이 작품은 CIRM 조기 Translational II 연구 수상 TR2-01821, NIH / NIDCR (보조금 R21 DE0177711 및 RO1 DE01607), UC 디스커버리 그랜트 07-10677, AWJ 및 RKS에 의해 지원되었습니다 T32 연수 장학금 수상 (5T32DE007296-14), JNZ CIRM 훈련 교제 (TG2-01169)이 있습니다.

1. Perivascular 줄기 세포 격리 이것은 M. Corselli 외 의해 인접 기사 &quot;인간 백색 지방 조직에서 Perivascular 줄기 세포의 정화&quot;에 자세히 설명되어 있습니다. 2. 발판 만들기 <ol><li> 공사장 공중 발판은 폴리 (락트 - 공동 glycolic 산) (PLGA, Burmingham 폴리머) 히드록 시아파 타이트 코팅 4-6로의 이전에 다음 ID로 출판 프로토콜에 따라 맞춤 만들어집니다. 인회석 코팅 PLGA의 공사장 공중 발판은 용매 캐스팅과 미립자 침출 과정에서 PLGA 15분의 85에서 가공된다. 공사장 공중 발판은 근육 주머니 주입, 대퇴 segmental 결함에 대한 원반 모양 calvarial 주입에 대한 형상 (직경 4 ㎜), 또는 원통형 (직경 4mm, 길이 6 ㎜)에 대한 구면 형상 (2-mm 직경)에 만들어집니다. </li><li> 간단히, PLGA / 클로로포름 솔루션은 맞춤 죄수를 만드는 200 300 μm의 직경 테플론 몰드 속에 던져지는 자당 (폴리머 / 자당 비율 95분의 5, W / W)과 혼합truct. 하룻밤 냉동 건조 후 공사장 공중 발판은 테플론 몰드에서 제거되며 자당을 분해하는 ddH 2 O에 열중. 공사장 공중 발판은 ddH 2 O를 세 물에 빨고 그 다음, 30 분 동안 70 %의 에탄올에 침지하여 소독하고 </li><li> 인회석 코팅의 경우 모의 바디 오일 (SBF) 솔루션은 순차적으로 ddH 2 O.에 CaCl 2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3, K 2 HPO 4 • 3H 2 O를 해소하여 준비가되어 있습니다 솔루션 산도는 용해도를 증가 1M 염산을 추가하여 6으로 저하됩니다. 나 2 SO 4, KCl 및 NaCl이 추가되어 최종 산도는 6.5 (SBF 1)로 조정됩니다. </li><li> Mg2 +와 HCO 3 - 무료 SBF (SBF 2) CaCl 2와 ddH 2 O의 K 2 HPO 4 • 3H 2 O를 추가하고 산도가 6 져서 의해 준비가되어 있습니다. KCl과 NaCl이 추가되어 최종 산도가 6.8로 조정됩니다. 모든 솔루션은 0.22 μm의 PES membr 통해 여과 멸균 있습니다ane (Nalgene). 코팅 공정에 바로 전에, 말린 PLGA의 공사장 공중 발판은 wetting 및 코팅 균일성 향상을 위해 글로우 방전 아르곤 플라즈마 에칭 (Harrick 과학)를 받게됩니다. </li><li> 에칭처리된 공사장 공중 발판 그러면 12 H에 대해 SBF 1 incubated와 Mg2 +와 HCO 3으로 변경 - 37 호는 12 H 무료 SBF 2 ° C에서 부드럽게 저어 이하. 코팅 공사장 공중 발판을 초과 이온을 제거하는 ddH 2 O로 씻어 사전에 더욱 공부에 동결 건조된됩니다. </li></ol> 3. 근육 주머니 모델 주입 <ol><li> PBS의 PSC 서스펜션의 100 μl은 (인산염은 염분 버퍼) 부드럽게 주입은 즉시 이전 구면 PLGA 기반 보형물에 삭제됩니다. 셀 너무 생체내 추적 게시물 주입에 허용하는 것처럼 반딧불 루시페라제의 lentiviral 삽입에 의해 미리 분류되었습니다. 세포 밀도는 이식 당 2.5 × 10 5. </li><li> SCID (중증 복합 immunodeficient) 생쥐는 생후 6 주가되면 사용됩니다. 동물 anes 있습니다isoflurane 흡입에 의한 thetized 및 buprenorphine (베드 포드 연구소)와 premedicated. 