뒤셀도르프 (Düsseldorf)의 대학 의료 학부 Forschungskommission의 교부금으로 지원하는 CKVB에,이 작품은 CK와 JPH, DFG (GRK1033 고 1679/3-1)에 신경 세포 - ERANET 발견 (BMBF 01EW1003)에 의해 재정 지원되었다.

1. Aggresome 기증자 세포의 준비 : Monomeric 레드 형광 단백질 (mRFP) 또는 향상된 그린 형광 단백질 (eGFP) 태그 인간 전체 길이 (FL) DISC1의 Transfection <ol><li> 종자 1.5 X 10 6 / 10cm 접시 인간의 neuroblastoma NLF (NLF, 필라델피아의 어린이 병원, 필라델피아, PA) 열 10cm 요리의 세포와 하룻밤 성장합니다. NLF 전지는 10 % 보충 RPMI-1640 배지에서 배양 아르 FBS, 페니실린 / Strepomycin, L-글루타민. 다음 날, 세포는 70-80% confluency에 있어야합니다. </li><li> Transiently 15 μg 플라스미드 DNA와 Metafectene transfection 시약 (Biontex, Martinsried, 독일)가 각각 10cm의 접시를 transfect. 간단히 말하자면, 10cm 요리에 대해, 15 μg 플라스미드 DNA와 30 μl Metafectene는, 750 μl Opti-가상에 추가 혼합 20 분 동안 RT에서 incubated되었습니다. 5 요리 pcDNA3.1 mRFP / eGFP-플라스미드 혼자있는 eGFP 태그 인간 (FL) DISC1 5 요리와 transfected했다. </li></ol> 2. AggresomeTransfected 기증자 세포의 정화 여기에 설명 된 프로토콜은 뇌 조직의 13 대형 집계 및 aggresomes 14 분리 할 수있는 프로토콜에서 Lewy - 몸을 정화 할 수있는 방법의 조합입니다. 이미 기존 방법은 세제의 사용, 세포 invasiveness의 assays의 응용 프로그램에 대한 세제없는 단백질의 고립을 기반으로하기 때문에 중요합니다. <ol><li> 48 시간 transfection 후, eGFP 및 mRFP/eGFP-DISC1의 표현을 모니터링하고 형광 현미경 (그림 1)에서 aggresomes의 형성을 확인합니다. </li><li> 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 추가 (로슈, 인디애나 폴리스, IN)와 Precellys24 균질 (Bertin 기술, 프랑스)를 사용하여 셀을 방해, PBS 산도 7.4, 400 μl PBS 각과 흠집으로 세포를 씻으십시오. 간단히, 2 ML의 용해 튜브에 1 ML 세포 현탁액을 추가하고 열 세라믹 구슬을 추가합니다. 3 개 60 초 펄스로 세포를 Lyse. 프로세스의 기계적 힘은 할 수있다37 위의 샘플 내에서 온도를 증가 ° C 있으므로주의가 용해 절차 후 얼음에 샘플을 냉각하기 위해주의해야한다. </li><li> 얼음에 세포를 시원하고 37 60 분 10 MM MgCl 2, 40 U / ML DNase 및 배양을 추가 ° C </li><li> 80 % 솔루션, 50 %, PBS의 pH를 7.4 (10 ML 각)에 20 %의 자당 (w / V)를 준비합니다. </li><li> 50 % 20 % 다음, 2 ML 80 % 자당로 시작, 15 ML 팔콘 튜브에 자당 기울기를 준비합니다. 천천히 기울기를 넣어 이미 부어 레이어를 방해하지 않도록주의하십시오. 4 번 레이어 1,000 XG에서 15 분의 기울기와 원심 분리기 위의 소화 lysate를 ° C. </li><li> 조심스럽게 PBS 산도 7.4의 5 권과 피펫과 혼합으로 50-80%의 자당 층 사이의 계면를 수집합니다. 4 ° C.에서 1,000 XG 15 분 동안 원심 분리기 두 개의 추가 번 세척 반복합니다. 이 계면에서 aggresomes는 형광 있으며, UV 빛 아래에서 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 표면에 뜨는을 취소하고250-500 μl PBS의 산도를 7.4에서 펠렛을 resuspend. 