면 귀하의 스케치 높은 배율 패턴의 구조를 일치합니다. 후속 분석을 위해 Z - 스택 이미지의 동일한 단계의 크기 및 숫자와 Z - 스택을 수집합니다. </li><li> 모든 높은 배율 이미지를 다시 수집 때까지 단계 29 30 단계를 반복합니다. </li><li> 이미징이 완료되면, 반복 22-24 단계를 반복합니다. 다시 영상은 2 개의 분리된 시간 지점에서 최대 반복 수 있습니다. </li><li> 동물 실험은 실험실 동물 관리의 평가와 인증을위한 협회에 의해 전체 인증에서 의학 및 치의학의 로체스터 대학의 실험실 동물 의학의 동식물 사육장과 본부가 정한 지침과 규정에 따라 수행되었습니다 주법, 연방 법령 및 NIH 정책을 준수 국제 (AAALAC)와 있습니다. </li></ol> 대표 결과 GFP - M 표현 생쥐에서 레이어 5 피라미드 세포 돌기와 해당 프로세스의 하위 집합은 쉽게 2 - 광자 레이저 스캐닝 현미경 (2PLSM 1)를 사용하여 시각하실 수 있습니다. 여기서 우리는 원하는 영상 위치에 걸쳐 두개골이 ~ 10-30 μm의에 thinned되는 thinned - 두개골 준비를 보여주었다. 제대로 수행, 우리 프로토콜은 우리가 명확하게 급성 또는 만성 분석 (그림 2)에 대한 손상 시각 피질에서 대뇌 피질의 dendrites 및 쪽이을 시각화 수있었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 사용자 정의 머리와베이스 플레이트. thinned - 두개골 수술 준비에 사용되는 사용자 정의 만든 머리와베이스 플레이트의 (A) 톱 볼 수 있습니다. 맞춤 만든 머리와베이스 플레이트의 (B) 사이드 볼 수 있습니다. (C, D) 헤드 판에 대한 상세한 약도와 이미지. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="그림 2" /> <stroNG&gt; 그림 2. 2PLSM의 대표 결과는 얇은 두개골 준비를 따라. (A) Dendrites은 두 광자 현미경을 사용하여 유전자 변형 GFP - M 마우스의 시각 피질의 생체내에 몇 군데. 이미지가 175 μm의의 최종 깊이 피아에서 매 5 μm의를 취득 하나의 이미지의 투영이다. 의 박스 영역의 확대 영역을 나타냅니다 (B)와 (C) 0 (D0), 넷 일 후 (D4) 하루에 몇 군데. 안정 쪽이 (흰색 화살표 머리)를 보여주는 B와 C의 박스 돌기 지점 (D, E) 고등 배율은 / retracting의 쪽이 (레드 애로우 헤드)와 새로운 쪽이 (녹색 화살표 머리)를 잃었습니다. 스케일 바 = A. 200 μm의, B, C. 20 μm의, D, E. 5 μm의.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