표준 Betadine 준비 후 hindlimbs의 양자 incisions가 (길이가 세로 2 ㎜) 만들어집니다. </li><li> 주머니는 근육 섬유 긴 축에 무딘 절개를 병행하여 팔뚝 femoris 근육에 절단됩니다. 각 마우스의 경우 PSCs와 PLGA 기반 보형물이 삽입되고, 근육 overlying 근막은 5-0 Vicryl (Ethicon)와 함께 봉합합니다. </li><li> 피부는 다음 subcuticular 패턴에서 5-0 Vicryl로 닫힙니다. 10 일 동안, 동물은 48 시간 및 TMP / SMX (Qualitest 트리 메소 / 설파 메 톡 사 졸)에 대해 buprenorphine로 postoperatively 처리됩니다. </li></ol> 4. Calvarial 결함 모델 주입 <ol><li> SCID 마우스 (12~14주 오래된)의 isoflurane 마취 후 머리가 잘린 후 피부는 프로토콜 당 betadine로 소독한다. </li><li> 8-mm 피부 절개가 마우스 두개관의 중반 화살 봉합 함께 이루어집니다. 다음으로, calv이 Arial 골막이 부드럽게 Q-팁 응용 프로그램에 의해 제거됩니다. </li><li> 다음으로, 고속 치과용 드릴에서 다이아몬드 코팅 trephine 비트를 사용하여, 4-mm 정수리 뼈 결함이 만들어집니다. 결함은 전체 두께입니다 - 그러나주의가 기본 경질의 mater을 다치게하지 가져옵니다. </li><li> engrafted PSCs있는 맞춤 PLGA 기반 임플란트 그런 다음 결함 사이트에 부드럽게 위치합니다. 세포 밀도는 이식 당 2.5 × 10 5. 마지막으로, 피부는 6-0 Vicryl로 봉합한다. 동물은 48 시간 및 10 일 동안 TMP / SMX에 대한 buprenorphine와 postoperatively 처리됩니다. </li></ol> 5. 대퇴 Segmental 결함 모델 주입 <ol><li> Athymic 쥐 (12-14주 오래된)는 isoflurane 흡입 아래 anesthetized 있습니다. 대퇴골 하찮은 및 betadine 표준 프로토콜 (그림 1) 당 준비가되어 있습니다. </li><li> 27-30-mm 세로 절개는 대퇴골의 anterolateral 측면을 통해 이루어집니다. 대퇴부 샤프트는 다음 vastus 위도를 분리하여 노출되어eralis와 팔뚝 femoris 근육 (그림 2). </li><li> 뼈 중생의 일관성을 최대화하기 위해 대퇴 결함을 overlying 골막이 완전히 resected 대퇴 세그먼트로 제거됩니다. </li><li> 폴리에틸렌 플레이트는 (길이 23mm, 폭 4mm, 높이 4 ㎜) 대퇴골의 anterolateral 표면에 위치합니다. 플레이트가 0.9 밀리미터 직경의 스레드 Kirschner 와이어 (짐머)를 수용하려면 여섯 사전 뚫고 구멍이 포함되어 있습니다. 템플릿으로 접시를 타고 여섯 스레드 Kirschner 와이어는 접시 두 cortices (그림 3)를 통해 뚫고있다. </li><li> 다음, 작은 진동 톱 블레이드 (스트라이커, MI)로, 6 mm 중반 diaphyseal 결함이 만들어집니다. Segmental 결함 그때마다 프로토콜과 같은 세포 (그림 4)와 라덴되었습니다 PLGA 기반 임플란트의 삽입에 의해 처리됩니다. </li><li> overlying 근육과 근막이 제자리에 이식을 확보하기 위해 4-0 Vicryl 흡수성 봉합으로 폐쇄되며, 피부 봉합합니다. </li&gt; </ol> 6. VIVO 평가에서 <ol><li> Radiographic 평가는 고해상도 XR 및 고해상도 μCT (마이크로 계산된 tomography) 분석 모두에서 세로 방식으로 수행됩니다. μCT 분석 (Skyscan 1172F)의 경우, 이미지가 19.73 μm의 (100 kV, 100 석사 방사선 소스, 0.5 mm 알루미늄 필터를 사용)의 해상도로 스캔합니다. 