이 작품은 국립 보건원 (AI050677, HD-051998, 그리고 GM103433), 말콤 Feist 심장 혈관 연구 교제, 그리고 미국 심장 협회 predoctoral 휄로 십 (10PRE4200007)에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. 젤리 - 코팅 Coverslips의 작성 <ol><li> 멸균 플라스틱 100mm 요리 (ES)의 장소 산 세척 유리 coverslips (직경 15mm). 요리 당 8-9 coverslips을 놓고 서로가 서로를 만지거나 요리의 측면 있지 않은지 확인 ... </li></ol> 참고 : Coverslips, 바늘과 핀셋이 가능한 오염 미생물뿐만 아니라, 운동성 등의 세포 기능에 영향을 미칠 것입니다 endotoxins을 제거 할 무균 있어야합니다. <ol start="2"><li> 젤라틴 가루를 무게 0.5 g/300 ML의 최종 농도와 젤라틴 솔루션을 만들기 위해 탈 이온수의 분말을 resuspend. 다음, 젤라틴 솔루션은 autoclaved해야합니다. </li><li> 피펫 2-3 각 coverslip에 젤라틴 (~ 100-150 ML)로 떨어. </li></ol> 참고 : 젤라틴은 접시를 터치하거나 요리에서 coverslips을 제거 할 수 없습니다 허용하지 않도록주의하십시오. <ol start="4"&gt; <li> 10 분 동안 90 ° C에서 오븐에 100mm 요리에 젤라틴 코팅 coverslips을 구워. </li><li> 부드러운 pipetting하여 초과 젤라틴을 제거합니다. </li><li> 45 분에 70에서 오븐에 100mm 요리 ° C에서 coverslips를 말린다. </li><li> 일단 건조, 살균, 독소 - 무료 바늘과 핀셋을 (needle을 부드럽게 제거 부드럽게 핀셋에 액세스 할 수 있도록 coverslip을 자극하는 데 사용)를 사용하여 100mm 요리에서 coverslips를 제거합니다. </li><li> 24 잘 접시 별도의 우물로 개별 젤라틴 코팅 coverslips를 놓습니다. </li></ol> 2. 콜로이드 금 코팅 Coverslips의 작성 <ol><li> chloroauric 산 (tetrachloroauric 산 trihydrate, HAuCl 4 · 3H 2 O)의 적절한 양을 무게 후 최종 14.5 MM 솔루션을 (독성) 준비하기 위해 무균 탈 이온수에 resuspend. 8-9 coverslips 당 솔루션의 1.5 ML를 준비합니다. </li></ol> 경고 : Chloroauric 산 반장님입니다한 이름 삼킨 경우는 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 원인과 알레르기 피부 반응을 일으킬 수 있습니다. 독성 삼킨 경우. <ol start="2"><li> 나트륨 구연산의 적절한 양의 무게 (trisodium dihydrogen 2-hydroxypropane-1 ,2,3-tricarboxylate, 오세영 3 C 6 H 5 O 7) 한 후 최종 0.5 % 솔루션을 만들기 위해 탈 이온수의 분말을 resuspend. 8-9 coverslips 당 솔루션 1 ML을 준비합니다. </li></ol> 경고 : 나트륨 구연산은 눈과 피부 자극의 원인이 될 수 있습니다. 또한 호흡기 및 소화 기관의 염증을 일으킬 수 있습니다. <ol start="3"><li> 살균, 독소 - 무료 비커에서 무균 14.5 MM HAuCl 4 솔루션과 살균 탈 이온수의 13.5 ML의 1.5 ML을 결합하고, 결과는 희미한 노란색 솔루션을 얻을 수 있습니다. 앞서 언급 한 권 한 할 8-9 콜로이드 골드 coverslips을 허용합니다. </li><li> 지속적으로 교반 동안은 B로 시작 때까지 핫 플레이트에 솔루션을 가열오일. </li></ol> 경고 : 증기는 유독 / 유해 할 수 있으므로 솔루션의 가열가 연기 후드에서 수행해야합니다. 증기는 점액을 분비하는 세포막과 상부 호흡기 기관의 조직 파괴합니다. <ol start="5"><li> 핫 플레이트에서 비커를 제거합니다. </li><li> 교반 동안 0.5 % 나트륨 구연산 솔루션의 0.7 ML를 추가합니다. 앞서 언급 한 볼륨이 만들어 질 수있는 8-9 콜로이드 골드 coverslips을 허용합니다. </li><li> 약 2 분이 결합 된 솔루션을 교반 유지 (참고 : 솔루션의 색상이 점점 드디어 레드 와인에 도달하기 전에, 깊은 보라색으로, 보라색으로, 회색으로, 삭제하거나, 바람직하게는, 녹 색, 희미한 노란색에서 변경됩니다) . 이 제품은 콜로이드 금 솔루션입니다. </li><li> 1-2 분 (콜로이드 금 솔루션이 추가 될 때 녹는에서 coverslip에 젤라틴 층을 유지하기 위해)에 대한 10 ML 피펫의 콜로이드 금 솔루션을 냉각 한 후 colloida의 1.0-2.0 ML을 추가참조 - 이전에 24 잘 요리 (ES) (당신이 젤라틴 코팅 coverslips에 추가 콜로이드 금 솔루션의 양이 금 입자가 용액에 시켰던 얼마나 잘에 따라 달라집니다에 배치 각 젤라틴 코팅 coverslip로 난 금 솔루션 아래에 덧글). </li></ol> 참고 : 금 입자 강수량의 효율성의 변화가있을 수 있기 때문에, 그것은 먼저 젤라틴 코팅 coverslips에 콜로이드 금 솔루션의 0.5-1 ML을 추가하고 0.5 시간 동안 보육에 24 잘 접시를 배치 할 것이 좋습니다 . 이 부화 시간 후, coverslips는 coverslips에 금 입자의 적절한 밀도의 빛 현미경으로 확인해야합니다. 금 입자를 너무 낮게하고 너무 높은 농도의 예 20x 현미경 이미지를 그림 1을 참조하십시오. 금 입자 (적어도 단핵 세포와 함께 사용하기위한)의 이상적인 농도의 40x 현미경 이미지에 대한 그림 2를 참조하십시오. 선택다른 세포의 특성이 coverslips에 운동의 힘을 지시하므로 슬라이드의 금 나노 입자의 imal 밀도는 실험적으로, 사용되는 각 세포 유형에 대한 결정해야합니다. 금 입자의 농도가 부족한 경우, 젤라틴 코팅 coverslips에 콜로이드 금 솔루션의 추가 0.5-1 ML를 추가합니다. 셀의 크기에 따라, 금 입자의 적절한 농도는 다를 수 있으며, 따라서 궁극적으로 운동성에 대한 검사 셀의 크기에 따라 달라집니다. 예를 들어, 소형 전지 (~ 10-20 μm 28) 인간 단핵 세포와 금 입자의 높은 농도는 우리의 분석이 필요했습니다. 금 나노 입자의 적절한 배포 쉽고 효율적으로 세포 트랙의 가장자리를 구별 할 수있는 능력을 가진 연구자를 제공합니다. 