이 작품은 뇌 종양 연구, 뇌 종양 치료 및 건강의 국립 연구소 (1R21CA141020-01)의 프레스턴 A. 웰스 주니어 센터 플로리다 센터에 의해 지원되었다.

1. Glioblastoma 단일 세포 현탁액을 준비 <ol><li> Gliomasphere 문화는 설립 이전에 설명 2,11,12로 neurosphere 분석 (NSA)을 사용하여 유지됩니다. </li><li> gliomaspheres을 passaging에 해당하는 시간에, 분야를 포함하는 매체는 적절한 크기 무균 조직 배양 관에 배치, 제거하고, 실온에서 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged. </li><li> 표면에 뜨는는 삭제되고 영역의 펠렛은 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML에 resuspended 37의 ° C 3-5 분을위한 물 목욕에 incubated 수 있습니다. </li><li> 콩 트립신 억제제의 동일한 볼륨은 다음 트립신의 활동을 중지하는 데 사용됩니다. </li><li> 세포 현탁액은 부드럽게 동질성과 트립신의 활동을 완전히 중화을 보장하기 위해 아래로 pipetted하고 있습니다. </li><li> 세포 현탁액 다시 5 분 800 rpm으로 centrifuged 있습니다. NeuroCult의 1ml에 표면에 뜨는이 제거되고 셀은 resuspended 아르NSC 자연적으로 흐르는 것과 중간. </li><li> 단일 셀 정지 10μl는 셀 카운트를 수행 할 trypan 블루의 90μl과 혼합되어 있습니다. </li></ol> 2. 셀 추적 Carboxyfluorescein Succinimidyl 에스터 (CFSE) 그린 형광 염료로 착색 <ol><li> 스테인드 할 때마다 백만 세포를 들어, 염색 시약의 1 ML은 5 μm의 최종 착색 농도를 제공 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 보통 1 ML에 5 MM 셀 추적 CFSE 염색 (분자 프로브, Invitrogen) 1 μl를 추가하여 준비가되어 있습니다 . </li><li> 세포를 포함하는 착색 시약은 동질성 때까지 잘 섞어 10 분 동안 실온에서 incubated입니다. </li><li> 부화하는 동안, 얼음처럼 차가운 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 매체는 담금질 솔루션으로 준비가되어 있습니다. </li><li> 염색 프로세스를 중지하려면 얼음처럼 차가운 담금질 솔루션의 약 5-10 권 CFSE -로드 셀에 추가됩니다. </li><li> 솔루션은 다음 5 분 800 rpm으로 centrifuged되고 표면에 뜨는는 삭제됩니다. </li><li> 일시요점은, 착색이 성공적 나타내는 색의 밝은 녹색 색조와 튜브의 하단에있는 세포 펠렛을가 나타납니다. </li><li> 세포는 5 분 및 폐기 표면에 뜨는 800 rpm으로 centrifuging, 신선한 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 보통 1-2 ML에서 펠렛을 resuspending하여 세척합니다. 이 절차는 세 세차의 총 반복됩니다. </li><li> 세 번째 세척 한 후 세포가 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 중간과 셀 수이 수행되는 1 ML에 resuspended 있습니다. </li><li> CFSE 스테인드 세포는 다음 적절한 밀도 [50000 세포 / ML]에서 무균 조직 문화 플라스크에 도금 및 37 ° C / 5퍼센트 CO2 humidified 인큐베이터에 배치됩니다. </li></ol> 3. CFSE로드 확인 <ol><li> NSA 문화에 도금 셀은 CFSE의 착색을 확인하기 위해 형광 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다. 이 단계에서, 세포의 모든 밝은 녹색 색상 (그림 1)을 나타냅니다. 의 세포 현탁액의 또는 드롭CFSE의 스테인드 세포는 현미경 슬라이드에 배치하고 형광 현미경으로 세포를 시각화하는 coverslip으로 덮여 될 수 있습니다. </li><li> 성공적인 CFSE 라벨은 또한 유동 세포 계측법을 통해 확인된다. 각 그룹에서 많은 1-5으로 X 10 5 세포가 CFSE의 착색 확인을 위해 충분합니다. CFSE는 세포와 무부하 대조군 세포가 1 개 - PBS 500 μl의 총 볼륨에 대한 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 중간에 각각 resuspended와 별도의 FACS 튜브에 배치됩니다로드. </li><li> 흐름 cytometer는 관련 매개 변수의 사용 설명서의 지침에 따라 조정됩니다. CFSE는 492 nm의와 517 nm의 방출 최대 파장 여기 최대가 있습니다. </li><li> 첫째, 무부하 제어 세포가 실행되고 획득 이벤트 순방향 및 측면 분산 (FSC 대 SSC)와 히스토그램 플롯에 기록되며, 주요 세포 인구는 (그림 2A) 출입을 금지합니다. </li><li> 마찬가지로, CFSE로드 셀은 동일한 매개 변수를 사용하여 분석s은 (는) 제어 세포 (그림 2B)에 사용됩니다. </li></ol> 4. 느린 - 분리 형광 활성 세포 정렬 (FACS)를 사용 세포 인구 [예 CFSE는 보관]을의 절연 <ol><li> 부문시, CFSE 강도는 감소하고 hGBM 전지는 녹색 형광 강도의 다른 수준 (그림 3) 전시 세포로 구성되어 gliomaspheres를 형성하고 있습니다. gliomaspheres는 직경 약 150-200 μm (약 5-10일 세포주의 성장 속도에 따라 포스트 CFSE 로딩)의 평균 크기에 도달 한 경우, 영역을 포함하는 매체는 적절한 크기 무균 조직 배양에 배치, 제거 관, 그리고 실온에서 5 분 800 rpm으로 centrifuged. </li><li> 이전 단계에서 설명하고 세포까지 밀리리터 당 10 7 셀 밀도와 세포 현탁액을 준비하기 위해 셀 수에 대한 PBS에 resuspended하기 때문에 단일 셀 정지이 준비되어 있습니다. </li><li> 고물에응급실은 PBS의 적절한 볼륨에서 셀을 resuspending, Propidium의 요오드화물은 (PI, 시그마, 500 μg / ML) 1 μl / 정렬 / 유동 세포 계측법에 의해 분석하면 죽은 세포를 제외 세포 현탁액의 ML의 농도에 