저자는이 원고에 대한 데이터를 기여 마이클 추, 빙빙 다이, 그리고 리앙 샤오를 인정하고 싶습니다. 우리는 또한이 연구에 사용 된 시약의 관대 선물 닥터 존 그레이을 인정합니다. PB는 국립 암 센터에서 박사 친교에 의해 지원됩니다. 이 연구는 건강의 국립 연구소 (R01AI68978, P01CA132681 및 RCA170820A), 빌과 멜린다 게이츠 재단, 번역 의학 합동 센터에서 번역 가속 그랜트와 캘리포니아 HIV / AIDS에서 부여에서 부여에서 교부금에 의해 지원되었다 연구 프로그램.

DC-LV 안정적인 생산 세포는 필요한 렌티 바이러스 구성 요소 gagpol, 회전 및 TET 오프 시스템을 포함 GPR 포장 세포주 11에 따라 구성됩니다. 첫째, 레트로 바이러스 전달은 TET 의존 SVGmu 당 단백질을 인코딩 GPRS 포장 세포주를 생성하는 데 사용됩니다. 그런 다음, concatemer 배열 형질이 같은 GFP와 같은 렌티 바이러스 벡터 유전자와 GPRS 세포주를 형질하는 데 사용됩니다. LV-MGFP로 지정이 안정 생산 세포주는, GFP에 대한 DC-LV 백신 생산 능력에 대한 in vitro와 in vivo에서 테스트 할 수 있습니다. 1. Tet의 의존 SVGmu 세포 라인을 생성 플라스미드 PRX-SVGmu는 DC-특정 당 단백질 SVGmu 하류 레트로 바이러스 플라스미드 pRetroX-Tet의 오프 1 (그림 1C)의 TTA-고급 발기인 복제되는 구조이다. D10의 문화 293T 세포 (Dulbecco의 수정 이글의 중간에10 % 소 태아 혈청, 2 mM의 L-글루타민). 독시사이클린 (1 NG / ML) 및 puromycin (2 ㎍ / ㎖)와 D10의 문화 GPR 포장 세포주. 모든 세포는 5 % CO 2 가습 37 ° C 배양기에서 배양된다. <ol><li> 16-18 시간 전에 일시적으로 형질 전환, 플레이트 2 × 10 세포를 형질 전환시 90 % confluency에 접근하는 등 6 cm 조직 문화 접시에있는 D10의 4 ML 6 293T 세포. </li><li> 레트로 바이러스 플라스미드의 형질 : 혼합 100 μL 1.25 M 염화칼슘 용액, 멸균 밀리 Q 물과 같은 플라스미드 : 5 μg PRX-SVGmu, 2.5 μg pGag 폴, 2.5 μg pVSV-G. 최종 부피가 500 μL입니다. 5 ML의 폴리스티렌 왕복 아래 튜브에 500 μL 2X HBS를 (50 MM의 HEPES, 10 mM의 KCl을 12 mM의 포도당, 280 mM의 NaCl을, 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH가 7.05 나 1.5 밀리미터)를 추가합니다. 유리 파스퇴르 피펫으로 적극적으로 버퍼를 버블 링하는 동안 2X HBS 버퍼에 플라스미드 혼합물 적하를 추가합니다. 마일을 추가 한 후xture는 또 다른 30 ​​초 버블 링 계속합니다. 그런 다음, 6 cm 배양 접시에있는 293T 세포에 전체 혼합물을 추가하고, 37 품어 ° C. </li><li> 4 시간 형질 전환 한 후, 조심스럽게 4 ML 예열 D10과 문화 접시에있는 매체를 교체하십시오. </li><li> 감염 스핀 : 형질 전환 후 48 시간을, 수확 SVGmu - 인코딩 0.45 μm의 필터를 통해 상층 액을 통과하여 상층 액에서 레트로 바이러스 입자를. / 물론 2 × 10 4 세포의 24 잘 접시에 판 GPR 포장 세포. 1,050 XG에 90 분, 25 ° C.에 대한 접시에 GPR 포장 셀 (2 ㎖ /도)와 원심 분리기 세포 상층 액을 여과 추가 (2 ㎖ / 잘) 스핀 감염 후 독시사이클린 (1 NG / ML) 신선한 D10에 매체를 변경합니다. </li><li> 포장 세포가 독시사이클린 (1 NG / ML) 및 puromycin (2 NG / ML)와 D10의 형질 72 시간 후 형질은 문화를 확장합니다. </li><li> 48 시간 동안 독시사이클린없이 SVGmu, 문화, 세포의 발현을 확인합니다. 표면 EX를 측정안티 Sindbis 혈청을 사용하여 유동 세포 계측법에 SVGmu의 컴프레션. 이러한 세포는 GPRS 포장 세포주로 지정되어 있습니다. </li></ol> 2. Concatemer 배열 형질에 의해 DC-LV 생산자 세포를 생성 렌티 바이러스 전송 플라스미드 TL20-GFP는 자체 운영을 중지 렌티 바이러스 전달 벡터 플라스미드 독스 - 조절 가능한 바이러스 성 RNA 게놈 발현 시스템 7 TET 사업자 (그림 1C) 11와 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 증강의 교체와 pCL20c-MSCV-GFP를 기반으로 , 12,15. 플라스미드 PGK-BLE은 약한 PGK 프로 2에 의해 구동 블레오 마이신 내성 (BLE) 카세트 테이프입니다. <ol><li> 50에서 제한 효소 SfiI와 다이제스트 20 μg 플라스미드 TL20-GFP ° C. 37 PflMI와 다이제스트 20 μg 플라스미드 PGK-BLE ° C. </li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동하여 DNA 조각을 (PGK-BLE 카세트 1011 BP와 벡터이다 TL20-GFP는 6861 bp의 경우) 정화. </li><li> TL20-GFP 벡터 및 PGK -을 결찰25:1의 몰비 (NEB T4 DNA ligase를)에서 BLE 카세트입니다. 