저자는 이러한 기술의 개발 중에 귀중한 논의에 대한 planarian 이식에 관한 유용한 조언뿐만 아니라 산체스 실험실의 과거와 현재 회원 Chiyoko 고바야시와 Kiyokazu 아가타에게 감사를 표합니다. 이 작품은 OCG와 ASA로 NIH R37GM057260에 NIH 연수 부여 (5T32 HD0791)에 의해 지원되었다. ASA는 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정이다.

참고 :이 프로토콜은 잠재적으로 유해 물질의 사용 (리드와 chloretone)을 제안합니다. 수집, 읽기 및 모든 잠재적 유해 물질에 대한 MSDS를 따릅니다. 1. 동물 문화, 선택 및 준비 <ol><li> 동물 문화와 처리 사용 planarian 워터 (1X Montjuïc 소금 9) 및 플라스틱 전송 pipettes하십시오. </li><li> 정상적인 배양 조건 하에서 10 연구실에서 제기했을 때 성적 생물형 Schmidtea 메디 테라 니아 사용할 수 있습니다. 필요한 크기의 성별이없는 표본을 제작하려면, S. 메디 테라 니아 9는 사용하기 전에 1~2개월 동안 트리플 정상 주파수 (2-3 번 주당)으로 이중에서 먹이되어야 정상적인 조건에서 실내 온도에서 키웠습니다. 또는 정상적인 주파수에서 먹이 성별이없는 동물들의 평균 크기를 향상시키기 위해 무기한 섭씨 10 도에 보관 수 있습니다. </li><li> 관련 1~2센티미터 사이에있는 동물을 선택길이 2mm보다 넓게 그리고 동물에게 사용하기 전에 3-7일을 굶어. </li><li> 대상 호스트, 기증자, 또는 부분적으로 조사 동물에 대한 pharmacological이나 방사능 치료를 수행하는 경우이 시점에서 치료 (들)을 수행합니다. </li><li> pharmacological 치료가 동물에게 먹이를 요구하는 수행한다면, 동물에게 사용하기 전에 추가로 3~7일을 굶어. </li></ol> 2. 솔루션 및 재료 준비 <ol><li> planarian 물에 0.1-0.2 % W / V chloretone을 해소하고 얼음에 솔루션을 장난으로 chloretone 솔루션, 가벼운 국소 마취제를 준비합니다. </li><li> 부분적인 조사를 수행하는 경우에만, 2.7 단계로 진행합니다. 조직 이식의 경우 2.3 단계로 진행합니다. </li><li> 분젠 버너 사용 1-2센티미터에서 그라 프트, 90 모세관 튜브 ° 각도를 받게됩니다 호스트에 구멍을 만드는 데 사용되는 이식 조직을 절단에 사용되는 0.75 mm 내부 직경, 그리고 0.7 mm 외부 직경을 굽히다 EA의 끝에서채널 튜브. 자료를 저장하려면 각 모세관 튜브의 양쪽을 구부 두 도구를 생산하는 반으로 그들을 깰. 화염 튜브 매우 엔드로되지주의를 기울입니다. </li><li> 지정된 크기에 다음 서류를 잘라 : <ul><li> 블랙 필터 페이퍼 (. 2.5 cm는 x 1.5 cm 사각형 약으로 절단) </li><li> 워트 먼지 # 3 필터 페이퍼 (. 2cm X 0.5 cm 사각형 약으로 절단) </li><li> Kimwipe (접혀 및 덩어리 정말 끝내줘 약으로 했네요. 3cm X 0.5 cm × 4 겹의) </li><li> 담배 압연 종이 (고무 스트립을 제거하고 사각형 약으로 했네요. 3cm는 x 2cm) </li></ul></li><li> 수정된 Holtfreter의 솔루션 (3.5 G / L NaCl 0.2 g / L NaHCO 3, 0.05 G / L KCl 0.2 g / L MgSO 4, 0.1 G / L CaCl 2, 산도 7.0-7.5) 준비 및 카세 인은 Holtfreter의 솔루션과 감기 포화 4 모두 ° C. </li><li> Peltier 쿨러 플레이트 또는 해부 현미경에 위치한 다른 냉각 장치의 Parafilm의 광장과 장소로 접힌 Kimwipe을 첨부합니다. 냉장 Holtf과 Kimwipe를 포화reter의 솔루션과 장소 Kimwipe에 두 개의 검은 필터 종이 사각형. </li><li> 워트 먼지 필터 # 2 종이 라인 배양 접시. Holtfreter의 솔루션과 여과지를 축축하게하다 얼음에 요리를 진정 하라구. 