추가됩니다. </li><li> 전체 NeuroCult NSC 매체의 각 포함 1ml 두 15 ML 멸균 조직 배양 튜브는 정렬 천천히 나누어 세포 (CFSE 유지 세포)와 빠른 나누어 세포를 (CFSE diluting 세포)를 수집하는 데 사용됩니다. </li><li> 첫째, 무부하 셀 그룹에서 세포 현탁액은 흐름 cytometer를 통해 실행됩니다. </li><li> 세포는 (이벤트) 세포의 대부분이 유동 계획에 포함되도록 조정됩니다 앞으로 분산 (FSC) 대 측 분산 (SSC)와 두 매개 변수에 대한 전압 매개 변수를 기반으로 꾸몄다됩니다. </li><li> 죽었거나 손상된 세포를 제외하려면 셀 SSC 대 PI 반응성에 따라 해본와 하나의 라이브 세포 인구는 (PI 음수) 출입을 금지하고 있습니다. </li><li> 그런 다음 단일 셀 인구는 F에 따라 선택됩니다orward 분산 (FSC) 대 측 분산 (SSC). </li><li> 균일 한 라이브 세포 인구는 다음 로그 스케일에 자리 잡고 셀 주파수 대 CFSE 강도에 따라 막대 그래프에 도시된다. CFSE 레이저 강도는 0과 100 사이의 부정적인 신호를 배치하기 위해 조정됩니다. </li><li> 동일한 매개 변수와 유사한 게이팅 전략을 사용하여 CFSE 표시된 셀은 흐름 cytometer를 통해 실행되며 (그림 4C) 분석했다. </li><li> 그 후, 셀 및 전체 인구의 느린 나누어 인구는 (빠른 나누어 세포) CFSE을 (각각 CFSE 높은 상위 5 %와 CFSE 저 아래 85%), 유지하는 능력에 따라 식별됩니다. </li><li> 이러한 서로 다른 세포 인구 그런 다음 전체 NSC 매체의 1ml를 포함하는 별도의 15 ML 멸균 조직 배양 튜브에 정렬됩니다. </li><li> 정렬 셀은 다음 5 분 800 rpm으로 centrifuged 있습니다. </li><li> appro에 표면에 뜨는는 삭제되고 펠릿은 resuspended 있습니다중간 (절연 행사 또는 펠릿 크기의 수에 따라)와 세포 수의 priate 볼륨이 수행됩니다. </li><li> 다른 정렬 인구의 세포는 그 다음 적절한 무균 조직 배양 플라스크에 밀리리터 50,000 세포에서 도금 및 직렬 passaged 또는 하류 실험에 사용되기 전에 5~10일에 대해 37 ° C / 5퍼센트 CO2 humidified 인큐베이터에 배치됩니다. </li></ol> 5. 대표 결과 현미경 (그림 1)에서 시각화로 CFSE을로드 한 후, 모든 세포는 강렬한 녹색 형광을 제시한다. 이 녹색 착색 색상도 육안 (동영상 참조)와 함께 볼 수 있습니다. 유동 세포 계측법과 함께 세포를 분석하면 제어 세포 (그림 2)에 비해 매우 강렬한 녹색 형광을 보여줍니다. neurosphere 문화에 도금 CFSE로드 셀되면,이 세포는 세포 분열 따위에 의해 번식하고 5-10일에서 150-200 μm gliomaspheres를 형성하고 있습니다. 세포는 t를 분아 따위에 의해 중식으로<html> 그는 형광 염료가 아침마다 세포 분열과 형광 강도의 반턱로 이어지는, 부서에 따라 딸 세포 사이에 분포되어있다. Glioblastomas는 기능적으로 이기종하고 다른 시간의 척도에 proliferating 세포로 구성되어 있습니다. 이 프로토콜에 설명 된 방법은 각각 CFSE을 희석하거나 유지하는 능력 (그림 3도 동영상을 참조)의 미덕에 의해 신속하고 느린 나누어 세포를 식별하고 분리 한 수 있습니다. 무부하 세포에 비해 CFSE -로드 셀에서 생성 dissociated gliomaspheres의 유동 세포 계측법 분석은 다양한 CFSE 보존 특성 (그림 4)을 보여줍니다. 빠른 나누어 세포 (아래 85 %) 또는 속도가 느린 나누어 전지 (상위 5 % - CFSE 높은) neurosphere 분석 조건 (그림 5)에서 배양하면 능력을 형성 전시 gliomapshere. gure 1 &quot;/&gt; 그림 1. 즉시 CFSE 색소를로드 한 후 Dissociated 종양 세포. 세포 성공적으로 라벨을 보여주는 밝은 녹색 색상을 나타냅니다. 원래 배율, 10 ×. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 유동 세포 계측법을 사용하여 CFSE 로딩 확인. A) 언로드 세포, B) CFSE는로드 대 무부하 셀에 CFSE 형광 강도를 비교) 세포와 C를로드. 라벨과 라벨이없는 세포 사이의 형광 강도의 크기 차이의 여러 명령이 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 육일 도금 후 CFSE -로드 셀에서 파생 된 대표 gliomasphere. 일부 셀은 매우 밝은 CFSE의 착색을 나타냅니다. 원래 배율, 63​​ X. <img SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot;ALT = &quot;그림 4&quot;/&gt; 그림 4. 대표 유동 세포 계측법 플롯 / 육일 CFSE의 착색 후 빠르고 느린 나누어 세포의 분리에 대한 histograms. 죽었거나 손상된 세포를 제외 할 전체 세포 인구를 표시) FSC 대 SSC, B) SSC 대 PI 반응성, C) 게이트 FSC 대 SSC 동질적인 라이브 셀 인구, D는) 6 일 대조군에 비해 큰 형광 강도에 의해 입증으로 CFSE 라벨 후 CFSE 유지 세포의 존재를 보여줍니다. 히스토그램은 또한 CFSE 강도)이 시간. E를 통해 CFSE 유지 전지 (상위 5 %)와 CFSE diluting 세포 (하단 85 %)를 식별 할 수있는 게이팅 전략을 표시 히스토그램을 부패한 것으로 나타났습니다. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="그림 5" /> 에서 생성 그림 5. 대표 gliomaspheres <strong&gt; A) 빠른 속도로 나누어 전지 (CFSE 낮은)와 B) 천천히 나누어 세포 (CFSE 높은). 원본 배율 :. 각각 10 배와 20x C)은 대표 세포 수는 통과 할 때 빠르게 또는 느리게 나누어 세포 유래의 문화에서 얻은. P &lt;0.05, t-테스트합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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(56), e3633-e3633 (2011).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