실온에서 밤새 품어. </li><li> 하룻밤 결찰 후 결찰 혼합물 (Qiagen의 DNeasy의 혈액 및 조직 키트)에서 DNA를 정화. 순화 한 DNA의 양을 확인 5 μg 정도입니다. </li><li> 형질 전 16-18 시간, 자랄는 형질 전환시 약 90 %가 될 것 같은 6 cm 조직 문화 접시에 접시에 GPRS 포장 세포. </li><li> 6 cm 조직 문화 접시에 GPRS 포장 세포로 정제 concatemeric DNA 5 μg을 형질하는 단계 1.2에서 설명한 인산 칼슘의 transfection 방법을 사용합니다. 4 시간 형질 전환 한 후, 신중하게 매체를 제거하고 독시 싸이클린 (1 NG / ML) 4 ML 예열 D10로 교체합니다. </li><li> 48 시간 형질 전환 한 후, 독시사이클린 (1 NG / ML) 및 puromycin (2 ㎍ / ㎖)를 D10에 매체를 변경합니다. 문화 매체 zeocin을 (50 ㎍ / ㎖) 첨가하여 형질 전환 클론을 선택합니다. 세포 coloni까지 약 2 주 동안 문화 세포ES는 요리의 하단에 볼 수 있습니다. </li><li> 요리의 하단에있는 세포 식민지 레이블을 지정합니다. 24 잘 조직 배양 접시를 취할 수 우물과 각 well에 2 ㎖ D10 포함 zeocin (50 ㎍ / ㎖), 독시사이클린 (1 NG / ML) 및 puromycin (2 ㎍ / ㎖)을 추가 할 수 있습니다. 형질 세포의 매체를 대기음, 그 분 미만의 식민지의 각각에 트립신 한 방울을 추가합니다. 그런 다음, 같은 식민지에 D10의 하나 또는 그 이상의 방울을 추가합니다. 피펫 하나의 식민지 하나를 선택하고 24 잘 조직 배양 플레이트 별도의 우물에 그들을 전송합니다. </li><li> 문화와 바이러스 생산 능력 평가를위한 D10 포함 zeocin (50 ㎍ / ㎖), 독시사이클린 (1 NG / ML) 및 puromycin (2 ㎍ / ml)에있는 모든 세포 클론을 확장합니다. </li></ol> 3. 각 세포 클론의 바이러스 생산을 평가 <ol><li> 독시사이클린없이 그 자랄 같은 D10에서 6 cm 조직 문화 요리에 4X10 6 세포 주변의 프로듀서 세포와 플레이트를 Trypsinize90 %를 초과합니다. 매일 신선한 예열 D10와 매체를 교체하고 DOX를 제거한 후 역가 분석 72 시간 동안 매체를 수집합니다. </li><li> 0.45 μm의 필터 매체를 필터링하여 바이러스 상층 액을 수확. </li><li> 플레이트 대상 세포 × 10 4 세포 / 물론 1, 96 - 웰 배양 접시에서 음성 대조군으로 DC-SIGN 수용체 (예 : 파생 293T.hDC 서명 또는 마우스 골수 수지상 세포 16)와 293T를 표현. 우물 (물론 100 μL /)로 바이러스 상층 액의 2 배 연속 희석을 추가합니다. 보통 6-8 희석는 GFP 양성 세포가 추가 된 바이러스의 양에 선형 관계에있는 형질하는 범위에 도달하기에 충분합니다. </li><li> 세포를 원심 분리하고 단계 1.4에서 설명한 매체를 교체하십시오. BMDCs 10 % FBS와 GM-CSF (1시 20분 J558L 에어컨 매체)를 RPMI 배지에서 배양되어야한다. </li><li> 유동 세포 계측법 4-6일 후 전달하여 세포를 형질에서 GFP 발현을 측정한다. 렌티 바이러스 vectoGFP 양성 세포와 벡터 금액의 비율이 선형 관계에있을 때 R 역가가 벡터 희석 범위에서 계산됩니다. 이후의 응용 프로그램에 대한 높은 바이러스 생산 세포 클론을 선택합니다. </li></ol> 4. 렌티 바이러스 벡터를 생성하고 집중 <ol><li> 문화 15 cm 조직 문화 요리 생산자 세포주 (LV-MGFP). </li><li> 독시사이클린없이 신선한 D10에서 자랄 때 90 % 이상에서 15 cm 조직 문화 요리에 생산자 세포와 플레이트 세포를 Trypsinize. 매일 신선한 예열 D10과 매체를 변경합니다. </li><li> 피크 바이러스 생산 (같은 사용자에 의해 결정)시, 바이러스 상층 액을 수확하고 0.45 μm의 필터를 사용하여이를 필터링합니다. 90 분 동안 50,000 XG에 파라 필름 (parafilm) 및 원심 분리기, 4 ° C로 밀봉 두꺼운 벽 32.5 ML의 원심 분리기 튜브로 필터링 상층 액을로드합니다. 철저하게 50 μL 또는 응용 프로그램에 따라 PBS 또는 HBSS의 적절한 볼륨 펠렛을 resuspend을. &lt;/ 리&gt; </ol> 5. 생체 내 마우스를 면역 항원 특정 면역 반응을 분석 <ol><li> 4 절에 설명 된대로 높은 titer의 바이러스를 생산하고 있습니다. </li><li> 벡터 서스펜션 (발바닥 당 25 μL)와 노상 루트를 통해 BALB / C 마우스 (구, 여성 6-8주)을 주입. </li><li> 이주 예방 접종 후 비장과 수확 비장 세포를 분리. GFP 에피토프 펩티드와 GFP 특정 CD8의 존재 + 세포 내 사이토 카인 염색법을 사용하여 T 세포를 분석 문화 비장은 앞에서 17 (그림 3B) 설명했다. </li></ol>

