우리는 레베카 니시, MS, 그리고 동물 수술에서 도움을 UC 어바인에있는 크리스토퍼 &amp; 데이나 리브 재단​​ 동물 핵심 시설의 기술자 감사합니다. 우리는 또한 기술 지원, 원고 및 비디오 촬영 준비 및 애니메이션을위한 가브리엘 Funes, 우샤 Nekanti 및 Denisse 모레노 감사드립니다. 이 연구는 NINDS (AJA에 RO1 NS43428 - 01), 미국의 마비 프로젝트 (HXN에 PPA - 32574) 및 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 줄기 세포 교육 수상 HXN에 T1 - 00008에 의해 지원되었다. KDB는 UC 어바인 (T32 NS007444)에서 분자 및 세포 신경 과학의 훈련 프로그램에 의해 지원되었다.

1. 척수 조직의 분리 <ol><li> 척수 세그먼트 부상 아닌 부상이나 타박상 척수의 T8 - T10 (T9에서 부상) 스프 라그 돌리 쥐가를 해부하고 실온에서 HBSS에 좋은 가위로 기계 dissociated 있었는처럼 이전 1 설명했다. 조직 분리하기 전에, 전체 척수 컬럼은 코드 세그먼트 T8 - T10의 추출하기 전에 5 분 드라이 아이스에 보관했다. </li><li> 조직 비트는 원심 분리 (1 분, 1000 RPM, 상온) 및 2.5 MG 트립신 37 20 분 5 ML DME (Dulbecco의 수정된 이글의 미디어) 5 MG의 collagenase ° 분쇄하기 전에 C (와 효소 dissociated에서 검색되었습니다 ~ 10 회 상온에서) 유리 파스퇴르 피펫 (9 인치)와 함께. </li><li> DME + 10% 태아 소 혈청의 10 ML는 효소 활동을 억제하고 다음 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링되었습니다 세포에 추가되었습니다. 빠른 스핀 후, 세포 펠렛은 HBSS 6 ML의 resuspended되었으며 OptiPrep 기울기 솔루션 아래에 설명된에 overlayed. </li></ol> 2. OptiPrep 경사도 솔루션을 만들기 <ol><li> 희석 OptiPrep는 걸레의 버퍼 (0.15 M NaCl, 10 MM 걸레, 산도 7.4)와 OptiPrep 1시 1분을 diluting에 의해 건설되었습니다. </li><li> 푸르 OptiPrep 기울기 솔루션은 혼합 350, 250, 200, 또는 1 ML (표 1)의 최종 볼륨 HBSS 150 μl 희석 OptiPrep에 의해 만들어졌다. </li><li> 네 가지 솔루션은 천천히 그리고 조심스럽게 바닥에 최소 희석 및 상단 (그림 1A)에서 가장 희석과 15 ML 원뿔 관에 레이어에 배치했다. </li></ol> 3. 세포에서 지질 / myelin 파편을 분리 <ol><li> HBSS에 dissociated 척수 세포 6 ML은 신중하게 OptiPrep 기울기 솔루션의 위에 계층되었습니다. </li><li> 튜브가 들어있는 셀 및 기울기 솔루션은 지질과 별개의 레이어에 셀 솔루션을 분리, 스윙 - 버킷 로터 (A - 4 - 62)와 함께 Eppendorf의 원심 분리기의 5810R을 사용하여 (15 분, 1900 rpm 또는 726 RCF, 20 ° C) centrifuged되었습니다 / 펠렛에 염증 세포, glia, 그리고 적혈구와 뉴런의 3 레이어, 다음 myelin의 파편 (상단 7 관 ML). monocytes, macrophages, PMN의 granulocytes 및 lymphocytes를 포함한 대부분의 염증 세포, 펠렛에서 발견 되었으나, 일부 대형 - 활성화 macrophages은 펠릿 위의 레이어에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 지질 / myelin 파편 레이어 (상단 7 ML)는 신중하게 aspirated 및 제거되었습니다. 전지는 다음 세탁 및 2.5 ML의 HBSS에 resuspended 아래 immunolabeling 사용되었습니다. </li></ol> 4. 