연구의 증가는 종양 형성과 치료 저항 2-8에 기여하는 암의 세포의 느린 나누어 하위 칸의 중요성을 보여주고 있습니다. 따라서 서로 다른 성장 속도로 subpopulations을 비교하는 것이 더 일반적으로 세포 또는 특정 subpopulation의 연구를 가능하게 실험 방법을 설명하고 표준화하는 것이 중요합니다. 세포 분열 자신의 속도에 따라 세포의 하위 분수를 식별하고 분리 할 수​​ CFSE를 사용하면 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 중간 (인간) </td><td> 중 </td><td> 셀 기술을 줄기 </td><td> 05,750 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC 확산 보조 식품 (인간) </td><td> 중간 보충 </td><td> 셀 기술을 줄기 </td><td> 05,753 </td></tr><tr><td> % 0.05 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> 콩 트립신 억제제 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25 플라스크 </td><td> 문화 도자기 </td><td> Nalge Nunc 국제 </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 플라스크 </td><td> 문화 도자기 </td><td> Nalge Nunc 국제 </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> 15 ML 튜브 </td><td> 문화 도자기 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> 50 ML 튜브 </td><td> 문화 도자기 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 성장 인자 </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CellTrace의 CFSE의 세포 증식 키트 </td><td> 형광등 전지 부문은 추적 염료 </td><td> 분자 프로브, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse)