이미지 DataViewer, 정찰기, CTAn 및 CTVol 소프트웨어를 사용하여 분석하고 있습니다. </li><li> Bioluminescence 이미징은 또한 세포 engraftment, 생존, 증식을 평가하고 보형물 사이트의 마이 그 레이션을 제외할 직렬 방식으로 이루어집니다. Bioluminescence 이미징은 IVIS Lumina II 장치 (캘리퍼스 생명 과학)를 사용하여 수행됩니다. 조명 출력은 생활 이미지 소프트웨어 (Xenogen)을 사용하여 계량한다. 총 광 출력은 광자 / 평방 / 초 cm / steradian에 기록됩니다. </li><li> Histological 및 histomorphometric 분석은 사후에 수행됩니다. 고용 정기 얼룩 Masson의 trichrome, 아닐린 블루, P를 포함entachrome 및 Picrosirius 빨간색. Histomorphometric 분석 뼈 같은가 각각 파란색과 노란색 어두운 나타나는, 아닐린 블루 pentachrome 얼룩 하나 쉽게 수행됩니다. 높은 동력 분야마다 픽셀은 어도비 포토샵의 마법 지팡이 도구를 사용하여 계산됩니다. </li></ol> 7. 대표 결과 calvarial과 대퇴 결함이 모두 중요 크기 때문에, 더 중요한 치료는 성장 요인이나 외인성 줄기 세포로 치료없이 기대 해서도 안됩니다. 국지 전술의 측면에서 근육 주머니의 해부는 fascial 비행기를 따라해야하기 때문에 최소한의 출혈이 발생한다. 근육 파우치 모델이 양자 수행하더라도, 마우스는 수술 후 1 일째에 쉽게 걸어해야합니다. calvarial 결함의 경우 출혈이 발생하지만 Q-팁 흥건히 묻어 수 있습니다. 익스 트림주의 기본 경질의 mater을 다치게하지 복용해야 -이게 방해하므로정상적인 치유와. FSD 모델의 경우주의가 neurologic 손상을 방지하기 위해 과도한 출혈이나 대퇴 신경을 일으킬하지 않는만큼 주요 혈관을 다치게하지 가져옵니다. Kirschner 와이어가 있으므로 같은 과정에서 대뇌 피질 골을 손상하지 않는 부드러운 압력으로 뚫고있다. <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" /> 1 그림. Athymic 쥐에 대퇴 Segmental 결함에 대한 수술 전 준비 (FSD). 남성 쥐 (12~14주 오래된)는 isoflurane 흡입 아래 anesthetized 있습니다. 대퇴골 하찮은이며 betadine있는 표준 프로토콜에 따라 준비. <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" /> 그림 2. 대퇴부 Segmental 결함 (FSD) 제작을위한 외과 노출. 27-30mm 세로 절개는 대퇴골의 anterolateral 측면을 통해 이루어집니다. 대퇴 축의 측면 그러면 vastus lateralis를 분리하여 노출되어그리고 팔뚝 femoris 근육. <img alt="그림 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" /> 그림 3. 대퇴부 Segmental 결함 (FSD) 제작을위한 고정. 폴리에틸렌 플레이트는 (길이 23mm, 폭 4mm, 높이 4 ㎜) 대퇴골의 anterolateral 표면에 위치합니다. 플레이트가 0.9 밀리미터 직경의 스레드 Kirschner 와이어를 수용이 6 미리 뚫고 구멍이 포함되어 있습니다. 템플릿으로 접시를 타고 여섯 스레드 Kirschner 와이어는 접시 두 cortices 통해 뚫고있다. 다음으로, 6mm 중간 diaphyseal 결함이 만들어집니다. 이것이 수행되면 사용자 정의 - 만든 비계에서 직접 어느 정확하게 (보이지 않음) 결함 사이트를 맞는 삽입됩니다. <img alt="4 그림." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" /> 4 그림. 수술후 Calvarial 결함의 예. 4mm, 원형 calvarial 결함이 athymic 생쥐의 오른쪽 정수리 뼈에 만들어집니다. 몇 군데는 여기로 이식 결함 사이트입니다수술후 8주에서 PSCs. 결함 사이트 내에서 새로운 뼈의 존재를 확인합니다.

