우리는 건강 연구를위한 영국 국립 연구소, 박사 Hadwen 트러스트 동물 애호 연구소, 영국의 선도적인 의료 연구 자선 기금은 독점적이 아닌 동물 연구 기법을 동물 실험을 대체하기 위해, 그리고 Wellcome 트러스트 (그랜트 089215)의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 노바티스 제약 영국 공사 (무제한 교육 교부금)을 인정합니다.

1. 인공 가래 매체의 준비 (ASM) <ol><li> 몇 시간에 걸쳐 매우 느리게 생선 정자에서 250 ML 멸균 물에 4g의 DNA를 추가합니다. DNA는 완전히 분해하는 데 몇 시간이 소요되며 실온에서 하룻밤 흔들 수있다. </li><li> mucin가 완전히 해소되기 전까지 돼지의 복부 (타입 II) 느리게 250 ML 멸균 물에서 5g의 mucin을 추가합니다. 솔루션은 4에서 하룻밤 흔들 수있다 ° C. </li><li> 100 ML 멸균 물 속에서, L-티로신과 L-시스테인의 예외와 함께, 각 필수 및 비 필수적인 L-아미노산의 0.25 g를 해산. 0.5 M의 수산화 칼륨 25 ML 멸균 물의 L-티로신의 (M R 56.11 g / 몰) 및 0.25 g의 25 ML에 L-시스테인의 0.25 g를 해산. </li><li> 5.9 MG diethylenetriaminepentaacetic 산 (DTPA), 멸균 물 100 ML에서 KCl의 5g NaCl 2.2 g을 용해. </li><li> 1리터 병에 DNA, Mucin, L-아미노산, DTPA, NaCl과 KCl을 결합. </li><li> 계란 노른자 전자의 5 ML 추가mulsion 및 멸균 물 약 850 ML로 채웁니다. </li><li> 1 M 트리스 (산도 8.5; M R 121.14)과 6.9로 산도를 조절하고 살균 물로 볼륨 1리터로 와요. </li><li> 각각 0.22 μm의 45 mm의 구멍과 목에 크기로 Vacuubrand ME 2 격막 진공 펌프 및 Millipore Steritop 필터 장치를 이용하여 여과하여 ASM을 소독. 각 Steritop 필터 유닛은 세 번 즉시 다시 사용할 수 있지만 필터 다시 사용하기 전에 멸균 물로 두 번 씻어서해야합니다. 여과 과정은 느리게 그리고 2 일 동안 수행할 수 있습니다. ASM의 다른 버전 대신에 가능한 약물 상호 작용에 의한 여과 그러나 11의 항생제의 추가를 사용하는 것이 개발되어, 우리는이 특정 응용 프로그램에 대한 방법을 권장하지 않습니다. </li><li> 필터없는 그리고 ASM 필터링은 어두운에서 4 ° C에 보관해야합니다. 신선한 ASM을 사용하는 것은 권장하지만, 그것은 1 개월 최대 이러한 조건 하에서 보관하실 수 있습니다. </lI&gt; </ol> 2. Planktonic 고착의 셀 최소 신진 대사 억제 농도 (PSMIC)의 결정 <ol><li> 15 planktonically 성장 P.의 최소 신진 대사 억제 농도 (PSMIC) 값을 확인하려면 녹농균이라는 박테리아의 분리, 항균 화학 요법 BSAC 12 영국 사회의 가이드라인에 설명된대로 microdilution 방법은, 수행하여야한다. 선택의 항생제,이 경우 tobramycin의 황산염에 순차적으로 항생제 농도의 적절한 범위를 제공하기 위해 96 - 웰 플레이트에 microtitre Luria-Bertani (LB) 배지에 희석한다. </li><li> P.의 야간 문화를 희석 0.05의 OD 600 ~ LB에서 박테리아 (± 0.01)과 순차적으로 희석 항생제 100 μl를 포함하는 96 - 웰 microtitre 플레이트의 우물에 100 μl 볼륨을 추가합니다. 0.5 μg / ML -이 경우, tobramycin 황산염의 최종 농도는 512 사이에서 원거리. 여덟은 각 antib의 복제iotic 집중력이 수행되어야한다. </li><li> 각 격리에 대한 부정적 제어 우물은 더 항생제가 추가되지되는, 설정해야합니다. 또한, 여덟 웰스는 다운 스트림 분석하는 동안 공백으로 사용 (제 2.6)에 대해서만 LB를 포함해야합니다. </li><li> (5 % O이 10 % CO 2, 그리고 85% N 2) 에어로빅이나 microaerophilic 조건 하에서 떨지 않고 37 ° C에서 2 일 - 1 96 - 웰 microtitre 번호판을 품어. Microaerophilic 조건은 대형 무산소 항아리에 CampyGen 가스 생성 팩을 사용하여 얻을 수 있습니다. </li><li> 부화 후, 세균성 성장 Fluostar 오메가 microplate 리더와 MARS 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 600 nm의 파장의에서 각도의 세균성 문화의 흡광도를 측정하여 결정됩니다. </li><li> 항생제 - 처리 planktonic 문화 (항생제 치료 planktonic 세포)과 부정적인 컨트롤 (제어 부정)에서 흡수에서 흡수 뺀것에 의해 해결되어야유일한 우물이 포함된 LB (빈)에서 얻은 배경 흡광도의 이온. 생존의 비율 억제는 이후 X 100 % (항생제 치료 planktonic 전지를 의미 / 부정적인 통제를 의미)로 계산됩니다. PSMIC 90은 planktonic 세균의 성장을 90 % 억제를 일으키는 항생제 농도로 정의됩니다. </li><li> 선택의 항생제, 10 0.02 %의 μl (V / V) resazurin이 (증류수에 희석) 각도에 추가되고 접시가 1 호기성 조건 하에서 incubated하고 치료 후 세균의 생존을 결정하기 위해서 - 37.2에서 2 H ° C, 150 rpm으로 떨고있는 동안. 