너무 높은 금 입자의 농도가 정확하게 측정하는 것이 이동하는 세포의 능력을 바구니자신의 운동성 반면, 운동성의 정확한 트랙을 윤곽을 그리다가 너무 낮은 제한 사람의 능력입니다 금 입자의 농도. 중요 참고 : 금 나노 입자의 합성이 문제가있는 경우, 합성 금 나노 입자가 5 nm의에서 400 nm의에 크기 상업적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 형광 마이크로은 세포 운동성 29 연구에서도 사용되었습니다. 그러나, 이러한 마이크로의 사용은 세포 이주의 분석을위한 형광 현미경이 필요합니다. <ol start="9"><li> 37 보육의 콜로이드 금으로 덮인 coverslips과 24 잘 접시를 놓고 1 시간에서 하룻밤을 ° C 및 품다. </li><li> 부화 후 린스 / (PBS, pH를 7.4) 생리 버퍼 멸균 인산에 coverslips을 (3 배) 찍어하여 언 바운드 금을 제거합니다. </li><li> PBS를 포함하는 깨끗한 12 잘 요리 (ES)에서 이러한 콜로이드 골드 코팅 coverslips를 놓습니다. </li><li> 4 번 ° C까지 해당 coverslips를 저장 할 준비가(parafilm 냉장고에 넣어 전에 판)을 사용합니다. </li></ol> 중요 참고 : 항상 금 입자는 coverslips에서 플레이크 마를 허용되는 경우 할 수있는 액체 / 미디어의 일부 유형의 콜로이드 골드 코팅 coverslips를 유지. 콜로이드 골드 coverslips는 그들이 만든 된 날짜 2-3개월 내에서 사용되어야합니다. 품질 관리 : 단일 phagokinetic 트랙 운동성 분석에서는 금 입자의 비슷한 농도에 의해 특징입니다 coverslips를 사용하는 것이 중요합니다. 이 간단한 점은 치료가 아닌 콜로이드 골드 코팅 coverslips의 물리적 특성의 성격에 전적으로 인해 할 샘플 사이의 세포 운동성의 양적 차이가있게됩니다. 우리가 금 나노 입자의 밀도만큼 오래가 동일한 것으로 나타났습니다하지만 우리는 각각의 실험에서 같은 시간에 한에서만 coverslips를 사용하여 선호, coverslips의 사용다른 준비에서 적합합니다. 3. 세포 운동성 분석 <ol><li> 관심 세포에 적절한 세포 미디어에서 콜로이드 골드 코팅 coverslips를 놓습니다. </li><li> 24 잘 요리 (ES)에 배치 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 적절하게 치료 세포를 전송 </li></ol> 참고 : 하나의 잘으로 전송 세포의 수는 각 세포 유형은 공부에 대한 결정해야합니다. 이상적으로, 세포는 동등 결과적으로 하나의 셀에 의해 생성 만 트랙의 통계 분석을 위해 수 콜로이드 골드 코팅 coverslip에 배포해야합니다. 세포가 너무 높은 농도에 도금하는 경우, 그것은 여러 세포의 중복 트랙이 보이는 것을 매우 가능성이된다. 중복 트랙이 정확하게 quantitated 할 수 없으며, 따라서, 그것들은 테스트 세포의 움직임의 최종 분석에서 고려 할 수 없습니다. 의 결과로 트랙을 중복여러 셀의 참여은 일반적으로 쉽게 관찰되며, 두 개 이상의 셀이 동일한 연속 해제 지역에서 관찰 할 수있는 트랙을 (분석 분야의) 합병 또는 교차 있습니다. <ol start="3"><li> 37 품다 ° 24 시간을위한 C / 5 % CO 2 (또는 적절한 시간에, 우리는 6 시간 및 12 시간 후 치료 24 시간 후 치료 및 내피 세포 사이의 단핵 세포 운동성를 분석 한 예를). 셀 타입 공부하고, 따라서 실험적으로 각 셀 타입 (- 12 시간 게시물 트리트먼트 좋은 출발점은 그러나, 6이다)에 대해 결정해야와 세포 운동성을 결정하고 측정하기위한 최적의 시간 프레임이 달라집니다. </li></ol> 참고 : 실험 콜로이드 골드 코팅 coverslips는 나중에 저장 및 / 또는 분석해야하는 경우, 셀 및 금 나노 입자가 coverslips에 고정해야합니다. 이 고정 단계 달성하기 위해, 다음과 같은 단계 3.3 처음 세탁은 1X와 함께 조심스럽게 2 번 coverslipsPBS은 (coverslips에서 금 나노 입자의 제거가 피할 수해야하기 때문에 coverslips의 찍어 것은 바람직하다), 그러한 상온 3 % paraformaldehyde로 부화 등의 표준 셀 고정 방법을 사용합니다. 15 분 부화 후, 3 % paraformaldehyde가 제거되어야하며 coverslips는 1X PBS로 조심스럽게 3 번 씻어. 고정 coverslips는 냉장고에 저장 될 수 있습니다. <ol start="4"><li> 가벼운 현미경 사용하여, 하나의 이동 셀 (: 확실히 조사중인 세포 유형에 따라 달라집니다 휴대 트랙의 사진을 찍어하는 데 사용되는 배율 주)에서 만든 트랙의 이미지를 캡처합니다. 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 비 운동성 및 운동성 세포에 의해 생성 세포 트랙의 예는 그림 2에 표시됩니다. </li></ol> 참고 : phagokinetic 트랙 운동성 분석에 사용되는 크기의 금 나노 입자가 세포 30에 완전히 독성이 발견되었습니다. 필요한 경우, 심사 세포의 생존 능력은 trypan 파란색으로 얼룩에 의해 평가 또는 세포 생존 능력의 다른 마커에 대한 검사를 할 수 있습니다. 하나는이 단계를 수행해야하는 경우, 계정에 고정 등의 고정, 유형에 대한 필요성을해야합니다. <ol start="5"><li> 이러한 ImageJ 소프트웨어 (등 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어 사용 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) 또는 NIH 이미지 ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a> 에서 개발), 모두 보건 국립 연구소, 또는 ImageTool ( <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html는</a> ) 산 안토니오 (San Antonio)에서 텍사스 건강 과학 센터에 의해 삭제 콜로이드 금의 평균 면적 (임의의 단위)의 대학에서 개발 10-20 이상 세포 (샘플 당) 캡처 된 이미지에서 각 실험 팔에 결정됩니다. 통계는 다음 t를 수행 할 수 있습니다그는 결과를 수집. 예를 들어, 결과는 의미로 역모를 할 수 있습니다 ± 샘플 사이의 통계적 유의미성의 척도로 사용 학생의 t 수행 검사, 및 P 값이 &lt;0.05과 수단 (SEM)의 표준 오류를.도 3 및도 4 쇼 단계 세포에 의해 삭제 콜로이드 금의 지역의 분석. </li></ol>