부분적인 조사 내용은 큰 접시 및 필터 종이 라이너를 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. Anesthetization 및 고정 <ol><li> 그릇에 냉장 chloretone 솔루션과 피펫 웜있는 페트리 접시를 채우십시오. 이식의 경우 하나의 호스트와 한 번에 한 기증자를 마취. 부분적인 조사 내용은 여러 (N&gt; 10) 동물들은 한 번에 anesthetized 될 수 있습니다. </li><li> 그들은 움직이지 될 때까지 웜은 chloretone 용액에 흡수하도록 허용 (5-10 분). </li><li> 냉장 Holtfreter의 솔루션 가득한 그릇에 그들을 pipetting하여 벌레를 씻어. </li><li> 냉장 Holtfreter의 솔루션 및 포셉과 동양 그들에게 복부 측면을 아래와 포화 블랙 거름종이에 그들을 pipetting하여 동물을 고정. 동물 LOC 수있다면오모테, 과잉 Holtfreter의 솔루션을 흡수, 약간 귀하의 Peltier이나 차가운 접시의 온도를 줄이거나 chloretone 치료의 길이를 증가시킵니다. </li></ol> 4. 부분 조사 참고 : 부분적인 조사를 위해 동물을 준비하려면 다음 단계를 따르십시오. 대신 이식을 수행하는 경우, 섹션 5로 진행합니다. <ol><li> X 선 irradiator 상위 소스 내부에 맞게 아이스 버킷에 얼음 단계 2.7에서 냉장 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 그들이 고정화되어있는 검은 여과지를 이동하여 배양 접시에있는 anesthetized 동물을 마련. 직접 anesthetized 벌레를 이동하는 집게를 사용하여 그들을 다치게 수 있습니다. </li><li> 교통은 X 선 irradiator 최상위 소스에 동물을 배치하고 동물에 대한 음극 관의 거리가 최소화되는 등 얼음 양동이를 ...을 놓다, 따라서 효과적인 복용량 속도를 극대화. </li><li> 동물과 음극 t 사이에 위치 납 차폐 (들) (그림 1)ube이 원하는대로. 방어막이 325kV X 선 빔 11 97~99% 감쇄 수 있도록 두께가 4.5-6 mm이어야합니다. </li><li> X 선 선량을 전달합니다. 비 차폐된 지역의 전체 줄기 세포 절제를 원하는 경우, X 선 irradiator를 사용하여 30 GY 이상을 제공합니다. 참고로, 30 GY 320 kilovolts에서 3.6 분, 30cm의 현장 - 투 - 소스 거리와 정밀 X-레이 주식 회사 XRAD320 10 milliamps와 동일합니다. </li><li> 즉시 먹이지 후 냉장 planarian 물에 블랙 필터 종이, 전송 동물로 벌레를 취급 완료된 것입니다. planarian 물이 검은색 거름종이으로부터 자신을 꺼내려 실내 온도와 동물 따뜻하게하도록 허용합니다. 부분적인 조사 절차가 완료되었습니다. </li></ol> 5. 조직 이식 <ol><li> 트랜스퍼 피펫과 집게를 사용하여 Pelti에 냉각되어 Kimwipe의 검은 필터 종이를 별도의 사각형에 anesthetized 호스트 및 기증자 웜을 마련해부 현미경 음이나 쿨러 플레이트. </li><li> 0.75 mm 내경 모세관을 사용하여 기증자로부터 이식 플러그를 자르고, 집게를 사용하여 호스트의 방향 부분의 아웃에 배치하십시오. 그라 프트 자료가 모세관 튜브에 걸리면, 포셉로 이동시키다. </li><li> 0.7 mm 외경 모세관이 호스트에서 플러그를 제거를 사용하고 뒤에 남은 구멍으로 포셉 위치 이식편을 사용합니다. </li><li> 2.7 단계에서 준비 페트리 접시에 자사의 블랙 필터 종이 사각형에 이식된 호스트를 전송합니다. </li><li> 카세 포화 Holtfreter의 솔루션을 통해 롤링 종이 조각을 습식 및 그림 2A에서 diagramed로 이식된 호스트의 상단에 배치하십시오. </li><li> 카세 포화 Holtfreter의 솔루션과 그림 2B에 diagramed로 이식된 호스트 상자에 넣다 거름종이 네 가지 조각을 만끽해보세요. </li><li> 카세 포화 Holtfreter의 솔루션에서 컷 Kimwipe 네 가지 덩어리 정말 끝내줘를 적시게하고 그들을 이상하다5.6 단계에서 여과지 (그림 2B). 