<ol>
	<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Kootstra, N. A., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+with+viral+vectors.">Gene therapy with viral vectors.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration.">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genotoxic+potential+of+retroviral+vectors+is+strongly+modulated+by+vector+design+and+integration+site+selection+in+a+mouse+model+of+HSC+gene+therapy.">The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).</li><li>Hu, B., Tai, A., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+delivered+by+lentiviral+vectors+for+cancer+and+infectious+diseases.">Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases.</a> Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).</li><li>Broussau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture.">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).</li><li>Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trans-lentiviral+packaging+cell+line+for+high-titer+conditional+self-inactivating+HIV-1+vectors.">A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+high-titer+HIV-1+vector+production.">Continuous high-titer HIV-1 vector production.</a> Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).</li><li>Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+packaging+cell+line+for+lentivirus+vectors.">A packaging cell line for lentivirus vectors.</a> Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).</li><li>Strang, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+vectors+with+alphavirus+envelope+glycoproteins+produced+from+stable+packaging+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells.</a> Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).</li><li>Throm, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+producer+cell+lines+for+a+SIN+lentiviral+vector+for+SCID-X1+gene+therapy+by+concatemeric+array+transfection.">Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection.</a> Blood. 113, 5104-5110 (2009).</li><li>Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+stable+producer+cells+to+make+high-titer+lentiviral+vectors+for+dendritic+cell-based+vaccination.">Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).</li><li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+dendritic+cells+into+medicine.">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449, 419-426 (2007).