이 작품은 워싱턴 대학, 프로그램 프로젝트 그랜트 NS032636 (BJS)에 NIH 신경 과학 청사진 코어 교부금 (P30 NS057105, BJS)와 신경계 장애에 대한 희망 센터에 의해 지원되었다.

1. Lentiviral 벡터의 포장 Lentiviral 벡터는 lentiviral 전송 벡터 및 칼슘 인산염 transfection 방법에 의한 293T 세포에 포장에 필요한 다른 plasmids의 cotransfection에 의해 생산됩니다. 우리는이 프로토콜의 10 100-mm 조직 배양 접시를 사용합니다. 그것은 최대 크기를 조정 또는 아래로 응용에 따라 수 있습니다. 293T 세포 라인 10% 태아 소 혈청 (FBS), 100 단위 / ML 페니실린, 37 ° C ~ 100 μg / ML 스트렙토 마이신과 보완, 높은 혈당 (4500 MG / L)로 Dulbecco의 수정된 이글스 매체 (DMEM)에서 관리되고 있습니다 5% CO 2 배양기. <ol><li> 배지에서 10 100-mm 조직 배양 요리 (3 X 10 6 세포 / 접시)에 30-40%의 합류점에서 종자 293T 세포. 배양기에 세포를 반환합니다. </li><li> 20-24 H 문화 후 세포 밀도를 확인하십시오. 세포는 transfection시 약 80 %의 합류해야합니다. </li><li> 50 ML 튜브를 준비합니다. 4.4 ML TE79/10 (1 MM TrisHCl, 0.1 MM 추가EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 다음 플라스미드 DNA의 마이너스 총 볼륨 산도 7.9). 100 μg lentiviral 전송 플라스미드 (그림 1), 58 μg pMDLg / pRRE, 31 μg pCMV-G, 25 μg pRSV - 레브 600 μl 2M CaCl 2. 추가 부드럽게 믹스. </li><li> 또 다른 50-ML 튜브를 준비합니다. 5 ML 2X HBS를 (0.05 M의 HEPES, 0.28 M NaCl, 1.5 MM이 나 HPO 4, 산도 7.12) 추가합니다. </li><li> 10-ML 피펫으로 DNA-CaCl 2 혼합물을 가지고 튜브를 vortexing하면서 dropwise이 X HBS를 포함하는 튜브에 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 실온 (RT)에서 석출 반응을 유지. </li><li> 배양기에서 배양 접시를 제거합니다. vortexing하여 잘 석출 반응을 섞는다. 각 100 mm 접시 함유 세포로 정지 1 ML을 추가합니다. 서스펜션은 부드럽게 접시에있는 매체를 소용돌이 치는 동안 천천히, dropwise 추가해야합니다. 보육 이러한 요리를 반환 5 H로 떠나. </li><li> 문화 매체를 제거합니다. 6 MM 나트륨 BU를 포함하는 6 ML 신선한 배지 추가각 요리에 tyrate. 인큐베이터에 문화를 반환합니다. 구조의 형광 기자이있다면 하룻밤 문화 후, 형광 현미경으로 리포터 유전자 발현을 확인합니다. 그것이 유비 쿼터스 발기인 (예 : CMV 프로 모터)에 의해 구동하는 경우 일반적으로, 세포의 80 % 이상은 리포터 유전자를 표현. </li><li> 이틀 (40-44 H) transfection 후, 2 개의 50-ML 튜브 (약 30 ML 각 튜브)에 10 요리에서 뜨는 수집합니다. -80 ° C의 냉장고에 뜨는 고정하거나 다음 단계로 이동합니다. </li></ol> 2. 벡터의 농도 및 정화 <ol><li> 원심 갓 표면에 뜨는에서 모든 세포 파편을 제거하는 10 분 동안 900g (2000 RPM 정도)에서 수집된이나 뜨는 해동. </li><li> 0.2-μm의 SFCA 주사기 필터로 60 ML 주사기를 부착합니다. 주사기로 50 ML 튜브에서 뜨는을 전송합니다. polyallomer의 원심 관에 뜨는을 필터링합니다. </li><li> 5 ML 피펫의 최대 5 ML 20 % 자당을 (PBS에서 준비) 가져가라. 삽입뜨는을 포함하는 원심 분리기 튜브의 바닥에 피펫. 천천히 벡터 뜨는 아래 자당 솔루션을 추가합니다. 