실행 가능한 세포가 형광 핑크 resorufin 양식으로 푸른 resazurin을 염색 줄어 듭니다. </li><li> resazurin과 부화에 따라 각각 아니라 540 nm의의 여기 파장과 Fluostar 오메가 microplate Reader에서 590 nm의의 방출 파장을 사용하는 형광을 모니터합니다. 이 설명한 것처럼 데이터를 분석해야낮은. </li></ol> 3. Biofilm 고착의 세포 최소 억제 농도의 결정 (BSMIC) <ol><li> P.의 숙박 문화 녹농균이라는 박테리아가 (이 경우, P. 박테리아의 15 분리가 사용됩니다) 0.05의 OD 600 (± 0.01), 신선한 ASM에 나서 더욱 희석 1:100으로 LB에 희석한다 (총 판매량 1.8 ML). </li><li> 희석 문화 (1.8 ML)는 24 잘 조직 문화 처리 강판의 각도에 추가되어 있어야합니다. 세 우물은 다운 스트림 분석하는 동안 공백 (제 3.9)로 사용하기 위해 ASM 포함되어야합니다. </li><li> 75 rpm으로 떨고있는 동안, 37 ° C에서 에어로빅이나 microaerophilic 조건 하에서 3 일간 실험실 parafilm과 부화로 24 잘 번호판을 고정합니다. Microaerophilic 조건은 대형 무산소 항아리에 CampyGen 가스 생성 팩을 사용하여 얻을 수 있습니다. </li><li> 신선한에 적절한 농도 범위를 제공하기 위해,이 경우 tobramycin의 황산염에 선택의 항생제를 희석ASM. 1 μg / ML -이 경우, 최종 농도 512 사이의 원거리. 24 잘 플레이트의 적절한 우물에 200 μl의 볼륨에서 항생제의 각 농도를 추가합니다. 넷은 각 항생제 농도 복제 수행해야합니다. 선택의 항생제에 노출되지 Biofilms는 부정적인 제어로 사용되었다. </li><li> 75 rpm으로 떨고있는 동안, 37의 추가 24 H를위한 에어로빅이나 microaerophilic 조건 ° C 하에서 실험실 parafilm과 부화로 24 잘 번호판을 고정합니다. </li><li> 선택의 항생제의 존재에서 부화 후 100 100 μl MG / ML cellulase (0.05 M의 구연산 완충액으로 희석 [9.6 g / L Citrate.H NaOH와 물, 산도 2 0-4.6]를 사용하여 세균성 biofilms를 중단 1 H 150 rpm으로 흔들어하면서)와, 37 ° C에서 호기성 조건 하에서 24 잘 번호판을 품어. 필요한 경우, biofilms는 더 이상이 단계에서 수동 pipetting에 의해 중단될 수 있습니다. </li><li> 신진 대사 활동을 확인하려면교란 biofilms에서 풀려나 세균 세포, 0.02 % 100 μl (V / V)이 resazurin은 (증류수에 희석) 24 잘 플레이트의 각도에 추가되어 있어야하며 1 incubated - 37 ° C에서 2 시인데 150 rpm으로 떨고있는 동안. </li><li> resazurin과 부화에 따라 각각 아니라 540 nm의의 여기 파장과 Fluostar 오메가 microplate 리더와 MARS 데이터 분석 소프트웨어에서 590 nm의의 방출 파장을 사용하는 형광을 측정합니다. </li><li> 항생제 - 대우 biofilms (F-항생제 치료를 biofilms)과 부정적인 컨트롤 (F 부정적인 컨트롤)에서 형광의 형광은 ASM 들어있는 우물에서 얻은 배경 형광 뺄셈에 의해 해결되어야만이 (F 빈). 생존의 비율 억제는 이후 X 100 % (F 항생제 치료를 biofilms의 의미 / F 부정적인 통제를 의미)로 계산됩니다. BSMIC 90은 antibio로 정의됩니다안면 경련 농도는 대사 활동의 90 % 억제를 일으킨다. </li></ol> 4. 대표 결과 ASM biofilm 형성은 소형 (2 ML) 볼륨에 가능하며 biofilms 완전히 삼일 (그림 1A) 내에 형성된다. 이것은 엄격하게 방해하기 어려울해야 biofilm을 pipetting으로 증명 할 수 있습니다. microcolonies 더 큰 볼륨 4 (그림 1B)에서 자란 것과 비교할 수 있습니다. 그림 2는 전자 현미경 이미지 분석에 의해 감지로 planktonically 및 biofilm의 성장 세포 사이의 주요 차이점을 보여줍니다. Biofilm 문화는 분명히 biofilm 내의 세포 및 개인 구조를 둘러싼 세포외 기질의 상당한 수준을 파악하기 어려운 보여줍니다. 몇몇 연구들은 biofilm 생활은 항균 자화율 13, 14에 영향을 미칠 수있는 것이 좋습니다. 저희 소규모 ASM 분석은 dete하는 데 사용할 수 있습니다동시에 여러 개의 분리에 대한 여러 항생제의 BSMIC을 rmine. 분석의 흐름은 그림 3에 표시됩니다. 세균 세포 생존 능력에 대한 항생제의 효과 resazurin 분석을 사용하여 측정할 수있다. 항생제,이 경우 tobramycin에 설립 biofilm에 추가할 수와 24 H를 위해 incubated. 이 biofilm이 파손되고 resazurin이 추가되면. Metabolically 활성 세포는 분홍색 (resorufin) 15 블루 (resazurin)에서 색상 변화가 발생 resazurin 염료를 줄일 수 있습니다. 그림 4A는 예제 분석을 표시하는 P. 박테리아는 microtitre 플레이트의 biofilm 장애 및 resazurin의 추가 이전 tobramycin의 다양한 농도로 incubated되었다. 