이 펠렛은 정화 aggresomes (그림 2)가 포함되어 있습니다. </li></ol> 3. mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes로받는 SH-SY5Y 세포 치료 <ol><li> 종자 5 X 10 4받는 SH-SY5Y 인간 neuroblastoma 세포 constitutively 24 잘 플레이트의 각 잘에 멸균 유리 coverslips에 GFP-DISC1 (598-854)를 표현. SH-SY5Y 세포는 페니실린 / 스트렙토 마이신, 비 필수 아미노산 (NEAA)와 10 % FBS와 보충 DMEM/F-12 매체에 배양되어 있습니다. </li><li> 24 시간 후, 각도에 10 μl를 추가하고 48-72 시간에 품다. </li><li> PBS 산도 7.4으로 세포에게 3 x를 깨끗이 씻어 5 분에 0.04 % Trypan 파랑과 세포 형광을 해소. </li><li> 얼음에 10 분 동안 PBS 산도 7.4의 4% PFA으로 세포를 수정, DAPI 장착 매체 (Invitrogen, USA)와 골드를 연장으로 멸균 H 2 O로 한 번 씻고, 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. </li><li> / 이해를 확인Z-스택 이미지에받는 사람 세포에 의해 표현 모집 단백질과 colocalization로 exogenously 적용 aggresomes의 침략. </li></ol> 그러나 외인성 단백질의 이해 / 침략은 본질적으로 숙주 세포 단백질 모집과 병렬로 감지되지 않을 수 있습니다. 이 예에서는 mRFP는 태그 DISC1 aggresomes 모집 용해 GFP 태그 DISC1 (598-854) 숙주 세포 (그림 3 참조)에 의해 표현 단백질을. 사진은 Zeiss LSM 510 공 촛점 또는 Zeiss Axiovision Apotome2 현미경에 촬영 된 것입니다. 4. 재조합 DISC1의 세대 (598-785) 이전 발행물에서 우리는 자기 협회 도메인의 존재에 따라 자기 상호 작용에 다양한 DISC1 단백질 조각의 능력을 분석했다. 모든 단백질 중에는 인간의 DISC1 (598-785)는 (그림 4) 강한 multimerization 성향에게 4 표시 테스트 조각. 따라서, 인간 DISC1 (598-785)가 (없음 pET15b으로 복제 된vagen, 매디슨, 위스콘신)은 E. 표현 6 히스티딘 태그 N-터미널을 포함 대장균 BL21-(lDE3)이 로제 (Novagen, 미국), 그리고 4에 설명 된대로 8 몰 / 리터 요소의 denaturing 조건 하에서 정화. 즉, 프로토콜은 아래 설명되어 있습니다. <ol><li> BL21-(IDE3) 로제 E. 대장균은 OD 600 5mM 5 MM-아르기닌-HCL, MGSO4, 100 μg / ML carbencillin, 35 μg / ML chloramphenicol을 포함하는 2 X 500 ML 2YT에서 재배되었습니다 0.6-0.8와 DISC1 (598-785) 표현식은 유도 된 1 ㎜의 IPTG를 갖추고 있습니다. </li><li> DISC1 (598-785)가 37 ° C에서 4 시간에 표현 된, 그 표현은 원심 분리하여 박테리아를 수확하여 종료되었습니다. </li><li> 박테리아 펠렛은 50 ML TE 버퍼 (50 MM 트리스 - HCL 산도 8.0, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))와 2 MM PMSF, 1 % TX-100, 250 μg / ML 라이소자임, 20 MM MgCl 2, 400 U/50 ML에 resuspended되었습니다 완전한 용해을 보장하기 위해 DNase I.는, 반응은 부드러운 저어와 RT 30 분 동안 incubated되었습니다. </li><li> β-mercapt 10 MM을 추가또 다른 30 ​​분에 oethanol (ME), 500 MM NaCl 및 품다. </li><li> 4 ° C. 30 분에 20.000 g에 세균 포함기구를 스핀 다운 </li><li> Resuspend 펠릿 50mM 트리스 산도 8.0, 5 MM 이미 다졸, 500 MM NaCl, 8 M의 요소와 10 MM β-ME를, 4시 30 분에 20.000 g에서 원심 분리하여 오염 물질을 제거 ° C.를 포함하는 50 ML 추출 버퍼에 </li><li> 추출 버퍼와 니켈 NTA 아가로 오스 행렬을 씻으십시오. RT에서 2 시간에 니켈 NTA 매트릭스와 resuspended, precleared 단백질 추출물을 품다. </li><li> 12 MM 이미 다졸을 포함하는 추출 버퍼와 니켈 NTA 행렬을 씻으십시오. </li><li> 50 ㎜ 트리스, 500 MM NaCl, 300 MM 이미 다졸, 8 M 우레아, 1 MM PMSF, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 β-ME 10 MM를 포함하는 15 ML의 용출 버퍼와 함께 천천히 단백질을 Elute. </li><li> β-ME 10 MM를 포함하는 PBS 산도 