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Y., Chenn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+behavior+screen:+identification,+sorting,+and+enrichment+of+cells+based+on+motility.">A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility.</a> BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).</li><li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+cytotoxicity+of+gold+nanoparticles.">Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles.</a> Small. 3, 1941-1949 (2007).</li><li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-healing+assay.">Wound-healing assay.</a> Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Brooks, D. M., Brooks, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Invasion+Assay+Using+Matrigel(R).">In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R).</a> Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).</li><li>Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway.">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li><li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo.">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 문서에서 제시 phagokinetic 트랙 운동성 분석은 세포 이주의 정량 분석​​을위한 간단하고 매우 효과적인 방법입니다. 여러 셀 타입은 9-17을 분석 할 수 있기 때문에,이 방법은 여러 분야에 걸쳐 잠재적 인 폭 넓은 사용이 있습니다. 콜로이드 골드 코팅 유리 coverslips의 사용은 움직이는 세포에 의해 삭제 트랙 영역의 측정 할 수 있습니다. 검정은 세포 운동성에 (ECM의 리간드, 바이러스, ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 유리 Coverslips (15 ㎜) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td> 젤라틴 300 블룸 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrachloroauric 산성 Trihydrate </td><td> 피셔 화학 </td><td> G54-1 </td><td> 14.5 ㎜ (최종 작업 솔루션) </td></tr><tr><td> 나트륨 시트르산 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP327-500 </td><td> 0.5 % (최종 작업 솔루션) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 피셔 과학 </td><td> O4042 </td><td> 3퍼센트 (최종 작업 솔루션) </td></tr><tr><td> 100mm 조직 문화 요리 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802 </td><td></td></tr><tr><td> 12 자 플레이트 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> 24 자 플레이트 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td> Techne 오븐 Hybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td> 표준 실험실 오븐은 충분 </td></tr><tr><td> 10 ML 혈청 학적 피펫 </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-보조 필러 / 디스펜서 </td><td> Drummond </td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200 단일 채널 수동 피펫 </td><td> 비가 </td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ML 장벽 팁 </td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ 소프트웨어 </td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">htt</a>P :/ / rsb.info.nih.gov / 엘 제이 / </td><td></td><td> 라이센스 : 공개 도메인 </td></tr><tr><td> photometrics CoolSNAPfx과 니콘 이클립스 TE300은 12 비트 CCD 카메라를 흑백 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> 중단, 가장 유사한 사양은 니콘 이클립스 티를 가지고 있지만, 낮은 엔드 니콘 80i도 적합합니다. 다른 브랜드도 비교 현미경을 제공합니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 참고 : 아래에 나열된 시약 및 장비는 다양한 연구에서 우리가 이용되었습니다. 다른 공급, 공급​​ 업체, 시약 및 장비 등의 손님들이 유사한 사양을 가지고, 사용할 수 있습니다. </td></tr></tbody></table>