실행 가능한 세포가 형광 핑크 형태 resorufin에 염료를 줄이고 반면에 청색이 아닌 형광 컬러가 아닌 실행 가능한 세포를 나타냅니다. SMIC는 다음 백분율로 형광 변환하여 계산할 수세균 생존에 남아. 그림 4B하면 증가 tobramycin 농도와 %의 생존 능력의 변화를 보여줍니다. 10 %의 생존 능력은 SMIC 90을 계산하기 위해 절단으로 선정되었다. 호기성 조건에서 tobramycin SMIC 90 값은 planktonic 문화보다 biofilm로 성장 세포에 대해 높은 있습니다. 표 1은 테스트를 모두 분리를위한 PSMIC 90 BSMIC 90의 편차를 보여줍니다. LB (planktonic 모드)에 비해 ASM (biofilm 모드) 재배 때 호기성 조건 하에서, tobramycin에 대한 저항의 극적인 증가 (2 SMIC에서&gt; 32 배 증가)가 가장 분리에 대한 관찰되었다는 표 2 보여줍니다. 호기성 조건 하에서 재배 biofilms에 비해 또한, microaerophilic 조건 하에서 재배 biofilms 2 사이&gt; 128 배로 증가 SMIC을 전시. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig1.jpg" /> 그림1. ASM P.의 P. 박테리아의 Biofilm 형성 녹농균이라는 박테리아 스트레인 PAO1은 ASM 재배 macroscopically 보이는 대단히 짧은 시간을 (microcolonies) 형성합니다. 스크류 캡 유리 듀란 flasks. B, 2 ML ASM 문화의 Biofilm 형성 (7 일 성장 후 30 ML ASM 문화에서, Biofilm 형성 (대규모) 소규모) 24 - 잘 폴리스티렌 플레이트 3 일 성장 후. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig2.jpg" /> 그림 2. ASM biofilms의 TEM의 micrographs / C TEM 현미경, PAO1 중 (X 27,000) PAO1grown planktonic의 B / D TEM 현미경 (x57, 000), 각각 planktonically와 ASM의 성장 및 ASM에서 각각. Planktonically 성장 박테리아는 LB의 국물에서 하룻밤 재배되었다. Biofilms 30 ML ASM 문화 7 일간 재배되었다. 검은색 화살표는 biofilm 내에서 셀 참조와 별이 세포외 공간을 참조하십시오. 스케일 바 = 1μm의. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig3.jpg" /> 그림 3. ASM biofilm 항균 자화율 분석의 워크플로우. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig4.jpg" /> 4 그림. 세균성 세포는 다른 항생제의 농도와 잔여 신진 대사 활동이 resazurin을 사용하여 결정되었다들과 incubated 있었다 항생제 감정의 결정에 대해 resazurin 사용., resazurin의 블루 비 형광 산화 양식이 아닌 실행 가능한 세포를 지적하고 신진 대사에 의해 감소됩니다 핑크색 형광 resorufin. B에 활성 세포는 형광 강도가 남아있는 세균의 생존의 비율로 변환됩니다. 10 %의 생존 능력은 MSMIC90을 계산하기 위해 절단으로 선정되었다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3857/3857fig4large.jpg" target="_blank">고맙다을 보려면 여기를 누르십시오</a>GER 그림. </span&gt; <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> 변종 </td><td colspan="2"> PSMIC 90 (μg / ML) 1 </td><td colspan="2"> BSMIC 90 (μg / ML) 1 </td></tr><tr><td> 호기성의 </td><td> Microaerophilic이 </td><td> 호기성의 </td><td> Microaerophilic이 </td></tr><tr><td> PAO1 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 8 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td colspan="5"> 리버풀 전염병 스트레인 (레) 분리 </td></tr><tr><td> LESB58 21 </td><td> 8 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> 128 </td></tr><tr><td> LES400 22 </td><td> 32 </td><td> 128 </td><td> 8 </td><td> 256 </td></tr><tr><td> LESB25 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 256 </td><td> 512 </td></tr><tr><td> LESB55 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LESB64 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LES431 22 </td><td> 4 </td><td> 8 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LESB49 