다른 튜브의 표면에 뜨는 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> ° C 4 H에 대한 Beckman SW28 스윙 로터와 11,000 RPM과 4에서 뜨는을 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 제거합니다. 각각의 원심 분리기 튜브 150 μl 4 % 유당을 (PBS에서 준비) 추가합니다. 알약을 Resuspend. </li><li> 모든 원심 분리기 튜브에서 1.5 ML 관에 집중 벡터를 전송합니다. 15 분 동안 얼음 튜브를 남겨주세요. </li><li> pipetting하여 벡터 정지를 섞습니다. 1 분 동안 최대 속도 (16,000 천달러 정도)에 microcentrifuge 같이 해요. </li><li> 새로운 1.5-ML 관에 뜨는 전송합니다. 20 μl aliquots에 최종 샘플을 나누어 -80 ° C의 냉동고에 그들을 저장. </li></ol> 3. 벡터의 적정 <ol><li> 종자 5 × 10 4 / 잘 10% FBS로 보완 한 ML DMEM 배지에서 12 잘 플레이트의 HT1080 세포의. </li><li> overnig 후HT 문화는 잘 하나에서 세포를 세고 휴대폰 번호를 득점. </li><li> 문화 매체로 집중 벡터의 5 배 희석 직렬 (및 1:625; 1:125 25 1시 5분, 1) 확인합니다. 별도의 우물 각 희석 벡터의 전 μl 추가합니다. 샘플 정확도를 높이기 위해 중복될 수 있습니다. </li><li> 각도 포함하는 벡터와 벡터없이 잘 개를 1 μl 4 밀리그램 / ML Polybrene (Hexadimethrine 브로마이드)를 추가합니다. 부드럽게 판을 흔들어하여 섞는다. 48 H을위한 인큐베이터로 돌아가기. </li><li> 세포 배양 우물에서 매체를 제거합니다. PBS로 각 잘 씻으십시오. 세포를 250 μl 1X trypsine-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가합니다. 전지은 (3-5 분) 분리되면, 1 ML 문화 매체를 추가하십시오. pipetting하여 세포를 Resuspend. 1.5 ML의 원심 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 6 분 동안 900g에서 원심 분리기. 형광 리포터 유전자 (예 : GFP)와 벡터의 경우 FACS 분석을 위해 3.7 단계로 이동합니다. 기자없이 벡터의 경우 실시간 qPCR을 위해 3.8 단계로 이동합니다. </li><li> fluo를 포함하는 벡터에 대한rescent 리포터 유전자가 뜨는을 제거하고 PBS에 3.7 %의 포름 알데히드 300 μl로 펠렛을 resuspend. FACS 분석하여 기자 양성 세포의 비율을 결정합니다. titer는 밀리리터 집중 벡터 (TU / ML) 당 형질 도입 단위로 표시됩니다. </li></ol><img alt="등식 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" /> 예를 들어, 1 X 10 5 세포 25분의 1 μl (0.04 μl) 벡터와 30 %의 세포로 transduced되었다이 기자 긍정적이며, titer가 될 것입니다 : <img alt="등식이" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" /> 오직 dilutions 양성 세포의 비율과 titer를 계산하기 위해 추가 벡터의 양을 간의 선형 관계에 빠지지 사용합니다. 최종 titer는 벡터의 적어도 2 개의 다른 양의 transductions에서 얻은 titers의 평균이어야합니다. <ol start="8"><li> 없이 벡터에 대한형광 리포터 유전자는 제조 업체의 프로토콜에 따라 QIAamp DNA와 미니 키트 (Qiagen)를 사용 HT1080 세포의 게놈 DNA를 추출합니다. primers (HIV-1 PBS / PSI 지역 17) 5&#39;-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 &#39;와 5&#39;-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3&#39;로 ABI 프리즘 7000 시퀀스 탐지 시스템 (응용 Biosystems)를 사용하여 게놈 DNA의 벡터 시퀀스를 확대하고, TaqMan 탐침 5 &#39;-식구들-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3&#39;이다. 