유동세포계측법 특정 면역 세포의 Immunolabeling <ol><li> 척수 준비에서 수집한 전지 (500 μl) pelleted되었으며 적혈구를 lyse 5 분 0.85 %의 암모늄 염화물 (증류수에 희석)에 resuspended. </li><li> 셀 500 μl HBSS로 씻어 후 실온에서 정상 토끼 또는 마우스 혈청에서 30 분 차단되었습니다. </li><li> 또는 희석 isotype IgG 솔루션 세포는 1 항체와 시간 (;, 마우스 안티 쥐 ED1 알렉사 488, Serotec 또는 마우스 방지 새앙쥐 인 경우에는 3 번 CD를 알렉사 488 래빗 방지 PMN FITC 정확한 화학 및 과학)에 대한 세탁과 실온에서 incubated되었습니다 HBSS는 (1:100 희석 모든)로 이전 한 설명했다. </li><li> 세포는 최종 단계 이후에 300 μl HBSS에 resuspended 위에 그리고 각 단계 이후에 두 번 씻어했다. </li></ol> 5. 유동세포계측법에 의해 세포 양적 평가 <ol><li> 샘플은 세포 퀘스트 소프트웨어를 사용하여 외과 Calibur (백톤 - 디킨슨) 흐름 cytometer에 분석했다. 샘플 5,000 이벤트는 모두 샘플에 대해 읽고 있었고, 데이터 분석 서밋 (DakoCytomation)에 완성되었다. </li><li> 흐름 cytometric 게이츠는 이전에 다음 ID로 한 설명된 바와 같이 시간이 지점에 걸쳐 정상화에 대한 기본 값을 설정하는 제어 IgG isotype 표시 셀 또는 손상되지 않은 컨트롤 동물의 척수에있는 세포를 사용하여 설정되었다. 적극적으로 분류 세포의 평균 값은 전체 샘플의 퍼센트 (± SEM)로 표현했다. </li></ol> 6. 대표 결과 : myelin 파편을 제거하고 유동세포계측법에 의해 면역 세포 검출을 향상시키기 위해 OptiPrep 기울기의 기능은 1 척추 PMNs를 quantifying에 의해 평가되었다 DPI (그림 1B), SCI 1-3 이후 PMN의 침투 이전에 보고된 정상. 또는 동일 해부 척추 코드는 myelin 파편 OptiPrep - 제거하지 않고 효소 dissociated되었으며 마찬가지로 유동세포계측법하여 PMN의 침투에 대한 병렬로 평가되었다. 우리가 이전에 하나보고 있으므로, 그대로 myelin의 부스러기와 샘플에서 검색된 PMNs의 비율을 보여주는, 단지 소수 (0.5 %) 혼자 효소 분해에 비해 OptiPrep 기울기 정화 방식과 격리 샘플에서 이벤트의 위치에 변화가 있었어 OptiPrep purif에서 검색된 PMNs의 비율 (5.1 %)의처음엔 샘플 (그림 1B). 이러한 데이터는 조직의 준비에서 myelin 파편이 흐름 cytometric 신호가 불분명한 수있는 제안하고, myelin의 파편의 제거가 부상 척수 조직에서 면역 세포 검출의 감도를 향상 보여줍니다. 부상 척수의 세포 검출을위한 OptiPrep 기울기 시스템의 감도를 설립하는 데, 우리는 2 시간에서 180 DPI에 이르는 기간 동안 세포 침윤의 변화를 특징 및 PMNs, macrophages을 포함 SCI 후 세포 염증의 소설 multiphasic 응답을 설립 / microglia 및 T - 세포. 1-3으로 이전 연구에 의해 확인, PMNs 먼저 2 시간 이후 부상에서 코드를 입력하고 1 DPI를 (그림 2 및 4) 만족. 반면 1,4,5에 Macrophages / microglia는 3 DPI까지 부상 척수에서 발견, 7 DPI (그림 3 및 4)에 처음 만족되지 않았습니다. 놀랍게도, 우리는 macrophages / microglia 두 번째 시간을 60 DPI에 대한 만족을 180 DPI (그림 3 및 4)을 통해 고가 남은 처음으로 표시됩니다. macrophages / microglia, 마찬가지로 T - 세포 침투는 7 DPI 5-7을 최대로 예측했다 있지만, 유동세포계측법는 T - 세포의 높은 번호가 감지되었습니다 불구하고, 첫 번째 7 DPI에서 T - 세포 번호 변경 사항을 감지하지 않았 9 DPI (1.6 %) (그림 4). T - 세포 숫자는 10 DPI, 영구적인 T 세포 반응은 세포의 4.4 %가 인 경우에는 3 번 CD에 들어 (그림 4)로 분류되었던 당시, 180 DPI를 통해 관찰되었다하여 감소하고있는 동안. 함께, 이러한 데이터는 SCI 후 세포의 염증 (그림 4)의 시간 의존 multiphasic 반응을 보여, 세포 염증의 초기 단계는 DPI는 ED1의 피크 + macrophages / microglia 7 DPI와 T에 의해 다음 PMNs 1 초에 최대로 구성되었습니다 - 전지 9 DPI, 나중에 단계 60 DPI에서 macrophages / microglia의 주목할만한 초 피크와 14 DPI 후 상승 180 DPI를 통해 저항을 세 세포 인구의 구성 동안. 