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> 256 </td></tr><tr><td> LES109 </td><td> 32 </td><td> 128 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td colspan="5"> 비 레 분리 </td></tr><tr><td> 49,461 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 16 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59,032 </td><td> 0.5 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59,073 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59,076 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> 27 </td><td> 8 </td><td> 16 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr></tbody></table> 표 1. tobramycin에 P. 박테리아의 자화율. PSMICs 및 BSMICs tobramycin 결정에 대한 1은 2 배 시리얼 dilutions에 사용되었다 512에 이르기까지 - 0.5 μg / ML (N = 각 농도 8) 및 512-1 μg / ML (N = 4 각 농도), 각각; PSMICs는 표준을 사용하여 결정됩니다 microdilution 방법 1. 이 Microaerophilic 조건 5 % O이 10 % CO 2, 그리고 85% N이 있었다. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> 변형 </td><td colspan="4"> PSMIC 90 / BSMIC 90 배 변화 1 </td></tr><tr><td> PSMIC 에어로빅 → PSMIC microaerophilic </td><td> BSMIC 에어로빅 → BSMIC microaerophilic </td><td> PSMIC 에어로빅 → BSMIC 에어로빅 </td><td> microaerophilic PSMIC → BSMIC microaerophilic </td></tr><tr><td> PAO1 </td><td> 0 </td><td> &gt; 64 </td><td> 2 </td><td> 128 </td></tr><tr><td colspan="5"> 레 분리 </td></tr><tr><td> LESB58 </td><td> 8 </td><td> 2 </td><td> 8 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> LES400 </td><td> 4 </td><td> 32 </td><td> 0.25 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> LESB25 </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 16 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> LESB55 </td><td> 4 </td><td> &gt; 8 </td&gt; <td> 4 </td><td> &gt; 8 </td></tr><tr><td> LESB64 </td><td> 4 </td><td> ND </td><td> &gt; 32 </td><td> &gt; 8 </td></tr><tr><td> LES431 </td><td> 2 </td><td> &gt; 16 </td><td> 8 </td><td> &gt; 64 </td></tr><tr><td> LESB49 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> LES109 </td><td> 4 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> &gt; 4 </td></tr><tr><td colspan="5"> 비 레 분리 </td></tr><tr><td> 49,461 </td><td> 2 </td><td> &gt; 32 </td><td> 0 </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> 59,032 </td><td> 4 </td><td> &gt; 128 </td><td> 8 </td><td> &gt; 256 </td></tr><tr><td> 59,073 </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> 59,076 </td><td> 2 </td><td> &gt; 16 </TD&gt; <td> 2 </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 2 </td><td> &gt; 128 </td><td> 0.5 </td><td> &gt; 32 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 2 </td><td> &gt; 128 </td><td> 0.25 </td><td> &gt; 16 </td></tr></tbody></table> 표 2. PSMICs 및 tobramycin에 BSMICs의 공간 변화. 결정되지 일 노스다코타; 굵게 표시된 값은 SMIC 배 변경&gt; 10를 나타냅니다.

