우리는 기꺼이 DRS의 중요한 기여를 인정합니다. 존 앤더슨, 앤드류 메인이 공부 셜리 티렐. 이 작품은 질병 통제 및 예방 (U50/CCU116806-01-1)와 농업의 미국학과 (58-6615-1-218, CONH00768 및 CONH00773)의 센터에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 모기 분류 및 식별 <ol><li> 다음 절차는 라이브 모기와 함께 작동하도록 훈련 직원 전용 biosafety 레벨 2 (BSL - 2) 실험실에서 열린 실험실 벤치에서 수행됩니다. &quot;차가운 체인은&quot;절차를 통해 유지됩니다. </li><li> 5 분 -20 °의 냉장고 안에 모기 수집 봉투를 배치하여 성인 모기에 살고 마취. 드라이 아이스가 들어있는 절연 컨테이너로 전송 수거 봉투. 뚜껑을 닫고 노크 다운 완료 확인으로 1-3 분 탄소 이산화탄소로 모기를 노출. </li><li> 드라이 아이스의 침대에 배치 미리 차게 냄비에 anesthetized 모기를 누릅니다. 좋은 포셉 및 플라스틱 부분 컵에서 개최를 사용하여 별도의 개별 여성 모기. 서부 유럽 표준시 얼음 덮개 및 장소 컵을 함께 커버. </li><li> 스테레오 해부 현미경 (10 - 60X 줌)의 도움으로 외부 모기 형태에 따라 설명 taxonomic 키를 사용하여 수종으로 모기를 적어 전자 진정 테이블에 장착. </li><li> 구리 BB를 포함하는 두 ML 스냅 캡 튜브 안에 ≤ 50 개인 수영장에 모기 종을 확인 결합합니다. 튜브는 고유 식별자로 표시됩니다. </li><li> 모든 모기의 식별 다음, 유리병이 표시 봉지에 배치하고 드라이 아이스가 들어있는 스티로폼 쿨러에서 개최. </li><li> 바이러스 검사 전까지 -80 ° C 냉동고에 모기 풀을 저장합니다. </li></ol> 2. 모기로부터 바이러스를 분리하기 위해 Biosafety 고려 사항 <ol><li> 다음 절차는 억제 1이 수준에서 작동하도록 훈련 직원에 의해 biosafety 레벨 3 (BSL - 3) 실험실에서 수행됩니다. 연구소 시설, 장비, 절차 및 관행, 제도적 주, 그리고 연방 정부 감독 및 검사에 따라 달라질 수 있습니다. 다음과 같은 프로토콜을 시도하기 전에 적절한 교육 및 승인을 추구합니다. </li><li> 일회용 가운, 장갑, 얼굴 방패, 그리고 호흡기 등 각 절차에 대해 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. </li><li> 작성 절차 이전과 이후 70 %의 알코올로 작업 표면을 소독. </li><li> 세포 문화와 잠재적으로 전염성이 자료는 클래스 II biosafety 캐비닛 (BSC)에 처리됩니다. </li><li> 모기 수영장은 BSC 안에있는 믹서 - 공장에서 균질하고 있습니다. </li><li> 모기 homogenates는 에어로졸 - 꽉 microcentrifuge에 centrifuged 있습니다. 이 절차는 BSC 내에 수행할 수없는 경우에는 원심에서 샘플을 운영하고 검색할 때 연산자는 인공 호흡기를 착용해야합니다. </li><li> Pipets과 BSC (biosafety 캐비닛)의 자료를 처리 pipet 팁 전에 autoclaving 10 %의 표백제에 배어있다. 모든 실험실 폐기물은 처리하기 전에 autoclaving하여 소독합니다. </li></ol> 3. 베로 세포의 준비 <ol><li> 표백제를 포함하는 폐기물의 비커에 합류 베로 세포 (클론 E6) 중 하나 큰 조직 문화 플라스크 (175cm 2)에서 가만히 따르다 문화 미디어. </li><li> 5 ML의 PBS의 나누어지는과 세포의 층 이상의 철저하게 전체 monolayer를 커버해야하고 플라스크의 면을 따라 소용돌이를 추가하여 베로 세포를 씻으십시오. </li><li> 폐기물 비커에 가만히 따르다 PBS. </li><li> 2.5 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) ML 철저 전체 monolayer를 커버해야하는 세포의 층 이상의 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 37 5 분 배양기에서 술병을 품어 ° C, 5 % CO 2. </li><li> 천천히 바닥 표면의 세포를 제거하는 흔들 소용돌이 술병. 세포는 쉽게 밀어해야한다 세포가 쉽게 밀어하지 않으면 추가 1~5분을 품어. </li><li> 5 최소 에센셜 미디어 ML (멤) 5 % 태아 소 혈청 (FBS), serological pipet을 사용하고 pipet 추가 위쪽 및 다운 세포의 대단히 짧은 시간을 해산시키기 위해 평균의 10 배에서 20 배를. </li><li> 22.5 ML 총 볼륨에 대한 추가 15 ML 멤 5 % FBS를 추가하고 잘 섞는다. </li><li> 직립이 랙 (20 flasks / 랙)에 넣어 40 작은 조직 문화 flasks (25cm 2). </li><li> biosafety 캐비닛 내부 flasks가 들어있는 랙에를 놓고 직접 flasks 앞에서 모자를 배​​치, 플라스크의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> serological pipet을 사용하여 각 플라스크에 멤 5 % FBS 4 ML 하는걸. </li><li> 각 플라스크 (~ 1시 6분 분할 비율) 플라스크의 뚜껑을 교체로 0.5 ML 정지 세포를 분배. </li><li> 나머지 세포 현탁액 (~ 2.5 MLS)를 포함하는 원래 큰 조직 문화 플라스크로 5 % FBS를 멤 50 ML를 추가하고 배양기에 술병을 반환합니다. 같은 큰 조직 문화 플라스크 5 구절까지 다시 사용할 수 있습니다 그리고 새로운 플라스크 그것을 대체하는 설정해야합니다. </li><li> 플레이스 작은 조직 문화는 트레이에 스택에 flasks. 미디어 균일 flaks의 바닥을 커버 있는지 확인 소용돌이 트레이. </li><li> 37 보육 작은 flasks를 삽입 ° C, 5 % CO 2 80~90%의 합류하기 전까지 밤새 성장. </li></ol> 4. 모기 수영장의 준비 <ol><li> 시험 절차 동안 모기 수영장 감기 유지. 사전 냉장 사용냉동고 랙에 및 믹서 - 밀 카세트, 얼음처럼 차가운 시약 및 냉장 원심 분리기 모기 수영장 처리. </li><li> 플레이스 튜브는 미리 냉장 냉동고 걸이에 모기가 포함된 추가 1 - 1.5 ML PBS - G를 모기 각 튜브 수 있습니다. </li><li> 냉동고에서 믹서 - 밀 카세트를 검색합니다. 믹서 - 공장에서 안전하게 다음 각 카세트로 24 튜브를 삽입합니다. </li><li> 25 사이클 / 초 4 분 동안 샘플을 균질. 믹서 밀 모기 조직을 방해 각 관 내부에 고속 및 금속 BB에서 튜브를 쉐이크. </li><li> 7,000 RPM 6 분 튜브를 원심 분리기. </li><li> 다시 냉동실 랙에에 플레이스 튜브는 베로 세포에 주사까지. </li></ol> 5. 모기 수영장 homogenates와 베로 세포의 접종 <ol><li> 적절한 confluency과 세포의 건강을 보장하기 위해 거꾸로 현미경으로 각 시리즈에서 하나 이상의 조직 문화 플라스크를 확인, 80~90% 보도에 대해 기대하고 있습니다. </li><li> 서 각 모기 수영장에서 해당 가입 번호와 랙 및 레이블 flasks 20 작은 조직 문화 flasks합니다. </li><li> 모자 및 폐기물 비커에 조직 문화 flasks에서 미디어를 가만히 따르다 대부분을 풀어. 