게놈의 단일 사본 유전자 (2 부 / 셀)입니다 알부민 유전자는 또한 primers 5&#39;-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 &#39;와 5&#39;-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3&#39;로 증폭하고, 프로브 5&#39;-우리 식구들-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3습니다 &#39;내부 통제 등. 다음의 프로그램 제작의 지시에 따라 96 - 웰 플레이트에 복사 벡터의 번호와 PCR에 의한 알부민을 결정 : 15 초, 50 ° C에서 2 분, 95 ° 10 분, 95의 35주기위한 C ° C와 60 ° C 2 분입니다. 알려진 농도 plasmids의 10 배로 시리얼 dilutions (부로 표현번호) 템플릿 시퀀스도 알려지지 않은 샘플 부량위한 표준 곡선을 작성 증폭되어야 포함하는. titer는 밀리리터 집중 벡터 (IU / ML) 당 통합 단위로 표시됩니다. </li></ol><img alt="등식 3" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" /> 4. Neocortical 문화의 형질 도입 뉴런과 glia를 모두 포함하는 Neocortical 문화는 이전 18 설명된대로 두 단계 도금 절차를 사용하여 마우스 cortices에서 준비가되어 있습니다. 14~16일의 태동부터 태아 생쥐에서 얻은 Neocortices는 10% FBS, 24 음 조직 배양 플레이트 20 밀리미터 포도당과 2 밀리미터 글루타민과 함께 보충 MEM에서 이전에 설립 glial 단일층에 도금하고 있습니다. <ol><li> 시험 관내에 5 일 후에 neoc 10 μm의 사이 토신 arabinoside (ARA-C)을 추가ortical 문화 이외의 연결을 세포 분열을 억제합니다. 문화에게 2 일간 세포를 계속합니다. </li><li> 5-10 분 37의 따뜻한 문화 매체 ° C의 물 목욕. 신선한 배지 (물론 500 μl /)로 매체를 포함하는 아라-C를 교체합니다. </li><li> 문화, 원하는 방어 (대상 세포의 개수에 벡터 입자의 개수의 비율 감염 다수)를 벡터에 추가합니다. 24 H에 대한 문화를 계속합니다. 우리는 일차 피질 문화에 (대개 5) 1-10의 방어를 사용합니다. </li><li> 신선한 매체와 문화 매체를 교체합니다. 문화를 계속합니다. 벡터 구조에서 리포터 유전자가있다면 2 일 형질 도입 후 형광 현미경으로 세포를 확인합니다. 리포터 유전자 발현은 벡터 디자인과 사용 복용량에 따라 형질 도입 후 뉴런 2-7에 표시됩니다. </li></ol> 5. 대표 결과 이 프로토콜 범위 생산된 lentiviral 벡터의 titers 10 8 -10 10 IU / ML, whicH는 시험 관내 및 생체내의 두 CNS의 세포 유형의 다양한 형질 도입에 적합합니다. 표 1과 그림 2는이 프로토콜이 제작한 벡터를 사용하는 대표적인 결과를 보여줍니다. 우리는 transduced 표현 lentiviral 벡터와 murine neocortical 문화를 녹색 형광 단백질 (GFP) synapsin (SYN) 발기인 또는 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 프로 모터에 의해 제어. 이레 형질 도입 후, 우리는 각각 안티 NeuN 및 안티 GFAP 항체와 라벨 뉴런과 astrocytes에 immunostaining 수행했습니다. 