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum-sensing+signals+indicate+that+cystic+fibrosis+lungs+are+infected+with+bacterial+biofilms.">Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms.</a> Nature. 407, 762-764 (2000).</li><li>Mowat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+Aeruginosa+Population+Diversity+and+Turnover+in+Cystic+Fibrosis+Chronic+Infections.">Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).</li><li>Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+phenotypes+and+genotypes+within+populations+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+cystic+fibrosis+lung+during+pulmonary+exacerbations.">Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations.</a> J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).</li><li>Fouhy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusible+signal+factor-dependent+cell-cell+signaling+and+virulence+in+the+nosocomial+pathogen+Stenotrophomonas+maltophilia.">Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia.</a> J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li><li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li><li>Carter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection.">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

본 연구에서는 P.을 복제하기 위해 ASM을 기반으로 체외 모델에서 소설을 사용한 CF의 폐 사 내에서 박테리아의 biofilm 조건입니다. 모델은 항균 대리인의 소규모 높은 처리량 테스트를 성공적으로 바뀌었습니다. 이 분석의 중요한 단계는 다음과 같습니다 <ol><li> ASM 미디어 및 유지 불임의 일관된 준비. 우리는 각각의 구성 요소를 재현할 결과 때마다을 달성하기 위해 추가되는 방식을 최적화로 오랜 시간을 헌신했다. ASM의 여과가 느린지만 mucin 구성 요소가 손상될 수 있습니다 autoclaving에 바람직합니다. 이것은, 상당한 선택적 압력, 드라이브 변이를 부과 prophage 용해 16를 유도하고 상당히 여러 세균성 유전자의 표현을 변경할 수 있기 때문에 우리는 타인 11 시까지 제안 항생제의 추가, 조언하지 않습니다. </li><li> 분석은 볼륨 O에 따라 최적화되어야합니다F ASM이 사용됩니다. 떨고있는 속도보다 작은 볼륨 증가하고 짧은 biofilm 생명주기가 관찰된다. </li></ol> 소규모 ASM biofilm 모델의 명백한 응용 프로그램은 biofilm 항균 감정 (BSMIC 90)의보다 현실적인 결정이다. 무산소와 microaerophilic 틈새는 CF의 폐에 존재하며 산소가 성숙 biofilms 2, 17 안에 깊은 제한되어있다는 증거가있다. 여기 보여주는 그 14분의 10 임상 P. ASM의 microaerophilic 조건 하에서 tobramycin에 대한 감수성의 감소 - CF 환자 sputa에서 박테리아의 분리는 상당한 (≥ 128 배 4) 전시. 본 연구의 결과는 tobramycin과 같은 항생제가, P. 대해 덜 효과적일 수 있다고 제안 기존의 자화율 시험 방법에 의해 표시된 것보다 CF의 폐에 박테리아 감염. 이러한 결과는 biofilms 10 항균 자화율에 대한 이전의 연구를 반영합니다. 소형규모 ASM assays 따라서 더 나은 치료 결정을 알리기 위해 의미있는 항생제 자화율 데이터를 생성하는 간단한 높은 처리량 플랫폼을 제공합니다. 분석은 그 하나의 식민지에서 기존의 항생제 자화율 시험으로 전체 인구를 대표하지 않을 수 있습니다 스크리닝을 위해 선택되고 같은 방법으로 제한됩니다. 그러나이 아닌 표면에 부착된 biofilm 성장과 microaerophilic 조건 (2) 적용을 사용하는 접근 방식은 (i), 명확한 대안과 기존 방법에 대한 잠재적인 개선을 나타냅니다 있다고 생각합니다. 이 분석은 P.를 공부하기 적합한 모델입니다 결론 녹농균이라는 박테리아의 biofilm의 인구. 임상 설정에서 더 자세한 테스트는 항생제 감정이 biofilm - 성장 P. 토대로 여부를 확인할 것 박테리아는 잠재적으로 향상 미생물과 임상 결과와 다른 항생제의 선택으로 이어질 수 있습니다. 고전 biofilm 모델을 사용하여 비슷한 조사는 BSMIC 가치가 이어질 것으로 나타났습니다항생제 치료 5,17에 대해 다른 권장합니다. 안티 infective 요원의 효과에 대한 테스트 이외에도, ASM 시스템은 P.의 다양성을 이해 겨냥한 것과 연구를위한 동물 모델로 저렴, 간단하고 재현성 대안을 나타냅니다 녹농균이라는 박테리아의 집단. 우리는 P. 자연 인구에 광범위한 이질을 관찰했습니다 박테리아는 CF 환자 sputa 18 일, 19 일부터 회복. 비슷한 phenotypic 및 genotypic 다양성은 그것 CF 폐 조건의 체외 모델의 매력 만들기, ASM 4 (우리의 게시되지 않은 데이터) 성장하는 동안 볼 수 있습니다. ASM 모델의 상대적인 단순 그것이 쉽지 장기 적응 실험은 P.에 항생제 또는 다른 스트레스의 효과를 모니터링에서, 예를 들어, 목표로 설계하게 녹농균이라는 박테리아 인구 발산. 또한, 다른 세균성 병원균은 재배하실 수 있습니다ASM. 예를 들어,. 2007 S.