두 광자 현미경을 사용하여 만성 영상은 소성 2-5 동안 트리거 형태학의 변화를 연구하기 위해 점점 더 인기가 기술되고 있습니다. 여기 우리는 다른 이미징 일에 그대로 마우스의 뇌에 식별 돌기 쪽이에 따라 thinned - 두개골 준비를 보여줍니다. 이 프로토콜에서는 두개골은 피질에 최소한의 손상을 초래하고 두뇌 기능 6을 변경할 수도 있습니다 neuroinflammation 매우 낮은 수준의 결?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomindine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Midazolam HCL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-tribromoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
</td>
</tr>
<tr>
<td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
</td>
</tr>
<tr>
<td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CWE, Inc.</td>
<td>TC-1000 Mouse</td>
<td>Body Temp. Regulation</td>
</tr>
<tr>
<td>Toberadex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eye Ointment</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Ferric Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical, Inc.</td>
<td>3120-32</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsurgical Blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Industries</td>
<td>S-6400</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 404,401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 46551</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 40140</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Zip Kicker Glue Accelerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacer Technology</td>
<td>PT-29</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K8894H</td>
<td>Taper C-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (2PLSM)를 사용하여 생체내 이미징에서 그대로 뇌 속에 살아있는 세포와의 연결 프로세스의 연구는 있습니다. 여기에 제공 기술은 CNS에 postsynaptic 흥분성의 사이트의 대부분을 나타내는 작은 구조 아르 돌기 쪽이의 추적을 허용하는 미세한 해상도 몇 시간 포인트 (만성 영상)에서 두뇌의 동일한 지역의 영상을 허용합니다. 분명 몇 시간 동안 지점 미세 외피 구조를 해결하는 능력은 시냅스 및 회로 개조의 형태학의 변화가 근본적인 메커니즘을 설명할 수 있도록 도와있는 뇌 소성의 연구에서 특히 많은 장점이 있습니다. 이 비디오 및 보조 자료에서 우리는 thinned - 해골 준비를 사용하여 손상 두뇌의 생체내 이미징에서 만성위한 프로토콜을 보여줍니다. thinned - 두개골 준비 따라서 염증 반응의 발병을 줄일 수 두라 및 / 또는 피질에 잠재적인 손상을 피할 수 법으로서 접근 방식입니다. 이 프로토콜이 올바르게 수행되면, 그것은 분명 시간의 장기간 동안 손상 두뇌에 돌기 척추 특성의 변화를 모니터링 할 수 있습니다.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을 표시<em&gt; 생체내에</emthinned - 해골 준비를 사용하여 손상 뇌&gt; 영상.

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K 조회수.  University of Rochester. 이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을 표시 생체내에 영상.

비디오: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

연구

신경과학

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

에 얇게 - 두개골 두피 창 기술<em&gt; 생체 내</em&gt; 광 결맞음 단층 촬영 영상

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

하이 필드의 fMRI를 사용하여 성인 고양이의 청각 피질의 기능적 이미징

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed as candidate sites for misrouting. Since a correlation between the number of lateral geniculate nucleus (LGN) relay neurons and LGN size has been shown, and based on previously reported reductions in LGN volumes in human albinism, we suggest that fiber projections from LGN to the primary visual cortex (V1) are also reduced. Studying structural differences in the visual system of albinism can improve the understanding of the mechanism of misrouting and subsequent clinical applications. Diffusion data and tractography are useful for mapping the OR (optic radiation). This manuscript describes two algorithms for OR reconstruction in order to compare brain connectivity in albinism and controls.An MRI scanner with a 32-channel head coil was used to acquire structural scans. A T1-weighted 3D-MPRAGE sequence with 1 mm3 isotropic voxel size was used to generate high-resolution images for V1 segmentation. Multiple proton density (PD) weighted images were acquired coronally for right and left LGN localization. Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired with 64 diffusion directions. Both deterministic and probabilistic tracking methods were run and compared, with LGN as the seed mask and V1 as the target mask. Though DTI provides relatively poor spatial resolution, and accurate delineation of OR may be challenging due to its low fiber density, tractography has been shown to be advantageous both in research and clinically. Tract based spatial statistics (TBSS) revealed areas of significantly reduced white matter integrity within the OR in patients with albinism compared to controls. Pairwise comparisons revealed a significant reduction in LGN to V1 connectivity in albinism compared to controls. Comparing both tracking algorithms revealed common findings, strengthening the reliability of the technique.

This manuscript describes deterministic and probabilistic algorithms for white matter (WM) reconstruction, used to examine differences in optic radiation (OR) connectivity between albinism and controls. Although probabilistic tractography follows the true course of nerve fibers more closely, deterministic tractography was run to compare the reliability and reproducibility of both techniques.

확산 텐서 영상 및 Tractography를 사용하여 인간의 백색증의 기본 시각 통로에 연결 측정

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

쥐에서 만성 이식을 위한 말초 신경 자극 전극의 준비

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...