이 프로토콜은 바이러스 주사를 수행하고 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포를 이미징하기위한 두개골 창을 이식하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 장점은 뉴런과 성상 세포의 구조와 활동이 여러 세션에 걸쳐 반복적으로 이미징 될 수 있다는 것입니다. 이 접근법은 신경 발달 또는 신경 퇴행성 장애의 모델에서 신경 세포가 어떻게 변화되는지, 또는 경험 의존적 가소성이 손상되는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있습니다.
마취 된 마우스를 클램프와 이어 바를 사용하여 입체 택시 프레임에 고정시키는 것으로 시작하십시오. 멸균 수술 도구를 사용하여 브레그마 앞쪽의 전두엽 봉합사에서 람다 뒤쪽으로 피부를 자르고 제거하십시오. 멸균 크기 11 탄소강 수술 블레이드를 사용하여 두개골에서 모든 결합 조직을 부드럽게 긁어냅니다.
치과 훈련의 도움으로 점차적으로 두개골 뼈를 동심원의 개구부 윤곽을 따라 뚫고 뼈를 얇게 만듭니다. 각 동심원 통과 후, 드릴링된 부위에 식염수 한 방울 또는 두 개를 첨가하고, 드릴링을 재개하기 전에 식염수를 적어도 10초 동안 앉히도록 한다. 미세한 포셉으로 두개골 뼈의 중앙 영역을 부드럽게 밀어 두개골이 적절하게 얇아지고 움직이는지 확인하십시오.
드릴링이 발생한 하부 혈관 구조가 손상되지 않았는지 확인하고 뼈가 금이 가지 않았는지 확인하십시오. 얇아진 뼈에 미니어처 15도 뾰족한 칼날을 조심스럽게 삽입하고 식염수에 담근 젤 폼을 잘라 사용하여 발생할 수있는 출혈을 막으십시오. 포셉을 사용하여 조심스럽게 뼈를 들어 올리고 제거하여 경막이 손상되지 않도록주의하십시오.
주사를 위해, 멸균 경사 유리 피펫을 바이러스 혼합물로 20 마이크로 미터 팁으로 채 웁니다. 그런 다음 피펫을 내려 뇌 표면에 닿게 하고, 2/3층 주사를 위해 추가로 200 내지 300 마이크로미터를 더 낮추십시오. 세포내 미세주입 분배 시스템을 사용하여, 2분에 걸쳐 시스템을 12 내지 15회 압력 주입한다.
두개골 창 이식을 위해, 두개골의 개구부 위에 덮개 유리를 놓으십시오. 포셉을 사용하여 유리가 개구부 위로 플러시되도록 하십시오. 유리 창의 가장자리를 두개골에 밀봉하려면 유리 표면의 둘레 주위에 시아 노 아크릴레이트 접착 젤을 바르십시오.
접착 젤 위에 접착제 층을 바르십시오. 그런 다음 치과 시멘트 액체 층을 추가하십시오. 치과 시멘트가 경화되면 헬리콥터 형 헤드 플레이트의 중앙 개구부 주위에 얇은 접착제 층을 적용하고 커버 글라스 위에 적절한 크기의 헬리콥터 유형 헤드 플레이트를 놓습니다.
접착제가 마르게하십시오. 치과 시멘트 분말을 1.5 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브에 0.1 밀리리터 마크까지 첨가하십시오. 빠른 경화 인스턴트 접착제의 일곱 ~ 여덟 방울을 분말에 혼합하고, 결과 혼합물을 절단 된 19 게이지 바늘이있는 1 밀리리터 주사기에 그려서 더 큰 구멍을 만듭니다.
양쪽에서 스며들 때까지 헬리콥터 바의 측면 구멍을 통해 분말 혼합물을 주입하십시오. 치과 시멘트 접착제 혼합물을 노출 된 두개골의 나머지 부분에 적용하여 머리 판을 두개골에 고정시킵니다. 마우스를 천으로 감싸고 헤드 플레이트를 통해 공수 홈 케이지의 헤드 고정 암에 고정시킨 다음 홈 케이지를 빛에 노출시킵니다.
15 분의 습관화 시간이 지나면 홈 케이지에서 마우스를 제거하십시오. 현미경의 넓은 필드 모드를 사용하여 쉽게 식별 할 수있는 혈관 구조의 두 개에서 세 개의 위치를 선택하십시오. 혈관의 이미지를 저장하고 모터 컨트롤러에 나타나는 x 및 y 좌표를 기록하십시오.
성상세포에서의 뉴런의 시냅스 구조 및 GCaMP6f 활성을 이미지화한다. 대표적인 분석에서, 두개골 창의 품질은 수일에 걸쳐 수상 돌기 및 GCaMP6f 발현 성상세포의 반복 이미징으로 평가되었다. 좋은 창문에서, 신경 구조는 명확하게 보이는 수지상 척추와 함께 선명하게 보였다.
이미징 둘째 날에 두 개의 새로운 척추가 나타났습니다. 단 하나의 척추 만 지속되었고 다섯 번째 날에는 눈에 띄었습니다. 칼슘 활성은 상이한 시점에서 GCaMP6f를 발현하는 성상세포에서 연구되었다.
전체 세포를 포괄하는 세계적인 사건이 운동 시합 중에 목격되었습니다. 이 프로토콜의 두 가지 중요한 단계는 뼈를 제거하기 전에 뼈를 적절하게 얇게하고 덮개 유리를 개구부 위에 적절하게 배치해야한다는 것입니다. 이미징은 이미징 중 행동 분석이나 새로운 운동 기술 학습과 같은 사후 행동과 결합하여 신경 및 성상 세포 구조와 기능이 학습에 의해 어떻게 조절되는지 결정할 수 있습니다.