이 timecourse 연구 및 유동세포계측법에 의해 생성되는 양적 데이터는 immunolabeled 척수 섹션 1 양적 stereology에서 수집된 데이터 비교 결과를 보여주는, 이전에 검증되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table1.jpg" alt="표 1"/> 표 1. myelin의 파편의 제거를위한 OptiPrep 기울기의 작성. 네 OptiPrep 기울기 솔루션은 HBSS와 희석 OptiPrep (OptiPrep와 걸레의 1시 1분 희석)을 사용하여 만들어집니다. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. OptiPrep 기울기 밀도 별도의 대부분의 myelin / 부상 척수 조직 / 세포에서 파편과 유동세포계측법에 의해 면역 세포 평가를 향상시킵니다. (A) Myelin / 파편은 myelin / 파편 계층의 열망 다음 OptiPrep 기울기를 통해 dissociated 척수 조직의 원심 분리 후 세포 (뉴런, glia 및 면역 세포)에서 분리되었다. 부상 척수에서 (B) PMN 번호, 파편 제거 후 PMNs를 감지 증가 감도 (학생의 T - 테스트, P는 = 0.0001)를 보여주는. n은 그룹당 = 5, ± SEM을 의미, 모든 흐름 cytometric 게이츠는 손상되지 않은 동물의 분류 세포를 사용하여 설정되었다. 샘플 5,000 이벤트는 모두 샘플에 대한 읽을 수 있었고, 긍정적으로 표시된 세포의 평균 값은 전체 샘플의 퍼센트 (± SEM)로 표현했다. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 유동세포계측법으로 부상 척수에 PMN 침투 감지. T9에서 중간 (200 KD) 타박상 부상 후, PMNs 신속하게 2 시간 (B) 후 부상을 시작하고 1 DPI (C)를 peaking 척수를 입력했습니다. 모든 흐름 cytometric 게이츠는 손상되지 않은 동물에서 표시된 세포를 (A)를 사용하여 설정되었다. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. macrophages / 유동세포계측법으로 부상 척수에서 microglia의 침투 감지. T9에서 중간 (200 KD) 타박상 부상 후 ED1 + 대식 세포 / microglial 번호 3 DPI (D)에서 시작 부상 척수 증가 7 DPI (E)에서 심하게 만족, 14 DPI (F)에서 낮은 수준으로 떨어졌다 전에는 60 DPI (G)에 두 번째 피크로 상승하고, 최대 180 DPI (H)로 부상 척수에 남아. 7 DPI 척수 세포의 IgG isotype 관리 라벨 (B)는 최소한의 항체 - 라벨 배경과 2 시간에서 항체 - 레이블 셀이 후 부상 (C) 또는 손상되지 않은 (A) 동물 어떠한 차이가 없음을 보여 줬다. 모든 흐름 cytometric 게이츠는 손상되지 않은 동물의 분류 세포를 사용하여 설정되었다. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table2.jpg" alt="표 2"/> 표 2. timecourse 실험에서 동물 샘플. 각 시점 (0 HR 180 DPI)의 경우, 다섯 동물, T9에서 중간 (200 KD) 타박상의 상처를 받았습니다및 척수 조직이 PMNs, ED1 + macrophages / microglia, 그리고 인 경우에는 3 번 CD + T - 세포의 숫자 유동세포계측법에 의해 평가되었다. 그러나, 모든 동물의 샘플 PMN (4-5), ED1 (3-5), 그리고 인 경우에는 3 번 CD (4-5) 흐름 cytometric 분석을 성공적으로 복구되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. T9에서 중간 (200 KD) 타박상 부상 다음과 척수에 염증 세포의 timecourse. 으로 유동세포계측법, PMNs의 숫자, ED1 + macrophages / microglia, 그리고 인 경우에는 3 번 CD에 의해 평가 + T - 세포가 심하게 만족 (각각 1,7, 9 DPI) 및 부상 척수에서 만성 지속. n은 = 3-5 회 그룹, ± SEM을 뜻합니다.