종양 이질성은 종양 견고성을 지원하는 기본 기능을 나타냅니다 및 치료 전략 1의 발전에 중심 장애물를 제공합니다. 종양 이질성의 문제를 극복하려면, 특정 질병 pathologies을 유도하고 임상 적으로 관련성이 높은 목표를 대표하는 종양 subpopulations의 phenotypic (에피네프린) 유전 및 기능 식별 및 특성을 사용 assays과 도구를 개발하는 것이 필수적입니다. 그것은 지금은 잘 종양이 느린 자전거가되는 기능 기준을 적극적으로 종양이 형성 뇌, 유방, 피부를 포함한 여러 암의 능력과 연결되어 세포 분열의 다른 주파수로 세포의 하위 분수 독특한 전시입니다, 그리고 설립 췌장뿐만 아니라 백혈병 2-8. 형광 염료 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)이 혈액 관련 t의 체외에서 세포의 분열 주파수를 추적하고 생체에 사용되었습니다umors 및 glioblastoma 2,7,8 등의 고체 종양. CFSE의 세포 permeant 비 형광 프로 약물은 안정적인 아미드 결합 할 구를 형성하는 세포 아민 그룹과의 succinimidyl 잔기의 반응을 통해 단백질 covalently 구속력이 세포 내에서 유지되는 형광 화합물로 세포 esterases으로 변환됩니다. 형광 염료가 아침마다 세포 분열과 형광 강도의 반턱로 이어지는, 부서에 따라 딸 세포 사이에 분포되어있다. 이 부문 10 8-10 발까지 세포주기 주파수를 추적 할 수 있습니다. CFSE 유지 용량은 암 줄기 세포 활동 2 풍부 할 보여준 속도가 느린 자전거 subpopulation을 (위 5퍼센트 염료 유지 세포)를 식별하고 격리하는 뇌 종양 세포와 함께 사용되었습니다. 이 프로토콜은 인간 glio의 문화에서 CFSE로 세포를 얼룩의 기술과 개인 인구의 격리를 설명blastoma (GBM) - 파생 유동 세포 계측법 2를 사용 서로 다른 부문 가격을 가진 세포. 기술은 식별하고 CFSE 라벨을 유지하는 능력을 가진 세포의 뇌 종양이 천천히 자전거 인구를 분리하기 위해 제공하고 있습니다.

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Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

이 비디오 프로토콜은 세포 분열의 주파수에 따라 인간 glioblastoma의 셀의 다른 하위 집단의 식별 및 분리를위한 형광 염료 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)의 응용 프로그램을 보여줍니다.

카르복시 Fluorescein Succinimidyl 에스터 (CFSE)를 사용 인간 Glioblastoma의 속도가 느린 - 나누면 전지의 식별 및 분리

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

identification-isolation-slow-dividing-cells-human-glioblastoma-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

14.0K 조회수.  The University of Florida. 이 비디오 프로토콜은 세포 분열의 주파수에 따라 인간 glioblastoma의 셀의 다른 하위 집단의 식별 및 분리를위한 형광 염료 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)의 응용 프로그램을 보여줍니다.

비디오: Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

연구

의학

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Cytometry 사용 하 여 인간 지방 조직에서 면역 세포의 특성

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...