완전히 외투 세포 monolayer에 술병 충분한 미디어를 둡니다. </li><li> 해당 조직 문화 플라스크에 각각의 처리 모기 수영장에서 뜨는의 나누어지는의 100μL. </li><li> 교체 및 문화 술병 뚜껑을 조입니다. </li><li> 35-40 RPM에서 5 분 (실온)에 대한 쉐이크에 문화 flasks는 평평하다. </li><li> BSC의 랙과 장소에 수직으로 위치 20 조직 문화 flasks를 반환합니다. </li><li> 한 번에 세 조직 문화 flasks을 Uncapping, serological 피펫을 사용하여 각 플라스크에 4 ML 성장 미디어를 분배, 모자를 교체하십시오. </li><li> 피펫 팁의 문화 술병 넥이나 입술에 문의하지 있는지 확인하십시오. 연락이 술병으로 만든 경우 필요에 따라 피펫 팁을 변경합니다. </li><li> 37 품어 조직 문화 flasks ° C 5 % CO 2. </li></ol> 6. 바이러스 성장 베로 세포 검사 <ol><li> 화면 3-7일 이후 접종에서 바이러스 감염의 징후, cytopathic 효과 (CPE)에 대한 조직 문화 flasks을 주사. </li><li> 시각 틸팅 flasks로 CPE 및 / 또는 오염 물질에 대한 세포 문화를 검사하고 미디어를 검사 술병의 하단에있는 수영장. 세포 CPE 동안 저하 또는 효모, 균류, 또는 세균 오염의 증가로 인해 같은 미디어 뿌연 나타납니다. </li><li> 거꾸로 현미경 흐림 미디어를 전시 셀 문화를 다시 확인합니다. 바이러스는 세포가 변형되기와 문화 flasks에서 풀어 휴식합니다 발생할 것입니다. 눈에 보이는 오염 물질, 예를 들어 효모, 다른 박테리아, 균류 또는 무거운 모기 부스러기와 세포 문화는 0.22μM 주사기 필터를 통해 원래 모기 풀을 통과하여 다시 테스트합니다. </li><li> 무균 serological 피펫을 사용하여 레이블 cryotubes에 바이러스 양성 세포 배양에서 미디어 1-2 MLS 하는걸. </li><li> 바이러스 문화가 -80에 저장됩니다 ° C 적절한 진단 assays를 사용하여 확인하기 전까지. </li></ol> 7. 시약의 준비 <ol><li> 멤 5 % FBS. DD H 2 0 4 패의 최종 볼륨 가루 멤의 37.6 g을 디졸브. 미디어 병 및 압력솥 500 ML aliquots에 솔루션을 분배. 솔루션 냉각되면, 무균 각 병 26 ML 열 - inactivated 태아 소 혈청, 5.2 ML L - 글루타민, 5.2 ML의 anti-biotic/mycotic, 그리고 10.4 ML 7.5 % 나트륨 중탄산염를 추가합니다. 4 스토어 ° C. </li><li> PBS - G. 16g NaCl, 0.4 g KCl 2.3 g 나 2 HPO 4 0.4 g KH 2 PO 4, 0.5 % 페놀 레드의 4 ML 1000 ML DD H 2 0으로를 해산. 2 N NaOH (필요한 경우)을 7.1-7.4로 산도를 조정합니다. 별도의 비이커에서 물에 H 2 0 열 600 ML. 핫 플레이트에서 제거, 10g 젤라틴을 추가하고, 디졸브. PBS 용액에 녹아 젤라틴 솔루션을 추가하고 DD H 2 O. 2 L로 최종 음량을 조절 병 및 압력솥으로 솔루션의 100 ML 하는걸. 솔루션 냉각되면, 무균 42.8 ML 열 inactivated 토끼 혈청과 1.4 ML의 anti-biotic/mycotic를 추가합니다. 4 스토어 ° C. </li><li> PBS 셀 씻으십시오. 400 ML DD H 2 O. 50 ML 10X Dulbecco의 PBS를 추가 2 N NaOH와 7.1 산도를 조정합니다. DD H 2 O. 500 ML에 마지막으로 볼륨을 조정 0.2uM 진공 필터 유닛으로 필터 솔루션입니다. 8 ML 나사 캡 튜브 5 ML aliquots로 분배. 4 스토어 ° C. </li></ol> 8. 대표 결과 4 taxonomic 가정에서 바이러스의 아홉 가지는 1997년에서 2010년까지 (표 1)에서 코네티컷에서 지속적인 감시를 통해 수집된 주 내의 모기로부터 복구되었습니다. 이러한 바이러스의 다섯 인간 질병, 웨스트 나일 바이러스와 동부 에콰인 뇌염 바이러스되고있는 가장 중요한 병원체를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 새로운 발견은 다음과 같습니다 수집 모기에서 WNV의 첫 절연을1999 2 북미, 2005 4 2000 3 북동부 미국의 포토 바이러스 첫 분리 및 뉴잉글랜드에 라 크로스 바이러스의 첫 고립. <table border="1"><tbody><tr><td> 바이러스 </td><td> 가족 </td><td> 번호 격리 </td><td> 번호 위치 </td><td> 번호 년이 감지 </td><td> 인간 질병 </td><td> 심판. </td></tr><tr><td> 웨스트 나일 바이러스 </td><td> Flaviviridae </td><td> 1002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> 심한, 발열, 뇌염을 검토 </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> 동부 에콰인 뇌염 바이러스 </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> 심한, 뇌염 </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> 히글란즈 J 바이러스 </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> 알 수없는 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 제임스 타운 캐년 바이러스 </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> 중간에 가벼운, 발열, 수막염 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> 포토 바이러스 </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> 알 수없는 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 캐쉬 밸리 바이러스 </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> 이 문서의 경우 심한, 발열, 신경 질환에 약한 </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus 바이러스 </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> 알 수없는 </td><td></td></tr><tr><td> 라 크로스 바이러스 </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 심각한, 뇌염을 검토 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 플랜더스 바이러스 </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> 알 수없는 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 바이러스는 베로 세포 배양 분석하여 현장 수집 모기에서 발견했습니다. 모기는 1997년부터 2010년까지에서 코네티컷에있는 주 내의 감시 수집된되었습니다.