뚜껑을 교체하고 얼음에 페트리 접시를 넣어. </li><li> planarian 물, 복구 치유, 그리고 재생하는으로 기증자 웜을 전송합니다. </li><li> 모든 이식이 완료되면 야간 10 ° C 배양기에 이식된 벌레를 놓으십시오. </li><li> 다음 아침, 돌보는 것은 그라 프트 방해 웜을 발견하고 planaria 물을 가득 배양 접시에 (의 검은 필터 종이에) 그것을 전송하는 방법 않습니다. </li><li> 어느 웜이 여과지에서 자신을 이동시키다거나 살짝 집게로 제거하실 수 있습니다. </li><li> 2~3일마다 한 번씩 planarian 물을 변경합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 즉시 부분 방사선 planaria를 따라하는 것은 정상 및 영향을받지 나타납니다. 배달 복용 및 사용 방패의 형상에 따라 조사 조직 복귀 심지어 7을 분해 수 있습니다. 차폐 조직은 그대로 유지됩니다. Foll인하여 조직 회귀 및 조직 무결성의 손실, 아체가 형성되고 누락된 구조는 (그림 3A) 다시 생성됩니다. 절단이 부분적으로 조사 지역에서 만들어진 경우, 조사 조직은 (그림 3B) (즉 regressing 또는 약해 방해) 구출됩니다. 손상되지 않은 및 절단 비 조사 planaria (그림 3C)에 비해 절단의 경우 재생이 지연됩니다. 모두에서 30 GY의 X 선 선량이 전달하고 부분적으로 조사 동물 사용된 리드 방패로 대응이 줄기 세포에 대한 원위치 하이브리드화에 의해 부분적인 조사에 따라 2~3일 확인할 수있는 패턴의 손상되지 않은 성공적인 줄기 세포 절제였다 경우 마커 Smed-piwi-1 12 (일명 smedwi-1) (그림 4). 이식, 이식된 조직의 성공적인 이식 따라 아침 분명한 w되어야호스트 (그림 5A)의 지느러미와 복부 표면에 모두 준수 있고, 호스트 조직을 ithin. 종종 이식은 복부 또는 지느러미 표면을 준수합니다. 이식 완전히 실패하면 이식편의 흔적은 호스트 (그림 5B) 중 하나 지느러미 또는 복부 표면에서 볼 수 없게됩니다. 곧 Smed-piwi-1 (그림 5C 주로 그래프트 내에 줄기 세포가 존재임을 밝히지 않습니다위한 원위치 하이브리드화에 치명적인 방사선 13,14에 의해 줄기 세포 ablated되었던 호스트에 비 조사 조직의 성공적인 이식을 따라 ). 또한 lethally 조사 호스트로 비 조사 조직의 성공적인 이식 호스트 조직 및 호스트 15 장기 생존의 구조가 높아집니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig1.jpg" /> 1 그림. 기본적인 구성 요소의 일반적인 배치부분적인 조사를위한 S는. 최고 위치를 X 선 소스와 X 선 irradiator에서 (음극 관) anesthetized planarian는 방사선 분야에서 직접 X 선 소스 아래에 위치하고 있습니다. X 선 선량 율을 극대화하기 위해서는 planarian 및 X 선 소스 사이의 거리는 최소화되어야한다. 납 차폐가 음극 관과 실천 등 웜에 가장 가까운 anesthetized 웜, 사이에 위치해야합니다. 리드 방어막 제조, 설계 및 배치되어야하므로 그것이 방패 원하는 조직을 하긴하지만 완전히 벌레의 나머지 부분은 제공합니다. 대부분의 상업은 심플한 디자인 다이어그램에서 사용자 지정 리드 보호막을 생성합니다 제조, 우리는 성공적으로 알파 시스템 주식 회사 (Bluffdale, UT)를 사용 하였다. 리드는 방어막의 원하는 금액을 할 수 있도록 충분한 두께가 있어야합니다. 320 kV X 선 빔의 차폐 완료 근처​​가 원하는 경우 예를 들어, 리드는 두께 4.5-6 mm이어야합니다. planarian와 방패가에 위치하고 있습니다Holtfreter의 젖은 거름종이는 얼음 양동이에 달려있다 페트리 접시를 정렬했습니다. 