하여 biofilm 형성을 연구하기 위해 ASM Fouhy 외 사용했을 maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 어류 정자의 DNA </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 74,782 </td></tr><tr><td> 돼지의 위, 2 형에서 Mucin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-알라닌 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 102,830,250 </td></tr><tr><td> L-아르기닌 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L (+)-아스파라긴 일수화물 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 175,271,000 </td></tr><tr><td> L (+)-아스파르트산 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 105,041,000 </td></tr><tr><td> L-시스테인 </td><td> 시그마 - Adrich </td><td> 168,149 </td></tR&gt; <tr><td> L (+)-Glutamic 산 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 156,211,000 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 220,911,000 </td></tr><tr><td> L-히스티딘 </td><td> 시그마 - Adrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-이소 류신 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-류신 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L (+)-라이신 염산염의 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 125,222,500 </td></tr><tr><td> L-메티오닌 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-페닐알라닌 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 130,310,250 </td></tr><tr><td> L-프롤린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-세린 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 132,660,250 </td></tr><tr><td> L-트레오닌 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 138,930,250 </td></tr><tr><td> L (-)-트립토판 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 140,590,250 </td></tr><tr><td> L-티로신 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 140,641,000 </td></tr><tr><td> L-발린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> Diethylenetriaminepentaacetic 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 32,318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 피셔 과학 </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; 코이 </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> 계란 노른자 유제 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 17,148 </td></tr><tr><td> ME 2 격막 진공 펌프 </td><td> Vacuubrand </td><td> 696,126 </td></tr><tr><td> Steritop 필터 (구멍 크기 : 0.22 μm의, 목이 크기 : 45 ㎜) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Luria-Bertani 매체 </td><td> 시그마 </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> 96 - 웰 microtitre 플레이트 </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581 </td></tr><tr><td> 24 잘 조직 문화 처리 접시 </td><td> 이와키 </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> CampyGen 가스 생성 팩 </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Microaerophilic 챔버 </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramycin 황산염 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Cellulase, Aspergillus 니제르에서 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 22,178 </td></tr><tr><td> Resazurin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 199,303 </td></tr><tr><td> Citrate.H 2 0 </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar 오메가 microplate 리더 </td><td> BMG-Labtech </td><td> SPECTROstar 오메가 </td></tr></tbody></table>