a quantitative evaluation of cell migration by the phagokinetic track motility assay

세포 운동성은 단세포 및 다세포 생물 모두에게 중요한 생물학적 과정입니다. 그것은 영양소 나 거리에 적합 조건뿐 아니라 조직 개발, 면역 감시 및 상처 치유에 대한 다세포 생물에서와 같이, 단 몇 역할을 하나, 둘, 셋을 언급하는의 근원에 대한 단세포 생물의 움직임에 필수적입니다. 이 과정의 규제 완화는 심각한, 신경 심혈관 및 면역 질환뿐만 아니라 악화 종양 형성으로 이어질와 4,5 확산 될 수 있습니다. Molecularly, 고를 중합 및 수용체 재활용이 셀 6,7,8의 전진 운동을 유도 세포의 확장 (lamellipodia)를 만드는 중요한 역할을 재생 표시되어 있습니다. 그러나, 세포 마이그레이션하는 것에 대한 많은 생물 질문받지 않은 남아 있습니다. 인간의 건강과 질병의 세포 운동성의 중심 역할은 특정 멕을 이해의 중요성을 강조hanisms이 과정에 참여, 특히 중요한 세포 운동성을 평가하는 정확한 방법을합니다. 현미경은 일반적으로 세포의 움직임을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, 세포는 운동성 세포의 정량 시간이 실효 영화를 만들 고가의 카메라와 소프트웨어를 필요로하는 리소스를 소모 과정을 세포 이주의 양적 측정을, 오히려 천천히 이동합니다. 따라서, 비용 효율적인 비 힘드는, 그 일반적인 실험실 장비를 활용합니다 세포 이주의 양적 측정을 수행 할 수있는 능력은 많은 연구자를위한 훌륭한 필요합니다. phagokinetic 트랙 운동성 분석은 콜로이드 골드 코팅 유리 coverslip 9,10에 측정 트랙을 만들 수는 경로에서 금 입자를 삭제하는 이동 셀의 능력을 활용합니다. 자유롭게 사용할 소프트웨어의 사용으로 여러 트랙이 통계 요구 사항을 달성하기 위해 각 치료를 평가 할 수 있습니다. 검정은 평가하기 위해 활용 될 수있다이러한 암 세포 11,12, 섬유 아세포 9, 호중구 13, 골격근 세포 14, keratinocytes 15, trophoblasts 16, 내피 세포 17와 단핵 세포 10,18-22 많은 세포 유형의 운동성. 프로토콜은 나트륨 구연산의 chloroauric 산 (호주 3 +)의 감소에 의해 생성 된 금 나노 입자 (호주 °)으로 코팅 슬라이드의 생성을 포함한다. 이 방법은 1951 23인치 Turkevich 외에 의해 개발 된 후 Frens 외하여 1970 년대 향상되었습니다. 24,25. 이 화학 감소 단계의 결과로, 금 입자 (직경 10-20 nm 정도)는 반응 혼합물로부터 침전 및 셀룰러 마이그레이션 분석 9,26,27에서 사용하기위한 다음 준비가되어 유리 coverslips에 적용 할 수 있습니다. 일반적으로 phagokinetic 트랙 운동성 분석 세포 운동성의, 빠른 양적 쉽게 측정하기위한 한 방법입니다. 또한,시간이 실효 영상뿐만 아니라 연구자의 필요에 따라 다른 용도 의무가없는 세포 유형에 사용할 수 있도록 간단한 높은 처리량 분석으로 활용 될 수있다. 함께 양적 비싼 현미경 및 소프트웨어 필요없이 여러 세포 유형의 세포 운동성을 측정 할 수있는 능력은 일반적인 실험실 장비와 화학 물질의 사용과 함께, 휴대을 이해 phagokinetic 트랙 운동성 분석에게 관심이있는 과학자를위한 견고한 선택을 운동성.