7.4에 stepwise 단백질을 Dialyze. </li></ol> 1 L 세균 시작 문화에서 그 재조합 DISC1 (598-785) 제자의 50 밀리그램까지 분리 할 수​​ 있습니다EIN. α-synuclein의 refolding α-synuclein의 경우, 재조합 단백질 500 μg (시그마 - 알드리치, USA)와 실험은 1 MG / ML의 농도에 PBS에 용해되었다. oligomers를 구하려면 refolding이 37 박을 수행 한 ° C로 이전 간행물 10에 설명되어 있습니다. 5. DyLight594와 재조합 DISC1 (598-785)의 라벨 <ol><li> 이전 다음 라벨 프로세스 DISC1 (598-785)는 단백질은 β-ME에서 해방 될 수있다. 따라서 단백질은 1:2,000의 희석에 PBS 산도 7.4-3 시간을 dialyzed 있습니다. </li><li> 라벨 1 제조업체의 지침에 따라 DyLight 594 maleimide (열 과학, USA)와 MG DISC1 (598-785). 즉, PBS 산도 7.4에서 1 MG / ML 단백질을 분해 및 무료 thiol 그룹을 복구 할 5 밀리미터 TCEP를 추가합니다. RT에서 2 시간의 반응과 배양에 DMF 용해 염료의 20 μl를 추가합니다. </li><li> PBS 산도에 단백질 3 개를 Dialyze2 1:2000의 비율로 7.4 각을 시간. </li></ol> 추가로 표시된 단백질의 순도를 높이기 위해 그의 6 태그 니켈 NTA 열이 수행에 친 화성 - 정화 기반. <ol start="4"><li> 10 ML PBS 산도 7.4 1 개 ML 니켈 NTA 매트릭스 (Qiagen, 독일)을 씻으십시오. </li><li> 열에 표시, dialyzed 단백질을 적용하고 천천히 열을 통해 실행할 수 있습니다. </li><li> 3 개 20 ML PBS의 산도를 7.4으로 단백질을 씻어 </li><li> eluate 볼륨을 줄이기 위해 니켈 NTA 컬럼에 색 대역을 모니터링하면서 PBS 산도 7.4, 500 MM 이미 다졸 dropwise과 단백질을 Elute. </li><li> 2 시간 각 1:2000의 희석 10 MM NaPi 산도 7.4에 eluate 3 개를 Dialyze. </li><li> eluate, 액체 질소에 5 × 100 μl 샘플 및 스냅 동결에 나누어지는을 필터링하는 필터 살균 0.45 μm의 주사기를 사용합니다. 각 100 μl 나누어지는 1 μg / ML - 단백질의 총 금액은 0.5이어야합니다. </li></ol> 선택 concentration 단계 <ol start="10"><li> stereotactical 쥐 주사를 들어, 단백질은 속도 VAC (Eppendorf 집중 장치 5301)에 10 배 농축되었다. 최종 버퍼 상태는 100 밀리미터 NaPi했다. </li></ol> α-synuclein의 라벨링 재조합 α-synuclein의 라벨 및 정화 (니켈 NTA 열) DISC1 (598-785)에 병렬로 수행되었다. 총 출발 물질은 500 μg 대신 DISC1 (598-785) 1 밀리그램했다. 6. 레이블 재조합 DISC1 (598-785) 단백질과받는 SH-SY5Y 세포 치료 <ol><li> 종자 5x10 4받는 SH-SY5Y 인간 neuroblastoma 세포는 constitutively 24 잘 플레이트의 각 잘에 멸균 유리 coverslips에 GFP-DISC1 (598-854)를 표현. </li><li> 5-10 μg / ML의 농도에서 세포 배양 매체에 표시된 단백질을 추가하고 48-72 시간에 품다. </li><li> PBS 산도 7.4으로 세포에게 3 x를 깨끗이 씻어 extrac을 해소5 분에 0.04 % Trypan 파랑과 ellular 형광. </li><li> 얼음에 10 분 동안 PBS 산도 7.4의 4% PFA으로 세포를 수정, DAPI 장착 매체 (Invitrogen, USA)와 골드를 연장으로 멸균 H 2 O로 한 번 씻고, 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. </li><li> 레이저 공 촛점 현미경을 스캔에 의해 생성 된 Z-스택 이미지에받는 사람 세포에 의해 표현 모집 단백질과 colocalization하여 재조합 단백질을 적용 exogenously의 이해 / 침략을 확인합니다. 그러나 내생 단백질 모집은 기본적으로 숙주 세포 단백질의 침략과 병렬로 감지되지 않을 수도 있습니다, Z-스택 이미지가 여전히 단백질의 침해 자연을 확인할 수 있습니다. </li></ol> 우리의 예를 들어 REC합니다. DISC1 (598-785) * 최소 부분 모집에 용해 DISC1 (598-854) 숙주 세포 (그림 5A를 참조)에 의해 표현 단백질을 GFP 태그. 