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	<li>Beck, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cellular+inflammation+after+traumatic+spinal+cord+injury:+evidence+for+a+multiphasic+inflammatory+response+in+the+acute+to+chronic+environment.">Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment.</a> Brain. 133, 433-447 (2010).</li><li>Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+early+and+terminal+complement+proteins+associated+with+polymorphonuclear+leukocytes+in+vitro+and+in+vivo+after+spinal+cord+injury.">Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury.</a> J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).</li><li>Saville, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monoclonal+antibody+to+CD11d+reduces+the+inflammatory+infiltrate+into+the+injured+spinal+cord:+a+potential+neuroprotective+treatment.">A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment.</a> J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).</li><li>Popovich, P. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

CNS의 면역 세포를 수치 유동세포계측법의 사용은 지질 / myelin 내용과 파편에 의해 복잡합니다. 항체와 결합 특이성을 방해하는 것 외에도, myelin의 잔해 측정 감도와 정확도 8 감소, 유사한 크기 및 면역 세포에 과립 속성을 가질 수 있습니다. 여기에서 설명한 새로운 세포 준비 방법은 myelin 부스러기를 제거에 효과적입니다시키고 부상 척수에 염증 세포의 변화를 감지 유동세포계측법의 감도를 향상시킵니다. SCI는 PMNs에 대한 전체 시간 코스를 포함하는 다음 예를 들어, 면역 세포의이 방법 향상된 검출하여 myelin의 파편의 제거 alone.Critically 효소 분해에 비해,이 방법의 소설의 사용은 급성 및 만성 세포 염증의 첫 번째 특성 허용 macrophages / microglia, 그리고 T - 세포 최대 180 DPI하고, 세포 염증의 소설 두 번째 단계를 식별. neuroinflammation의 multiphasic 구성 요소의 이러한 중요한 연구 결과는 SCI에 대한 세포 기반 및 약리 모두 중재를 포함한 합리적인 치료 치료 전략의 설계 및 구현을위한 중요한 수 있습니다. OptiPrep 기울기 시스템은 세포 배양을 목적으로 10 두뇌의 혈액 9 셀 또는 정화 뉴런에서 별도의 파편하는 데 사용되었습니다 있지만, 우리는 수정 및 척수 dissociated 세포의 myelin 파편을 분리하기 위해이 방법을 시스템을 고급하고, 허용해야 유동세포계측법에 의해 세포 염증의 신속하고보다 정확한 양을 정함. 함께 유동세포계측법와 함께이 방법은 대부분의 연구는 세포 유형 특정하지 않거나 항상 true를 제공​​할 수 없습니다 형태학의 및 histological 기술을 사용하여 CNS의 세포 염증을 특징 것처럼, CNS의 부상이나 병적인 조건 후 염증의 연구에 상당한 발전을 제공하는 가능성이 높습니다 양적 평가. 또한, 몇 가지 최근 연구 신선한 dissociated 코드 조직 11,12 또는 Percoll 기울기 시스템 13로 구분하여 세포를 사용하여 유동세포계측법으로 부상 척수에서 면역 세포를 계량 시도했다, 그러나 이러한 연구가 낮은 세포 수율 중 하나를 증명하거나 구분해야 면역 세포의 검출. 반면, OptiPrep 기울기 셀 준비 방법은, 처음으로 등급 부상 심각에 대한 응답으로 최대 180 DPI 확장 timecourse 이상의 세포 염증의 변화 유동세포계측법에 의해 민감하고 안정적​​인 양적 평가를 제공하고 있습니다. 흐름 cytometric 분석의 감도 및 안정성 또한 특정 면역 세포 유형을 감지하는 데 사용되는 항체의 특이성에 따라, 유동세포계측법로 형태학의 기준이 더 셀 유형을 구분하는 것을 허용하지 않습니다. PMNs, macrophages는 / microglia 또는 T - 알려줍에 대한 항체의 특이성은 부상 척수 조직 1,2의 문화와 세포의 복막 PMNs 및 폐포 macrophages에 대한 유동세포계측법에서 철저하게 테스트되었습니다. 함께 OptiPrep 기울기 시스템, 유동세포계측법 사용이 항체는 SCI의 microenvironment의 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공하고, 처음으로 확장된 multiphasic 응답 할에 대한 식별이 세포 염증의 시간적 및 정량 분석​​의 생성에 기여해야 세포 염증니다. SCI 후 세포의이 multiphasic 반응은 부상 후 특정 시간에 존재 특정 세포 유형의 역할을 조사하거나 부상을 악화 수있는 특정 세포 종류에 대한 치료 개입을 생성하는 것이 중요있을 수 있습니다. 또한, 이러한 연구 결과는 SCI에 대한 최적의 약물 또는 셀 기반의 개입에 대한 적절한 근거의 개발에 도움이됩니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> OptiPrep </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> NC9182490 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> 시그마 </td><td> H1387 </td></tr><tr><td> 토끼 안티 쥐 PMN (FITC) </td><td> 정확한 화학 &amp; 과학 </td><td> AIFAD51140 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 쥐 ED1 (알렉사 플루어 488) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA341A488 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 쥐 인 경우에는 3 번 CD (FITC) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA772F </td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> 시그마 </td><td> T9935 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 시그마 </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> DME </td><td> 시그마 </td><td> D1152 </td></tr><tr><td> 마우스 IgG1 (알렉사 플루어 488) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA1209A488 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> 토끼 혈청 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 011-000-120011-000-120 </td></tr><tr><td> 마우스 혈청 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 015-000-120 </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 </td><td> BD 팰컨 </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry:  a novel use for a cell purification method