충분히 큰 X 선 방사선 분야와 동일 리드 방패의 수를 감안할 때, 많은 표본이 부분적으로 한 번에 (사진에 없음)에서 반구 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig2.jpg" /> 그림 2. 복구 챔버를 구축. 조직 이식 복구 챔버 () 분해도, 카세 포화 Holtfreter의 솔루션에 배어 후에 서로의 위에 상상을 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가있는 구성 요소를 모두 보여주고 있습니다. (B) 워트 먼지의 연동 배치를 보여주는 거의 완성 복구 챔버, # 3 필터 종이를 직사각형있는 석판이 anesthetized planarian 상자에 넣다, 치유 기간 동안 운동을 방지. 복구 챔버주의 건설 조직 이식의 신속한 치유와 큰 효능을 증진, 동물의 움직임과 탈수를 방지합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig3.jpg" /> 그림 3. 간단한 후부 부분 조사의 대표 성과. Dubois는 7 설명한 바와 같이, (A) planarians의 뒷부분 절반 리드와 차폐 후 X-레이 방사선에 노출되었을 때 앞부분은 조직이 조사와 차폐된의 경계에 다시 복귀하기 위해 관찰되었다 조직되는 시점 unpigmented blastemas는 형성과 동물 재생하기 시작했다. (나) 한편, 동물 (A), 조직 회귀가 관찰되지 않았습니다 나머지 조사 앞쪽에 휴지가 구출되었다에서 수행한 동일한 부분적인 조사에 따라 목이 잘린 때. unirradiated 참수 컨트롤 (C)에 비해 부분적으로 조사 동물의 재생 헤드를 (B) 목이 잘린 그러나 중생이 크게 지연되었다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig4.jpg" /> 4 그림. 대표 outco일부 줄기 세포 절제의 나 부분적인 조사를 수행. 줄기 세포 마커 Smed-piwi-1에 대한 원위치 하이브리드화 (좋겠어) 전체적으로 마운트 그 야생 유형 planaria를 보여 줄기 세포로 앞부분은 조직의 예외와 함께 그들의 시체를 분배했습니다 photoreceptors (화살촉)와 인두 적절한 (별표) 14. () 조사했지만 완전히 차폐된 컨트롤에 Smed-piwi-1을 기원 planaria 레이저도 다음 세 가지 일 야생 형 planaria의에서 구별할 수있는 줄기 세포 분포를 보여줍니다 고쳤어요. (나) 한편, 앞부분과 뒷부분 노출을 떠나, 오직 부분적 차폐되었다 동물 Smed-piwi-1을 기원뿐만 아니라 줄기 세포가 아닌 차폐된 지역에서 ablated하는 조사 프로그램에 따라 삼일 떠나지 않았습니다 . 스케일 바 500 미크론이다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig5.jpg" /> 그림 5. EXA성공과 실패 조직 이식의 mples 있습니다. () 사흘 이식에 따라 성공적으로 이식 planarian의 지느러미와 복부의 전망 이미지를 살고 있습니다. 이식편은 (표시된) 지느러미와 복부 표면 모두에서 명확하게 볼 수 있고 그래프트 - 호스트 인터페이스에서 특성 unpigmented 조직으로 둘러싸여 있습니다. (B) Correspondingly, 실패 transplantations는 이식 사이트 (지시)에서 눈에 띄는 그래프트 조직을 표시하지 않고 대신에 실패한 이식의 치유, unpigmented, 가로 상처를 보여줍니다. 오직 지느러미 또는 복부 표면에 부합 그라 프트는 (a) 다른에서 볼 때 한쪽과 실패 이식 (B)에서 본 성공적인 이식과 유사합니다. (C) 야생 유형 (wt) 조직은 주민 줄기 세포와 이식된 줄기 세포의 ablated되어 조사 호스트로 이식할 때 나중에 이식 따라 Smed-piwi-1 이틀 동안 소원에 의해 발표되어이식의 성공 여부는 명확에만 이식 위치 (화살촉) 또는 주위 간세포의 구체적인 존재에 의해 표시됩니다. 스케일 바 500 미크론이다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