재조합 α-synuclein의 침략 있지만 모집합니다 (그림 5B) 표시됩니다. 사진이 촬영 된Zeiss LSM 510의 공 촛점 또는 Zeiss Axiovision Apotome2 현미경. 집중의 주입으로도 동물의 재관류 후 감지 할 수있는 주사 사이트 주변의 단백질의 확산에 mPFC 결과에 DISC1 (598-785) *로 표시 (2.5 μg / μl의 ca. 4 μl), rhodamine의 filterset와 PBS 산도 7.4의 4퍼센트 PFA. 이 예에서는 DISC1 (598-785)은 뉴런의 고유 한 숫자에 의해 촬영되어 있으며 Z-스택 영상 (그림 6)에 모니터링 할 수 있습니다. 일반적으로 사람들이 여기서 사용하여 다른 단백질의 주입이 반드시 셀 침략으로 이어질하지 않습니다. 침공 이벤트가 단백질의 특성에 근본적으로 의존 그럼에도 불구하고 깨끗한 정화는 추가 분석을 위해 필수입니다. 7. 대표 결과 NLF 세포에서 재조합 FL DISC1-eGFP 정화 구성된 Aggresomes는받는 SH-SY5Y CE를 침공낮은 효율의 재편 (약 0.3 % 5) 등의 공 촛점 현미경 (그림 3)과 colocalization 볼. 이전에보고 된 바와 같이, DISC1 (598-785)는 표현과 E.에서 정화 대장균은 multimers 4 긍정적 인 제어 (그림 5B)로 병렬로 사용 된 α-synuclein 그와 유사한 약 20 % 5 (그림 5A)의 효율성을 동일하게 휴대 침습적 있었다 형성했다. 표시 재조합 DISC1 (598-785)는 표현과 E.에서 정화 multimeric 단백질이 stereotactically 쥐의 내측 전두엽 피질 (; Pum, 베이더, 휴스턴, Korth, 게시되지 않은 그림 6)에 주입했을 때 대장균은 세포 침습적 생체의 뉴런을했다. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. NLF의 neuroblastoma 세포는 transiently FP-DISC1 (빨간색)를 표현. 레드 형광 aggresomes는 dete 수 있습니다세포 내에서 cted. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 자당 기울기에서 정화 한 후 DISC1 aggresomes을 mRFP 태그 정화. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 침략 aggresomes의 형광등 그림. mRFP 태그 flDISC1 aggresomes는 SH-SY5Y neuroblastoma 세포와 정화와 incubated되었습니다 overexpressing 용해 GFP 태그 DISC1 (598-854)을. 분류 aggresomes의 이해는 레이저 스캔 현미경 (Zeiss LSM 510)에 Z-스택 영상에 의해 모니터링된다. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. REC의 SEC - 프로필입니다. S704과 C704 단일 염기 polymorphisms (SNP)을 포함 DISC1 (598-785). 두 변종은 주문 oligomerization의 중단과 높은 분자량의 복수의 형성을 보여imers (빨간색 화살표). 이 사진은 Leliveld 외의 기사., 생화학 2009 수정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 침해 DyLight - 라벨 재조합 DISC1 (598-785)의 형광 Z-스택 사진. 수용성 GFP-DISC1 (598-854)를 표현 SH-SY5Y의 neuroblastoma 세포가 표시와 incubated되었습니다, 5 μg / ML의 농도에서 재조합 단백질. (A) 레드 집계는 REC의 침략을 보여줍니다. DISC1 (598-785) 단백질과 노란색 점을 합산로 용해 GFP-DISC1 (598-854)의 영입을 나타냅니다. (B) 재조합 α-synuclein (빨간색)은 20 %의 주파수로 채용하지 않고 세포를 침공. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="그림 6" /> 의 그림 6. Immunofluorescent 사진주입 라벨, 재조합 DISC1 (598-785) 단백질. Z-스택 영상은 REC의 존재를 확인합니다. neuronal 핵 (NeuN, 녹색)에 대한 항체 물들 쥐 대뇌 피질의 뉴런에서 DISC1 (598-785) 단백질.