형태학의 또는 histological 기술을 사용하여 부상 중추 신경계의 면역 세포 (CNS)의 탐지는 항상 세포 염증의 진정한 정량 분석​​을 제공하지 않았습니다. 유동세포계측법는 부상 뇌 또는 척수 조직에서 면역 세포를 수치 빠른 대안 방법입니다. 역사적으로, 유동세포계측법은 혈액 또는 dissociated 비장 또는 thymus에서 수집한 면역 세포를 계량하는 데 사용되었으며, 단지 몇 연구 신선한 dissociated 코드 조직을 사용하여 유동세포계측법으로 부상 척수에서 면역 세포를 계량을 시도했습니다. 그러나, dissociated 척수 조직은 세포에 대한 오해와 흐름 cytometer에 의해 얻은 세포 개수의 안정성을 줄일 수있는 myelin 부스러기로 집중되어 있습니다. 우리는 유동세포계측법으로 부상 척수에 염증 세포의 민감하고 안정적​​인 quantifications을 제공 세포에서 효과적으로 별도의 지질 / myelin 파편에 OptiPrep 기울기 시스템을 사용하여 셀 준비 방법을 고급 있습니다. 마찬가지로 최근 연구에서 설명 (벡 &amp; 구엔 외, 뇌 2010 Feb; 133 (PT 2) :.. 433-47) OptiPrep 셀 준비의 건의와 함께 부상 척수의 세포 염증을 감지 감도를 증가했다 부상 심각와 연관 특정 세포 유형. 비판적,이 방법의 소설 사용량은 2 시간에서에 이르는 기간 동안 전체 시간 polymorphonuclear leukocytes을위한 코스 (PMNs, neutrophils), macrophages / microglia, 그리고 T - 세포를 포함하는 SCI 후 급성 및 만성 세포 염증의 첫 번째 특성을 제공 세포 염증의 놀라운 소설 두 번째 단계를 식별 1백80일 이후 부상 (DPI). 이 방법을 사용하여 세포 염증의 철저한 특성은 부상 CNS에 neuroinflammation의 더 나은 이해를 제공하고, 셀 기반 및 약리 모두 포함하여 합리적인 치료 치료 전략의 설계 및 구현을위한 중요한 수 있습니다 neuroinflammation의 중요한 multiphasic 구성 요소를 보여줄 수 있습니다 SCI에 대한 중재.

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Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

유동세포계측법로 부상 / 병적인 CNS에 염증 세포의 부량는 감도 / 정확도를 감소, 유사한 크기 및 과립 세포를 가질 수 지질 / myelin 파편에 의해 복잡합니다. 우리는 myelin 파편을 제거하고 피해를 입은 척수에 유동세포계측법에 의해 세포 검출을 향상시킬 수있는 세포 준비 방법을 고급 있습니다.

유동세포계측법에 의해 피해를 입은 척수 조직에서 면역 세포의 양적 평가 : 세포 정제 방법에 대한 소설을 사용

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

quantitative-assessment-immune-cells-injured-spinal-cord-tissue-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.0K 조회수.  University of California. 유동세포계측법로 부상 / 병적인 CNS에 염증 세포의 부량는 감도 / 정확도를 감소, 유사한 크기 및 과립 세포를 가질 수 지질 / myelin 파편에 의해 복잡합니다. 우리는 myelin 파편을 제거하고 피해를 입은 척수에 유동세포계측법에 의해 세포 검출을 향상시킬 수있는 세포 준비 방법을 고급 있습니다.

비디오: Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...