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KT, 혈압 및 CS은 UCLA에서 제기된 perivascular 줄기 세포 관련 특허의 발명가입니다. Drs. KT와 CS는 UC Regents에서 perivascular 줄기 세포 관련 특허를 sublicenses Scarless 연구소 Inc의 창립자입니다. 박사 Chia 지수도 Scarless 연구소, 주식 회사의 임원이다

PSCs의 분리가 잘 특별히 PSC 격리 프로토콜과 방법을 해결 별도로 제출한 주피터의 간행물을 포함하여 다른 1-3 설명되어 있습니다. 이 문서의 구체적인 목적은 뼈 형성 / 재생을위한 생체내 응용 프로그램에서 PSC 3 프로토콜을 설명하고 입증하는 것입니다. SCID 마우스 근육 주머니는 자궁외 인간의 뼈 형성 7에 대한 일반적 설명하는 모델입니다. 중요한 차이는 paracrine 호스트 뼈 - 형성 세포 8 상호 작용뿐만 아니라 골격 결함 microenvironment에 존재 osteogenic 신호 요소의 풍부한 포함한 뼈에 자궁외 및 orthotopic (결함) 모델 사이에 존재합니다. 두 결함은 여기 calvarial defect8과 대퇴 segmental 결함 4 제공됩니다. 모두 (즉 스스로 치유되지 않음) 크기의 중요한 것으로 잘 설명되어 있습니다. 재미있는 차이 calvarial 및 대퇴 결함 사이에 존재합니다. 첫째,셀 : xenografted PSCs과 내생 세포 사이의 세포 상호 작용은 매우 다릅니다. calvarial 결함의 측면에서 PSCs은 기본 경질의 mater (meninges의 가장 바깥쪽 레이어)뿐만 아니라 결함 사이트를 circumscribing 그 osteoblasts와 periosteal 세포와 상호 작용. 중요한 것은, 이식 세포 및 주변 osteoblasts 8 또는 이식 세포 밑에 경질 (레비 외., 언론) 간의 상호 작용이 진행 osteogenesis를 매개 정상적인 줄기 세포에 대한 중요합니다. 대퇴 segmental 결함 (FSD)의 측면에서 xenografted PSCs는 매우 다른 세포와 시토킨 환경에 노출됩니다. 예를 들어, FSD 사이트는 골수 및 동봉 mesenchymal 줄기 세포뿐만 아니라 endosteum, 골막과 긴 뼈 osteoblasts 구성되어 있습니다. 이론적으로, 각 세포 상해에 대한 자체적인 반응을 가지고 있으며, 각각 세포가있을 수 있습니다 PSC의 xenografts와 세포의 상호 작용. 다른 분명한 차이는 calvarial 사이에 존재그리고 대퇴부 결함. 긴 뼈가 연골 중간 (endochondral의 골화)를 통해 형성하면서 calvarial 뼈가 초기 intramembranous 골화을 형성하고 있습니다. 또한, reparative 프로세스는 이후 부상에도 이러한 발달적 기원을 모방한 것이었 지요. 아무 연골 중간은 정수리 뼈 결함 내에 형성되지 않습니다 반면, 포스트 FSD, 연골의 굳은살 형성은 관찰된다. 마지막으로, 두개골의 배아 기원은 긴 뼈의 차이가있을 수 있습니다. 두개골 (- pericytes - perivascular 세포를 포함한 전체 헤드 지역)의 대부분은 appendicular의 골격은 paraxial mesoderm의 파생 9 시간 동안 신경 문장 (mesectoderm)에서 파생됩니다. 이러한 모든 차이 PSC-매​​개 뼈 수리 측면에서 큰 차이가 발생할 수 있습니다. PSCs의 사용은 전통적인 지방 파생 stromal 세포 (ASCs) 이상 여러 가지 장점을 가지고 있습니다. PSCs 문화를 필요로하고 정화 세포 인구 whi하지 않는다고그리고 심지어 부정적인 규제 없어 - - osteogenic 차별화 등 10 내피 세포와 같은 채널은 참여하지 않는 다른 stromal 세포를 포함하지 않습니다. 반대로 예를 들면, ASCs의 clonal 분석은 subpopulation가 체외 11 osteogenic 분화를 겪고 능력이있다 는걸 보여줍니다. 결국, 골격 조직 엔지니어링 노력은 가능성이 가장 좋은 골격 결함을 치유하는만큼 외인성 성장 요인과 osteocompetent 줄기 세포 (예 PSCs) 및 osteoconductive 비계 (예 : HA-PLGA와 같은 현재의 방법에서 사용) 통합됩니다.