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이 연구에서 우리는 transfected neuroblastoma 세포 라인, 준비와 재조합 DISC1 단백질 종의 라벨 및 체외 및 생체 내받는 세포의 세포 침공 실험에서의 응용 프로그램에서 mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes의 정화에 대해 설명합니다. 기본 mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes의 정화는 Lewy 몸과 같은 구조와 큰 합산 13, 14을 분리 프로토콜에서 개발하지만, 세제의 사용을 방지하고, 발생할 수있는 세포 침략 허위 긍정적의 위험을 최소화하기 위해 바뀌 었습니다 세제 - 용이 막 침투로 인해. 한 가지 가능한 미래의 개선은 더욱 aggresomes에서 완전히 별도의 남아있는 세포막과 세포 골격에 sonication하여 aggresomes의 순도를 증가시키기에 있습니다. 증가 전반적인 순도함으로써, 대형 aggresomes mA에 대해 기록 된 총 침공 이벤트의 수y는 5 증가. Google에서 제안하는 3 상 자당의 제한된 정의가 다른 단백질 종의 aggresomes 충분한인지 여부를 테스트 할 수 있으며, 이런 의미에서 프로토콜 여기서 설명은 개별 최적화를위한 출발점으로 간주해야합니다. 정화의 aggresomes은 자당의 흔적 크게 전체 생산량을 축소하지 않았습니다을 제거하기 위해 손, 추가 세척 단계 (세제없이)에 매우 강력한 것으로 판명. 이전 발행물에서 우리는 DISC1의 올리고머 조립은 C-말단 4 (그림 4)에서 서로 다른 multimerization 도메인에 의존 것을 설명했다. 우리는 E.의 재조합 용해 표현이 조각을 선택 대장균 및 후속 니켈 NTA 정화. 그 multimerization를 모니터링하고 α-synuclein과 같은 설명 셀 침습적 단백질과의 세포 invasiveness을 비교하기 위해 형광 염료 DyLight594와 DISC1 (598-785)를 표시하고, 비교하여똑같이 표시 α-synuclein의와 세포 invasiveness. 재조합 DISC1 조각의 세포 invasiveness은 크게 기본, 전체 길이 DISC1 aggresomes을 가능성은 작은 크기와 훨씬 더 높은 순도로 인한의에 비해 증가했다. 다시 말하지만, 순도는 세포 invasiveness에 결정적인 역할을 보인다. 우리의 예에서 침입 aggresomes는 recombinantly 가용성, 즉 세포 분산 형태로 표현 된 대상 셀 라인의 가용성 homologue 단백질을 모집. 이 Z-스택 영상을 통해받는 셀 범위 안에서 침해 aggresomes 및 재조합 단백질의 colocalization 수 있기 때문에받는 사람 세포주의 형광 단백질 (예 : GFP 또는 RFP)의 표정은 장점이 될 것이다. 셀 침습적 DISC1의 aggresomes과 multimeric 조각 표현과 E.에서 정화 대장균은 DISC1, DI에 관한 단백질 conformational 질병의 정의 기능 될 수SC1opathies 15. 촬영 방해가 : 자당 기울기 정화 후 낮은 aggresome 수율 : 이 프로토콜에 소개 자당 기울기는 eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes 잘 작동합니다. 다른 단백질로 구성된 Aggresomes은 변수 차원이 될 수 있습니다 따라서 자당 농도는 다른 사용자가 최적화되어야합니다. 재조합 단백질의 부족 정화 : 재조합 단백질의 정제 과정에서 세균 오염 물질은 또한 프로토콜의 이후 단계에 표시됩니다. contaminations을 방지하려면 SDS-PAGE에서 단백질을 실행하고 재조합 단백질은 Coomassie - 블루와 얼룩의 순수한 이상 95% 수 있는지 확인하십시오. 최고의 품질과 수율을 보장하기 위해 프로토콜은 각각의 단백질에 최적화되어야한다. 낮은 라벨 EF재조합 단백질의 ficiency : 무료 SH-그룹을 포함하는 모든 contaminations은 단백질의 효율적인 라벨이 감소합니다. 따라서 광범위한 투석 및 니켈 NTA 기반의 정화는 필수입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> 매체는 숙주 세포 라인에 따라 달라집니다. 최적받는 셀 라인은 사용자에 의해 결정됩니다. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> 매체는받는 사람 세포 라인에 따라 달라집니다. 최적받는 셀 라인은 사용자에 의해 결정됩니다. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> 다른 transfection의 시약은 잘 작동 할 수 있지만, 우리의 프로토콜 테스트되지 않았습니다. </td></tr><tr><td> 니켈 NTA 아가로 오스 </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ TD&gt; <td> 실험 Qiagen에서 Ni_NTA 아가로 오스 짓을 한 다른 공급 업체뿐만 아니라 작동합니다. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 로슈 </td><td> 04716728001 </td><td> aggresomes 정화의 과정에서 RNase 무료 DNase 필요가 없습니다. </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-가상 </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> 혈청 무료 매체뿐만 아니라 작동 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> SH-SY5Y과 NLF 매체에 보완 </td></tr><tr><td> 비 필수 - 아미노 산 (NEAA) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M7145 </td><td> SH-SY5Y 매체에 대한 보완 </td></tr><tr><td> Trypan 파랑 0.4 % </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T8154 </td><td> 독성 시약 </td></tr><tr><td> DyLight 594 마leimide </td><td> 열 피셔 과학 </td><td> 46,608 </td><td> 안정적인 thioether 채권을 형성 시스테인 반응을 염색 감소. 