표시는 하나의 셀 (우리의 실험에서 단핵 세포는 그림 2에 표시되어 있습니다)에 의해 삭제 트랙 영역을 표시하는 가벼운 현미경으로 촬영 한 사진의 예입니다. 비 운동성 세포는 특성 작고, 타원형 또는 이들 unstimulated 세포 (그림 2A와 2B)에 대한 운동의 낮은 기저 수준을 나타내는 스스로 주위에 원 모양의 책자를 만들 수 있습니다. 반면, 높은 운동성 세포 [?...

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A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

phagokinetic 운동성 트랙 분석은 세포의 움직임을 평가하는 데 사용되는 방법입니다. 특히, 분석은 양적 방식으로 시간이 지남에 chemokinesis (임의의 셀 운동성)을 측정합니다. 검정은 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 미치는 운동의 측정 트랙을 만들 수있는 세포의 능력을 활용합니다.

Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

a-quantitative-evaluation-cell-migration-phagokinetic-track-motility

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K 조회수.  Louisiana State University Health Sciences Center. phagokinetic 운동성 트랙 분석은 세포의 움직임을 평가하는 데 사용되는 방법입니다. 특히, 분석은 양적 방식으로 시간이 지남에 chemokinesis (임의의 셀 운동성)을 측정합니다. 검정은 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 미치는 운동의 측정 트랙을 만들 수있는 세포의 능력을 활용합니다.

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Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

유동세포계측법에 의해 피해를 입은 척수 조직에서 면역 세포의 양적 평가 : 세포 정제 방법에 대한 소설을 사용

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...