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+lentivector+targeting+of+dendritic+cells+for+in+vivo+immunization.">Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization.</a> Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).</li><li>Hanawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+rhesus+repopulating+hematopoietic+stem+cells+using+a+simian+immunodeficiency+virus-based+lentiviral+vector+system.">Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system.</a> Blood. 103, 4062-4069 (2004).</li><li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells.">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).</li><li>Dai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Gag-specific+immunity+induced+by+a+lentivector-based+vaccine+directed+to+dendritic+cells.">HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Grade+Lentiviral+Vectors.">Clinical Grade Lentiviral Vectors.</a> Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).</li><li>Loew, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+PG13-based+packaging+cell+line+for+stable+production+of+clinical-grade+self-inactivating+gamma-retroviral+vectors+using+targeted+integration.">A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration.</a> Gene Ther. 17, 272-280 (2010).</li><li>Gaspar, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+use+of+a+pseudotyped+gammaretroviral+vector.">Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector.</a> Lancet. 364, 2181-2187 (2004).</li><li>Cornetta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+lentivirus+analysis+of+clinical+grade+vector+products.">Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).</li><li>Stewart, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+producer+cell+line+for+the+manufacture+of+a+lentiviral+vector+for+gene+therapy+of+Parkinson's+disease.">A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).</li><li>Coroadinha, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+producer+cell+line+metabolism:+implications+on+viral+productivity.">Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; 저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.</p

여기, 우리는 안정적으로 규제 시스템의 전원 TET 아래의 모든 렌티 바이러스 구성 요소와 형질 293T 세포를 사용하여 렌티 바이러스 벡터의 대량 생산을위한 방법을 설명했다. 지금까지, 렌티 바이러스 벡터를 생산하는 대부분의 프로토콜 (예를 들어, 18 참조) 표준 인산 칼슘 일시적인 형질 전환에 의존하고 있습니다. 이 방법은 임상 척도에 성공했습니다,하지만 안정적인 세포 라인에서 ?...