use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung

P.의 분리에 적용했을 때 체외 항균 자화율 시험에의 관련성에 대한 우려가 증가하고 낭성 섬유증 (CF) 환자에서 박테리아. 기존 방법은 하나의 의지 또는 몇 분리가 aerobically 및 planktonically 성장. 미리 결정된 컷 오프는 박테리아가 민감하거나 특정 항생제 1 ~ 내성 여부를 정의하는 데 사용됩니다. 그러나, CF, P.의 만성 폐 감염시 녹농균이라는 박테리아의 인구는 biofilms에 존재하고 환경이 크게 microaerophilic이라는 증거가있다. 폐 및 진단 테스트를하는 동안 이들의 박테리아 사이의 조건에서 뚜렷한 차이는 질문에이 테스트 3도 신뢰성과 타당성을 촉구했다. 인공 가래 매체 (ASM)는 아미노산, mucin과 무료 DNA를 포함한 CF 환자의 가래의 구성 요소를 포함하는 문화 매체입니다. P. 박테리아 &lt;/ 그들을 자기 수렴 biofilm 구조와 인구 발산 4,5,6의 형성과 CF 감염, 중 ASM 싫어하지 &#39;의 성장에&gt; 성장. 본 연구의 목적은 피의 항균 자화율 공부를 microtitre-플레이트 분석을 개발하는 것이었다 박테리아는 microaerophilic 및 호기성 조건 모두에 적용 ASM, 성장을 바탕으로. ASM 분석은 microtitre 플레이트 형식으로 개발되었습니다. P.는 녹농균이라는 박테리아의 biofilms은 24 시간 동안 서로 다른 농도에서 사전 항균 대리인과 부화까지 3 일간 개발할 수있게되었다. biofilm 장애 후 세포 생존 능력은 resazurin으로 더럽히는 것으로 측정되었습니다. 이 분석은 15 종류의 P. 위해 tobramycin의 고착의 세포 최소 억제 농도 (SMIC)를 확인할 사용된 에어로빅과 microaerophilic 조건과 SMIC 가치관 하에서 박테리아의 분리는 표준 국물의 성장과 함께 얻은 사람에 비해되었다. 거기 렸죠그들의 planktonic의 대응에 비해 ASM 재배 분리를위한 증가 마이크 값에 대한 증거, 가장 큰 차이점은 ASM 시스템의 tobramycin에 대한&gt; 128 배 이상에 훨씬 증가 저항이 나타나기 microaerophilic 조건에서 테스트 박테리아 발견되었을 때 호기성 조건에서 실시 assays에 비해. 현재의 자화율 시험 방법과 임상 결과 사이 협회의 부족 3 전류 방식의 타당성에 의심을하고있다. 체외 모델에서 몇몇은 P.를 공부하기 위해 이전에 사용되었습니다 녹농균이라는 박테리아의 biofilms 7, 8. ASM biofilms이 CF의 폐 9 관찰 이들과 유사한 반면, 그러나, 이러한 방법은 표면 첨부된 biofilms에 의존하고 있습니다. 또한, 점액의 감소 산소 농도는 P.의 동작을 변경을 보여줘왔다 박테리아 2와 항생제 자화율 10 달러에 영향을 미칩니다. 따라서 usinmicroaerophilic 조건에서 g ASM은 항균 자화율를 연구하기에서보다 현실적인 환경을 제공할 수 있습니다.