다른 색상 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> DAPI와 골드을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> 이 antifade 액체 mountant는 우리 손에 우수한 결과를 주었다. </td></tr><tr><td> 프로테아제 억제제 칵테일 </td><td> 로슈 </td><td> 11873580001 </td><td> 100X 솔루션 500 μl H 2 O에 1 표를 분해. </td></tr><tr><td> 합성 - synuclein </td><td> 시그마 </td><td> S7820 </td><td> Refold 같은 텍스트에 설명되어 있습니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 특정 시약 표. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin 기술 </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> 우리는 다른 기계 homoge을 테스트하지 않은이 이외의 다른 nizers. 다른 세제 무료로 균질화 방법은 잘 작동 수도 있지만,이 프로토콜에 대한 테스트 된 것은 아닙니다. </td></tr><tr><td> 5301 농축기 (speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> 단백질은 집중되어야하는 경우에만 필요합니다. </td></tr><tr><td> LSM 510 및 Axiovision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> 제조업체의 카탈로그를 참조하십시오 </td><td> 두 현미경은 Z-스택 이미징을 수행 할 수있는 능력을 숨기 죠. 이 침공 이벤트의 견고하고 심각한 평가 필수입니다. </td></tr><tr><td> 세포 배양 플라스틱 재료 </td><td> Nunc </td><td> 10cm 요리 # 172958, 24 잘 접시 # 142475 </td><td> 다른 플라스틱 재료의 사용은 재조합 단백질 또는 aggresomes 및 플라스틱 표면의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에 설명 된 이외의 자료를 테스트하지 않았습니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 특정 재료와 장비의 표. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 수 </td><td> 버퍼 이름 </td><td> 내용 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 박테리아 성장 매체 </td><td> 16g / L Bacto Tryptone, MGSO4 5mM 10g / L Bacto 효모 추출물, 5g / L NaCl, 5 MM-아르기닌-HCL, 100 μg / ML carbencillin, 35 μg / ML chloramphenicol </td><td> OD 600 박테리아의 성장 : 0.6-0.8 1 밀리미터 IPTG와 표현을 유도. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 세균 resuspension 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL 산도 8.0, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2 MM PMSF, 1 % TX-100, 250 μg / ML 라이소자임, 20 MM MgCl 2, 400 U/50 ML DNase I </td><td> ove 한 L에서 세균 펠릿을 Resupend50 ML의 resuspension 버퍼에 rnight 문화. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> 단백질 추출 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 산도 8.0, 5 MM 이미 다졸, 500 MM NaCl, 8 M의 요소와 10 MM B-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> 니켈 NTA 컬럼 세척 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 산도 8.0, 5 MM 이미 다졸, 500 MM NaCl, 8 M의 요소와 10 MM B-ME, 12 MM 이미 다졸 </td><td> 12 MM 이미 다졸과 수정 추출 버퍼가 추가되었습니다. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> 니켈 NTA 컬럼 용출 버퍼 </td><td> 50 ㎜ 트리스, 500 MM NaCl, 300 MM 이미 다졸, 8 M 우레아, 1 MM PMSF, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM B-ME </td><td> 용출 버퍼는 나중에 dialyzed되어 10 MM B-ME가 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8g / L NaCl, 0.2 g / L KCl, 1.44 g / L 오세영 2 HPO 4, 0.24 g / L KH 2 PO 4, pH를 7.4로 조정 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> 버퍼를 라벨 </td><td> PBS는 5 밀리미터 TCEP를 포함하는 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 조리법 표. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