많은 벡터 시스템은 유전자 전달을 위해 개발되었습니다. 렌티 바이러스에 기반 벡터는 가장 일반적으로 공부 바이러스 시스템 사이에 있었다. 그들이 효율적으로 세포 1 분할 및 비 나누어 모두 형질 도입으로 인해 호스트 게놈에 통합 장기적인 표현을 달성, 대부분의 인간 집단이 낮은 천연 안티 - 벡터 내성을 전시하고, 대한 낮은 가능성을 가질 수 있기 때문에 이러한 벡터 유익하다 insertional 돌연변이 3,4에서 유전 독성. 렌티 바이러스의 생산은 항상 안전에 대한 우려로 채색되어 있습니다. 렌티 바이러스 벡터는 일반적으로 HIV-1, AIDS의 원인균 에이전트에서 파생됩니다. lentivector의 개별 구성 요소 (전송, 봉투, 포장 플라스미드)의 일시적인 형질 실험실 설정에서 유전 물질을 전달하는 일반적이고 유연한 방법입니다. 그러나 임상 응용을위한 확장까지 과도의 transfections는 복잡하고 엄마입니다y를 복제 능력 렌티 5,6의 발전으로 이어질. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 몇몇 안정 포장 및 생산 세포주는 6-11 개발되었다. 이 라인 중 하나 GPR 포장 라인 (11)은 테트라 사이클린에 의해 규제되는 매력적인 장점이 있습니다. 본 논문에서, 우리는 구체적으로 돌기 세포 (DC-정맥 주사) 12를 대상으로하는 자체 운영을 중지시키지 렌티 바이러스 벡터를 생산하는이 시스템을 적용하는 방법을 보여줍니다. 돌기 세포 (DCS)는 면역 시스템의 가장 강력한 항원 제시 세포입니다. 그들이 직접 프로그램을 시작하고, 종양 특이 면역 반응하기 13 규제 때문에 그들은 암 백신 개발에 큰 관심의 대상이되고있다. DC의 펩타이드 또는 DNA 백신보다 더 강력한 항암 면역 반응을 유도 할 수있는 잠재력을 포함하는 예방 접종 프로토콜을 통합. 최근에, 우리는 렌티 바이러스 벡터를 개발 한 specifically를 수정 sindbis 바이러스 당 단백질, SVGmu 14을 통해 수지상 세포를 대상으로합니다. 그들은 돌기 세포에 높은 특이성을 보여 비특이적, VSVg-pseudotyped 벡터보다 강한 면역 반응을 생성하는 이러한 벡터는 고유합니다. 여기, 우리는이 DC-타겟 렌티 바이러스 벡터의 대량 생산을위한 방법을보고합니다. 우리는이 DC-LV를이 수지상 세포를 감염하고 강력한 CD8 + T 세포의 면역 반응을 생성 할 수 보여줍니다. 동물과 관련된 모든 절차는 USC Intitutional 동물 관리 및 사용위원회의 승인에 따라 인도적으로 수행되었다. 생체 및 임상 실험을 수행하기 위해서는, 그것은 높은 역가에 바이러스를 생성 할 수 세포 라인을 만드는 것이 중요합니다. 설명대로 전달과 형질 전환 단계를 수행하면 이러한 복제를 생성하는 기회를 극대화하는 것입니다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Clontech Laboratories, Inc.</td>
			<td>631311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R250-01</td>
			<td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells

렌티 바이러스 벡터 (정맥 주사)는 세포의 여러 유형에 유전 물질을 전달하는 강력한 수단입니다. 정맥 주사의 대량 생산이 HIV-1 유래 벡터와 관련된 안전 문제 때문에하는 것은 도전이다. 본 논문에서, 우리는 자기 불활 정맥 주사의 높은 역가를 생산하는 방법을보고합니다. 우리는 retrovirally 돌기 세포 특정 당 단백질, SVGmu 포함한 모든 바이러스 구성 요소를 표현할 수있는 세포주, GPRS를, 생성하는 TET 오프 안정적인 생산 세포주 GPR를​​ 형질 도입. 다음, 우리는 LV 전송 플라스미드 인코딩에게 선택 마커와 함께 리포터 유전자 GFP를 형질을 concatemeric DNA의 형질 전환을 사용합니다. 결과 클론 중 일부는 우리가 일시적인 형질로 얻을 수있는 것보다 10 배 더 큰 역가에 LV를 생성 할 수 있습니다. 또한, 이러한 바이러스를 효율적으로 체외에서 수지상 세포를 형질 도입하고 기자 항원에 강한 T 세포 면역 반응을 생성합니다. 이 방법은 좋은 옵션을 구경 할 수 있습니다R 암 또는 감염성 질환의 임상 연구에 대한 강력한 LV-기반의 백신을 생산.

이 방법에서 설명하는 안정적인 세포 라인은 특히 돌기 세포를 대상으로하는 렌티 바이러스 벡터의 대량 생성 할 수 있습니다. 그림 1B에서 보는 바와 같이, 각각의 클론의 분리 품질 12 변화의 안정적인 세포 라인을 굴복. 테스트 26 클론 중 8 일시적인 형질 전환에 의해 생산 SVG-pseudotyped 렌티 바이러스 벡터에 대한 일반적인 벤치 마크 ML (TU / ML), 당보다 큰 10 6 전달 단?...

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A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.4K 조회수.  University of Southern California, Los Angeles. 여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

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Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...