으로 표 1과 그림. 2A는 뉴런의 90 % (NeuN + 세포)를 통해, synapsin 발기인을 나르는 벡터로 형질 도입 후 특급 GFP없이 astrocytes는 (GFAP + 세포)이 리포터 유전자를 표현. GFAP 발기인은 astrocytes의 약 80 % (GFAP + 세포) expres, 벡터 구조 (그림 2B)에서 사용되는 경우의 GFP, 모든 GFP + 세포 GFAP와 colocalization와 NeuN-라벨 세포의 GFP 표현의 부재에 의해 확인된대로 astrocytes 있습니다. 이러한 결과는 lentiviral 벡터 CNS와 세포에 특정한 유전자 발현에서 세포로 transgenes를 전달하는 매우 효율적인 적절한 발기인이 사용될 때 달성될 수 있도록 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" /> 1 그림. HIV 기반 lentiviral 벡터와 포장 plasmids의 도식 표현은. HIV-1 provirus는 상단에 표시됩니다. 벡터 생산을위한 요소는 네 가지 plasmids으로 구분됩니다. 플라스미드 lentiviral 양도 U3 영역이 사이토 메갈로 바이러스 프로 (CMV) 발기인, 포장 신호 (ψ), RRE 순서, 중앙 polypurine 기관을 (cPPT), 관심있는 유전자 (예로 대체되는 하이브리드 5 &#39;LTR이 포함되어 있습니다 형광등 선택의 발기인과 함께 기자)와 3 &#39;LTR하는CIS 규제 시퀀스는 완전히 U3 영역에서 제거됩니다. pMDLg / pRRE은 CMV 프로 모터의 조절하에 HIV-1의 개그와 폴포트 유전자 및 RRE 시퀀스가​​ 포함되어 있습니다. pRSV - 레브 RSV 프로 모터에 의해 구동 레브의 코딩 순서가 포함되어 있습니다. pCMV-G는 CMV 프로 모터의 조절하에 VSV-G 단백질 유전자가 포함되어 있습니다. PA는 인간 β-globin 유전자의 polyadenylation 신호를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" /> 그림 2. 마우스 neocortical 혼합 문화의 리포터 유전자의 표현이 세포 유형의 특정 발기인을 나르는 lentiviral 벡터와 transduced. 문화는 LV-SYN-GFP (A) 또는 (b) 방어 5시 LV-GFAP-GFP 벡터와 transduced되었다. 이레 형질 도입 후, 세포가 백신 NeuN 또는 방지 GFAP 항체와 immunostained되었다. 어퍼 패널 GFP 형광을 보여, 중앙 패널은 immunostaining을 표시하고 낮은 패널은 (GFP : 녹색, NeuN 또는 GFAP : 적색) 이미​​지를 병합됩니다. </P&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> 벡터 </td><td> 뉴런의 GFP + 세포 </td><td> astrocytes에 GFP +는 </td></tr><tr><td> LV-SYN-GFP </td><td> 92.2 ± 7.3 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> LV-GFAP-GFP </td><td> 0 </td><td> 78.3 ± 11.5 </td></tr></tbody></table> 표 1. murine neocortical 문화의 GFP 표현의 비교는 다른 발기인을 나르는 lentiviral 벡터와 transduced. Murine neocortical 문화는 (5 × 10 5 / 잘 24 - 웰 플레이트) 입니다만 5 시에 LV-SYN-GFP 또는 LV-GFAP-GFP와 transduced되었다. 형질 도입 후 이레가, 문화가 수정 및 NeuN 또는 GFAP에 대한 immunostained되었다. GFP와 NeuN / GFAP 표현하는 세포의 숫자는 실험 조건 지당 10 분야의 이미지에 포함되었다. 값은 또는 뉴런의 비율 (NeuN + 세포)를 나타내는또한 GFP의 리포터 유전자를 표현 astrocytes (GFAP + 세포). 표시된 값은 수단 ± SD 세 독립적인 실험에서입니다.