단백질 집합이 알츠하이머 병 (Aβ, 타우) neurodegenerative 질병에, 예를 들어, 같은 만성, 퇴행성 뇌 조건의 일반적인 특징으로 볼 수 있으며, 파킨슨 병 (α-synuclein), 헌팅턴 병 (polyglutamine, huntingtin) 등. 단백질 집합 방해 proteostasis으로 인해 발생하는 것으로 생각되며, 발생 및 misfolded 단백질의 저하 사이의 불균형을 즉. 노트의 같은 단백질은 가족 형태의 희귀 한 변종의 돌연변이 아르 이러한 질병의 산발적 인 형태로 집계 찾아 볼 수 있습니다. 정신 분열증은 많은 경우에 영구와 돌이킬인지 적자와 함께가는 만성 진보적 인 뇌 상태입니다. 후보 유전자 접근 방식에서 우리는 중단 인 정신 분열증 1 (DISC1), 만성 정신 질환 1, 2 결합과 스코틀랜드의 가정에서 복제 유전자가 brai에 불용성 응집체로 발견 될 수 있는지의 여부도 조사N 정신 분열증 3 산발적 가지 경우. SMRI의 CC를 사용하여, 우리는 CMD과 가지 경우 약 20 %에서 발견되지만 생화학 분류 한 후 neurodegenerative 질병과 일반 컨트롤이나 환자가 sarkosyl - 불용성 DISC1의 immunoreactivity. 체외의 후속 연구는 DISC1의 집계 성향은 질병 관련 다형성 S704C 4에 의해 영향을 것을 발표하고, 체외에서 생성 된 DISC1 aggresomes는 Aβ 6 표시 된 것과 유사한 5, 타우 7-9, α 세포 침습적 있다는 - synuclein 10, polyglutamine 11, 또는 SOD1 집계 12. 이러한 연구 결과는 우리 CMD와 가지 경우 적어도 일부, 통합 DISC1을 가진 단백질 conformational 장애 될 수 있다는 제안하라는 메시지가 나타납니다. 여기에 우리가 포유류의 세포에서 DISC1 aggresomes를 생성하는 방법을 설명, 자당 기울기에 올려 정화 및 세포 invasiveness의 studi 위해를 사용하는에스. 마찬가지로, 우리는 독점적으로 multimeric C-터미널 DISC1 조각, 라벨을 생성하고 세포 invasiveness 연구를 위해 정화 방법에 대해 설명합니다. DISC1의 재조합 multimers 사용하여 우리는 비슷하게 표시 합성 α-synuclein 조각에 관해서는 유사한 세포 invasiveness를 얻을 수 있습니다. 우리는 또한 stereotactically받는 동물의 뇌에 주입 할 때이 조각은 생체에서 촬영되어 표시됩니다.