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	<li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).</li><li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes,+crows,+and+a+Cooper's+hawk+in+Connecticut.">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+collected+in+Connecticut.">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+(Bunyaviridae)+isolated+from+New+England.">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut,+USA:+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003.">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut.">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors.">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+(Bunyaviridae:+Orthobunyavirus)+from+field-collected+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+in+Connecticut,+USA:+a+ten-year+analysis,+1997-2006.">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li><li>Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.">Chapter 11.</a> Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).</li><li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).</li><li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens,+field-collected+mosquitoes,+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay.">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li><li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays.">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

베로 세포 배양 분석은 바이러스의 다양성을위한 화면 필드 수집 모기에 효과적인 방법으로 제공하고 있습니다. 이것은 구체적으로 목표 하나 또는 관심있는 몇 가지 바이러스 분자 방법 대조를 이룹니다. 또한, 우리는 베로 세포 배양 분석이 똑같이 RT - PCR 7보다 민감한 경우가 아니므로 미래 연구를위한 참조 컬렉션에 저장된 바이러스 격리 우리에게 제공하는 것으로 나타났습니다. 그?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16,140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15,240 </td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 NaHCO 3, 7.5 % Soln. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25,080 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 200mM 100x </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25,030 </td></tr><tr><td> 가루 최소한의 필수적인 매체 (멤) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11,700 </td></tr><tr><td> 10X Dulbecco의 PBS </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14,080 </td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15,400 </td></tr><tr><td> 토끼 혈청 </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16,120 </td></tr><tr><td> 베로 세포 (클론 E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL - 1586 </td></tr><tr><td> 작은 조직 문화 flasks, 통풍 모자, 25cm이 </td><td> 팔콘 - 백톤 디킨슨 </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> 대형 조직 문화 flasks, 통풍 모자, 175cm 2 </td><td> 팔콘 - 백톤 디킨슨 </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> 구리 코팅 BB의 4.5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> 믹서 밀 </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Isopack 냉동기 랙에 </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detection of infectious virus from field-collected mosquitoes by vero cell culture assay