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Virol. 73, 1828-1834 (1999).</li><li>Palsson, B., Andreadis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physico-chemical+factors+that+govern+retrovirus-mediated+gene+transfer.">The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer.</a> Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+of+G-Protein+Signaling-10+Negatively+Regulates+NF-{kappa}B+in+Microglia+and+Neuroprotects+Dopaminergic+Neurons+in+Hemiparkinsonian+Rats.">Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats.</a> J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).</li><li>Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoters+and+serotypes:+targeting+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+transfer+in+the+rat+central+nervous+system+in+vitro+and+in+vivo.">Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo.</a> Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 프로토콜에서는 neocortical 문화권에서 이러한 벡터의 lentiviral 벡터와 응용 프로그램의 제작을 보여주었다. 우리는이 방법으로 생산되는 벡터로 효율적이고 셀 유형 - 특정 형질 도입을 보여주었다. synapsin 모터를 사용하는 경우, GFP 표현은 엄격히 신경 세포에만 적용됩니다. GFAP 모터를 사용하는 경우, GFP 표현은 astrocytes에 독점적이다. 어떤 세포 유형에 특정한 표현이 필요하지 않은 경우 유비 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SV3001403 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CM </td></tr><tr><td> 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T3924 </td></tr><tr><td> 나트륨 butyrate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Hexadimethrine 브로마이드 (Polybrene) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> 293T 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td></tr><tr><td> HT1080 세포 </td><td> ATCC </td><td> CCL-121 </td></tr><tr><td> 팔콘 100 X 20mm 조직 cultur전자 요리 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,003 </td></tr><tr><td> × 3 ½ polyallomoer의 원심 분리기 튜브 1 </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 326,823 </td></tr><tr><td> 0.2 마이크론 주사기 필터 </td><td> 코닝 </td><td> 431,219 </td></tr><tr><td> QIAamp DNA 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 51,304 </td></tr></tbody></table>