고정의 중요성 고정이하여 지금까지 이러한 프로세스 중 하나의 성공적인 완성을위한 가장 중요한 단계입니다. planaria 부적 절한 부분적인 조사에 앞서 움직일 수있다면, 그들은 일관성과 혼란함을 주죠 결과를 생산, 리드 방패 아래에 이동할 수 있습니다. 동물이 충분 이식에 따라 움직일 수있다면 또한, 호스트 웜은 가능성이 호스트에 적절하게 치료 이식의 실패 결과, 이식 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 범용 전송 피펫 </td><td> Samco </td><td> 691 </td></tr><tr><td> 모세관 튜브 (ID 0.75 ㎜) </td><td> FHC </td><td> 30-30-0 </td></tr><tr><td> 모세관 튜브 (OD 0.7 ㎜) </td><td> FHC </td><td> 30-50-08 </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> VWR </td><td> 52858-076 </td></tr><tr><td> Kimwipes 34,155 </td><td> VWR </td><td> 500029-891 </td></tr><tr><td> 블랙 여과지 </td><td> Schleicher &amp; Schuell </td><td> 10310809 </td></tr><tr><td> 워트 먼지 # 2 필터 용지 1002-055 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 09-810B </td></tr><tr><td> 워트 먼지 # 3 필터 용지 1003-185 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 09-820E </td></tr><tr><td> 담배 압연 종이 </td><td> 지그재그 - 지그재그의 한 변, 원래 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 페트리요리 </td><td> VWR </td><td> 82050-544 </td></tr><tr><td> 집게 뒤몽, INOX # 5 </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td></tr><tr><td> Chloretone </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 112,054 </td></tr><tr><td> 카세인 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> C3400 </td></tr><tr><td> 보호막 리드 </td><td> 알파 시스템 주식 회사, Bluffdale, UT </td><td> 맞춤 설계 </td></tr><tr><td> XRAD-320 생물 Irradiator </td><td> 정밀 X-레이, 노스 Branford, CT </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