use of human perivascular stem cells for bone regeneration

인간 perivascular 줄기 세포는 (PSCs) 골격 조직 공학 1-3의 목적에 대해 여러 조직에서 충분한 숫자 격리 수 있습니다. PSCs는 &#39;pericytes&#39;의 FACS - 정렬 인구 (CD146 + CD34-CD45-) 그리고 우리가 이전에 mesenchymal 줄기 세포의 속성을 가지고보고에 따르면 각각 &#39;adventitial 세포&#39;(CD146-CD34 + CD45-)입니다. PSCs는 MSCS처럼 osteogenic 차별화뿐만 아니라 분비 프로 osteogenic 크린 시토킨 1,2를 받아야 할 수 있습니다. 현재 프로토콜에서 우리는 SCID의 근육 주머니 주입 포함한 여러 동물 모델에서 PSCs의 osteogenicity을 설명 (심한 복합 immunodeficient) 마우스, SCID 마우스 calvarial 결함 및 athymic 쥐에 대퇴 segmental 결함 (FSD)를. 허벅지 근육 주머니 모델은 자궁외 뼈 형성을 평가하는 데 사용됩니다. Calvarial 결함 정수리 뼈를 중심으로, 직경 standardly 4mm (비판적 크기) 8 있습니다. FSDs는 bicortical하고 함께 안정된다폴리에틸렌 바, K - 와이어 4. 설명 FSD는 크게 자체 4 일 치료를하지 않는 임계 크기의 결함입니다. 줄기 세포 또는 성장 요소가 결함 사이트에 추가하는 경우에는 반대로, 큰 뼈 재생을 감상할 수 있습니다. PSC의 xenografting의 전반적인 목표는 자궁외 및 orthotopic 모두 뼈 재생 모델에서 세포 유형의 osteogenic 능력을 입증하는 것입니다.

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Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

인간 perivascular 줄기 세포는 (PSCs) mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 유사한 골격 조직 재생을위한 소설 줄기 세포 클래스입니다. PSCs는 표준 지방 흡입 절차 동안 조달 지방 조직에서 FACS (형광 활성 세포 분류)에 의해 격리 수 있습니다 다음, 뼈 형성을 달성하기 osteoinductive 비계와 결합<em&gt; 생체내에서</em&gt;.

뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

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20.3K 조회수.  School of Dentistry, UCLA. 인간 perivascular 줄기 세포는 (PSCs) mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 유사한 골격 조직 재생을위한 소설 줄기 세포 클래스입니다. PSCs는 표준 지방 흡입 절차 동안 조달 지방 조직에서 FACS (형광 활성 세포 분류)에 의해 격리 수 있습니다 다음, 뼈 형성을 달성하기 osteoinductive 비계와 결합 생체내에서.

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

연구

생체공학

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Y-27632를 사용하여 1차 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...