production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system

중추 신경계 (CNS)에서 효율적인 유전자 전달 신경학적인 질병 모델링 및 치료 접근법을 개발, 유전자 기능 연구에 중요하다. Lentiviral 벡터들은 모두 분리 및 비 나누어 세포, transgenes 지원하는 지속적인 표현을 transduce으로 CNS의 뉴런과 다른 세포 유형의 형질 도입에 매력적인 도구이며, 비교적 큰 포장 용량과 낮은 독성 1-3 있습니다. Lentiviral 벡터가 성공적으로 체외 4-6에서 많은 신경 세포 유형을 transducing과 7-10 동물에 사용되었습니다. 그레이트 노력 향상된 biosafety 및 유전자 전달을위한 효율 lentiviral 벡터를 개발되었습니다. 현재 3 세대 복제 - 결함과 자기 운영을 중지시키지 (SIN) lentiviral 벡터는 그림 1에 표시됩니다. 벡터 포장을위한 필수 요소 네 가지 plasmids 나뉘어있​​다. lentiviral 트랜스에서플라스미드 하기까지, 5 &#39;긴 터미널 반복 (LTR)의 U3 영역은 다른 바이러스의 강력한 모터로 대체됩니다. 이 수정은 일반적으로 HIV 유전자 발현 11가 필요합니다 HIV-1 두드리는 단백질의 벡터 시퀀스의 전사 독립 있습니다. 포장 신호 (Ψ)가 encapsidation와 레브 - 반응 요소 (RRE)에 필수적인 높은 titer 벡터를 제작할 필요합니다. 중앙 polypurine 요로 (cPPT)는 벡터 DNA의 핵 수입이 아닌 분열하는 세포에게 12 transducing에 필요한 기능을 위해 중요하다. 3 &#39;LTR에서 CIS-규제 시퀀스는 완전히 U3 영역에서 제거됩니다. 이 삭제는 두 LTRs의 transcriptional 불활 성화 결과, 리버스 녹음 후 5 &#39;LTR에 복사됩니다. 플라스미드 pMDLg / pRRE은 구조 단백질 및 역방향 transcriptase를 제공​​ HIV-1 개그 / POL 유전자를 포함합니다. pRSV - 레브 핵의 효율적인 RNA의 수출 RRE에 바인딩 레브 인코딩합니다. pCMV-G는 인코딩HIV-1 유럽 표준안을 대체 소낭성의 구염 바이러스 당단백질 (VSV-G). VSV-G는 벡터의 tropism을 확대하고 ultracentrifugation 13을 통해 집중력이 가능합니다. Vif, Vpr, VPU 및 NEF 포함한 액세서리 단백질을 인코딩 모든 유전자는 패키징 시스템에서 제외됩니다. lentiviral 벡터의 생산과 조작은 재조합 DNA (참여 연구를위한 NIH 가이드라인에 따라 실시되어야 <a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf을</a> ). 개별 기관 생물 및 화학 안전위원회의 승인을 lentiviral 벡터를 사용하기 전에 필요할 수 있습니다. Lentiviral 벡터는 일반적으로 lentiviral 전송 플라스미드 및 벡터 포장에 필요한 단백질을 인코딩 도우미 plasmids 함께 293T 세포의 cotransfection에 의해 생산됩니다. 많은 lentiviral 전송 plasmids와 헬퍼 plasmids은 Addgene, 비에서 구할 수 있습니다비영리 플라스미드 보관함 ( <a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/~~V</a> ). 일부 안정적인 포장 세포 라인 개발하지만, 이러한 시스템은 시간이 14여 덜 유연성과 그들의 포장 효율은 일반적으로 거부, 15을 제공하고 있습니다. 상용 transfection 키트는 transfection 16 높은 효율성을 지원할 수 있지만 대규모 벡터 준비를 위해 매우 비쌉니다. 칼슘 인산염 석출 방법 293T 세포의 효율적인 transfection을 제공하기 때문에 lentiviral 벡터 생산을위한 안정적이고 비용 효과적인 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 20 %의 자당 쿠션을 통해 정화 및 ultracentrifugation와 농도이어서 칼슘 인산염 석출 원리에 기반으로 최대 4 plasmids 함께 293T 세포의 cotransfection로 lentiviral 벡터를 생성합니다. 벡터 titers는 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 항문에 의해 결정됩니다ysis 또는 실시간 qPCR에 의한. 이 프로토콜의 lentiviral 벡터의 생산과 적정가 구일이 완료됩니다. 우리는 뉴런과 astrocytes를 모두 포함하는 murine neocortical 문화로 이러한 벡터를 transducing의 예를 제공합니다. 우리는 lentiviral 벡터 형질 도입과 CNS의 기본 교양 세포의 세포 유형의 특정 유전자 발현의 높은 효율을 지원하는 것을 보여줍니다.

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Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

이 프로토콜에서는 생산, 정제 및 lentiviral 벡터의 적정을 설명합니다. 우리는 기본 교양 뉴런과 astrocytes의 lentiviral 벡터 매개 유전자 전달의 예제를 제공합니다. 우리의 방법은 다른 세포 유형에도 적용될 수<em&gt; 체외에서</em&gt;과<em&gt; 생체내에서</em&gt;.

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

production-lentiviral-vectors-for-transducing-cells-from-central

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.8K 조회수.  Washington University School of Medicine. 이 프로토콜에서는 생산, 정제 및 lentiviral 벡터의 적정을 설명합니다. 우리는 기본 교양 뉴런과 astrocytes의 lentiviral 벡터 매개 유전자 전달의 예제를 제공합니다. 우리의 방법은 다른 세포 유형에도 적용될 수 체외에서과 생체내에서.

비디오: Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

연구

신경과학

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

쥐 중추 신경계에서 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 내 전달

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...