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Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

현재 진단 항균 자화율 테스트는 영양소 풍부한 호기성 조건에서 분리의 planktonic 성장에 의존하고 있습니다. 여기서는 낭성 섬유증의 폐 더 많은 대표적인 두 에어로빅과 microaerophilic 조건에서 녹농균의 biofilms의 항균 자화율 공부를 대체 인공 가래 매체를 사용합니다.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

32.4K 조회수.  University of Liverpool. 현재 진단 항균 자화율 테스트는 영양소 풍부한 호기성 조건에서 분리의 planktonic 성장에 의존하고 있습니다. 여기서는 낭성 섬유증의 폐 더 많은 대표적인 두 에어로빅과 microaerophilic 조건에서 녹농균의 biofilms의 항균 자화율 공부를 대체 인공 가래 매체를 사용합니다.

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

연구

면역학 및 감염병학

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기<i&gt; S. 폐렴</i&gt;<i&gt; H. 인플루엔자</i&gt;<i&gt; K. 폐렴</i&gt;<em&gt; P. 녹농균</em&gt; 또는<em&gt;를했다. baumannii가</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델<em&gt; In Vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing methods in general. Additionally, little evidence exists comparing handwashing methods to determine which are most efficacious at removing infectious pathogens. Research is needed to provide evidence for the different approaches to handwashing that may be employed during infectious disease outbreaks. Here, a laboratory method to assess the efficacy of handwashing methods at removing microorganisms from hands and their persistence in rinse water is described. Volunteers' hands are first spiked with the test organism and then washed with each handwashing method of interest. Generally, surrogate microorganisms are used to protect human subjects from disease. The number of organisms remaining on volunteers' hands after washing is tested using a modified "glove juice" method: the hands are placed in gloves with an eluent and are scrubbed to suspend the microorganisms and make them available for analysis by membrane filtration (bacteria) or plaque assay (viruses/bacteriophages). Rinse water produced from the handwashing is directly collected for analysis. Handwashing efficacy is quantified by comparing the log reduction value between samples taken after handwashing to samples with no handwashing. Rinse water persistence is quantified by comparing rinse water samples from various handwashing methods to samples collected after handwashing with just water. While this method is limited by the need to use surrogate organisms to preserve the safety of human volunteers, it captures aspects of handwashing that are difficult to replicate in an in vitro study and fills research gaps on handwashing efficacy and the persistence of infectious organisms in rinse water.

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, there is little evidence on which handwashing methods are most efficacious at removing infectious disease pathogens. We developed a method to assess the efficacy of handwashing methods at removing microorganisms.

신생 전염병 병원체 제거를위한 손씻기의 효능을 시험하는 방법

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe infections, complications, and mortality worldwide with a huge impact on our society and on the health system. In particular, patients with compromised immune systems or pre-existing and chronic pathologies, such as cystic fibrosis (CF), are subjected to frequent antibiotic treatments to control the infections with the appearance and diffusion of multidrug resistant isolates. Therefore, there is an urgent need to address alternative therapies to counteract bacterial infections. Use of bacteriophages, the natural enemies of bacteria, can be a possible solution. The protocol detailed in this work describes the application of phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infection in CF zebrafish embryos. Zebrafish embryos were infected with P. aeruginosa to demonstrate that phage therapy is effective against P. aeruginosa infections as it reduces lethality, bacterial burden and pro-inflammatory immune response in CF embryos.

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Presented here is a protocol for Pseudomonas aeruginosa infection and phage therapy application in cystic fibrosis (CF) zebrafish embryos.

낭포성 섬유증 얼룩말 피시 태아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염을 중화하는 파지 치료 응용 프로그램

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.