planarian immobilization, partial irradiation, and tissue transplantation

planarian, 담수 flatworm은 metazoan 재생 및 줄기 세포 생물학 1,2를 해부를위한 강력한 시스템을 것으로 입증되었습니다. 모든 없거나 손상된 조직의 Planarian 재생이 neoblasts 3 되나 성인 줄기 세포에 의해 가능하게된다. 이러한 줄기 세포는 정말 로요 pluripotent과 전체 동물 4 reconstituting의 singularly 가능한 것으로 표시되었습니다 있지만, 줄기 세포 인구와 그 세포 행동의 역학 내에서 이질이 크게 해결되지 않은 상태로 유지됩니다. 큰 번호와 planarian 본문 계획 전반에 걸쳐 줄기 세포의 광범위한 배포로 인해 생체내 분자와 기능성 연구를 위해 줄기 세포의 subpopulations 조작을위한 고급 방법이 필요하다. 조직 이식과 부분적인 조사는 planarian 줄기 세포의 subpopulation가 진학 격리 수있는가 두 가지 방법이 있습니다. 각 기술은 뚜렷한 장점이 있습니다. 티문제는 이식도 본질적으로 유전적으로 뚜렷한 있거나 이전에 pharmacologically 처리되었습니다 순진 호스트로, 줄기 세포의 도입을 허용합니다. 또한, 부분 조사는 상처의 도입이나 조직 통합에 볼기없이 줄기 세포를 찾아볼 수없는 조직으로 juxtaposed 호스트 내에서 줄기 세포의 고립을 허용합니다. 이러한 두 가지 방법을 사용, 하나는 세포 자율이 아닌 자율적인 요인을 조사할 수 있도록 증식, 분화, 및 마이 그 레이션과 같은 제어 줄기 세포 기능. 조직 이식 5,6와 부분적인 방사선 일곱 모두 오늘날 공부 밑에 남아 planarian 중생에 대한 질문이 많은 정의에서 역사적으로 사용되었습니다. 그러나 이러한 기술은 이전 방법의 힘드는과 일관성없는 성격으로 인해 underused 살아남았습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 시간 감소에 앞으로 큰 단계를 나타냅니다차 reproducibly 100 %에 접근 efficacies로 이식할 또는 부분적으로 조사 동물의 다수를 생성하기 위해 필요한 노력. 우리는 큰 동물의 문화, 부동화, 부분 조사, 조직 이식을위한 준비, 그리고 동물의 복구 최적화를 포괄합니다. 또한, 여기에 설명된 작업은 가장 널리 연구 planarian, Schmidtea 메디 테라 니아와 함께 사용하기위한 부분적인 조사 방법의 첫 번째 응용 프로그램을 보여줍니다. 또한 planaria에 접목 효율적인 조직은 오래 포유류 8 성인 줄기 세포의 잠재력을 시금의 골드 표준 방법되었습니다 repopulation의 assays의 순진하거나 치료 줄기 세포의 subpopulations의 기능 테스트를위한 문을 엽니다. 이러한 기술의 광범위한 채택은 조직 항상성 및 재생 중에 성인 줄기 세포의 세포 행동의 이해에 리드 의심하지 않습니다.

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Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

planaria 사이에 정의하고 일관성있는 크기의 조직을 접목을위한 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 또한 이식에 사용되는 고정 기법이 살아있는 동물의 부분 조사를위한 리드 방패와 함께, 적응하는 방법에 대한 설명이 포함되어 있습니다.

Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

planarian-immobilization-partial-irradiation-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K 조회수.  University of Utah School of Medicine. planaria 사이에 정의하고 일관성있는 크기의 조직을 접목을위한 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 또한 이식에 사용되는 고정 기법이 살아있는 동물의 부분 조사를위한 리드 방패와 함께, 적응하는 방법에 대한 설명이 포함되어 있습니다.

비디오: Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

Murine 피부 이식

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

연구

생물학

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

약리 및 기능성 유전자 Assays은 Planarian의 재생을 조작하는<em자포니카> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

배아 세포 이식 및 Testis 조직 마우스에 Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

조직 해리 차동 여과 이식 미토콘드리아의 신속한 분리 및 정제

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

장 부분 방해의 마우스 모델

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

유해 자극 감지를 위한 양적 행동 판독으로 기획자 스크런싱

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.