모기는 웨스트 나일 바이러스, 뎅그열 바이러스 및 chickungunya 바이러스와 같은 중요한 인간 병원균을 포함하여 별개의 바이러스의 숫자를 전송. 이 바이러스의 대부분은 자신의 발병 범위의 강화와 새로운 영역을 확장, 이러한 위협에 대응하는 효과적인 감시 및 제어 프로그램을 necessitating 있습니다. 바이러스 활동을 모니터링하는 한 가지 전략은 발병 사이트 모기의 대규모 번호를 수집하고 바이러스 감염을 테스트 포함됩니다. 이 문서에서는, 우리는 처리하는 방법을 과정을 설명하고, 베로 세포 배양 분석하여 전염성 바이러스에 모기를 현장 수집 화면. 모기가 트랩 위치와 수종별로 분류하고, ≤ 50 개인가 들어있는 수영장으로 분류됩니다. 풀링 표본은 믹서 - 공장 및 수성 단계가 합류 베로 세포 배양 (복제 E6)에 주사됩니다를 사용하여 버퍼 호수에 균질하고 있습니다. 세포 배양은 3-7 이후 접종 및 세포 배양 재배 바이러스가 적절한 진단 assays에 의해 식별됩니다 시절부터 cytopathic 효과에 대한 모니터링입니다. 이 방법을 이용하여, 우리는 코네티컷, 미국에서 수집한 모기에서 9 가지 바이러스를 격리 있고,이 중에서 5 인​​간의 질병을 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 바이러스의 세 (웨스트 나일 바이러스, 포토 바이러스와 라 크로스 바이러스) 북미 또는 1999 년 이후 뉴잉글랜드 지역에 대한 새로운 기록을 나타냅니다. 바이러스의 광범위한 다양성을 감지하는 능력은 모두 모기가 인구에 설립하고 최근 새로운 바이러스 모니터링하는 것이 중요합니다.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

우리는 처리 방법을 설명하고 화면의 필드 수집 베로 세포 배양 분석에 의해 바이러스의 다양성을 위해 모기. 이 기술을 채용함으로써, 우리는 코네티컷에서 수집한 모기 4 taxonomic 가정에서 9 가지 바이러스를 감지했습니다.

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K 조회수.  The Connecticut Agricultural Experiment Station. 우리는 처리 방법을 설명하고 화면의 필드 수집 베로 세포 배양 분석에 의해 바이러스의 다양성을 위해 모기. 이 기술을 채용함으로써, 우리는 코네티컷에서 수집한 모기 4 taxonomic 가정에서 9 가지 바이러스를 감지했습니다.

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Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

연구

면역학 및 감염병학

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

마우스와 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 항 체 레파토리의 식별

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

세포 기반 분석 결과 의해 인간의 혈 청 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 G 검출

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...