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Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

배양 한 세포에서 세포, 세포질 전체 길이 DISC1 단백질 aggresomes와의 표시, multimeric 재조합 DISC1 단백질 조각의 생성, 정화 및 세포 침공<em&gt; E. 대장균</em&gt;에 설명되어 있습니다. 세포 invasiveness은 세포 배양과 뉴런에받는 사람 세포에 표시됩니다<em&gt; 생체 내</em&gt; stereotactical 뇌 접종 후.

셀 침습적 DISC1 단백질 종의 생성, 정제 및 특성

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

Research

JoVE Journal

Biology

13.7K 조회수.  Medical School Düsseldorf, Germany. 배양 한 세포에서 세포, 세포질 전체 길이 DISC1 단백질 aggresomes와의 표시, multimeric 재조합 DISC1 단백질 조각의 생성, 정화 및 세포 침공 E. 대장균에 설명되어 있습니다. 세포 invasiveness은 세포 배양과 뉴런에받는 사람 세포에 표시됩니다 생체 내 stereotactical 뇌 접종 후.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

엘루시브 작은 포유류의 고품질 DNA를 얻기 위해 비침 투 헤어 샘플링 기법

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

An automated method for identifying suitable hydrophobic interaction chromatography (HIC) media to be used in the process of protein purification is presented. The method utilizes a medium-pressure liquid chromatography system including automated buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection.

단백질 정제에서 사용하기 위해 자동화된 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 칼럼 선정

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

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A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

특정 엔도와 exoglycosidases를 사용하여 단백질 글리코 실화의 식별 및 특성

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

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Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.