HIV 감염은 검출 가능한 바이러스없이 항 레트로 바이러스 치료를 받는 개인에서도 면역 기능 장애를 일으킵니다. 이 방법은 면역 반응의 주요 조절기인 단세포 기능의 연구를 가능하게 합니다. 우리는 인간의 기본 단핵구의 격리, 문화 및 트랜스퍼팅을 위해 이 기술을 최적화했습니다.
우리는 HIV 감염한 개별에 있는 면역 기능 장애의 분자 기계장치를 이해하기 위하여 이 방법을 이용합니다, 그러나 단색세포와 관련되었던 그밖 면역 연구 결과에 적용될 수 있습니다. 이것이 인간의 혈액으로 일하는 첫번째 시간인 경우에, 적당한 생물안전 프로토콜을 따르고 가능하게 전염성 물질로 견본전부를 취급하는 것을 기억하십시오. 4개의 10 밀리리터 EDTA 진공 관에서 40밀리리터의 신선한 인간 전혈을 수집한 후, 멸균 기술을 사용하여 모든 혈액을 생물 안전 캐비닛에 있는 50밀리리터 원추형 프로필렌 튜브로 이송합니다.
선택한 인간 단화 절연 키트의 제조업체의 지시에 따라 키트에서 혈액 튜브에 단핵 분리 칵테일 2 밀리리터를 추가하고 키트에서 자기 구슬을 30초 동안 소용돌이시다. 두 밀리리터의 구슬을 혈액에 넣고 25밀리리터 세로지피펫을 사용하여 구슬을 혈액과 조심스럽게 섞습니다. 실온에서 5분 후, 혈액을 50밀리리터 튜브 4개 사이에 균등하게 분할하고 각 튜브에 1밀리미터 EDTA로 보충된 멸균 PBS 30밀리리터를 추가합니다.
플라스틱 25 밀리리터 세로지오피펫과 다시 섞어 튜브를 자기 홀더에 놓습니다. 10분 후, 파이펫을 사용하여 각 튜브의 중앙에서 1밀리리터 이상의 적혈구를 흡인하지 않도록 주의하고 튜브 내용물 4개를 새로운 50밀리리터 튜브 중 하나로 분배합니다. 각 튜브에 소용돌이가 있는 자기 구슬의 500마이크로리터를 추가하고 세포 용액을 부드럽게 혼합합니다.
튜브를 5분 동안 자기 홀더에 다시 넣은 후 각 튜브의 중앙에서 4개의 새로운 50밀리리터 튜브 중 하나로 조심스럽게 내용물의 내용을 전달합니다. 모든 세포 현탁액이 전달되면 각 새로운 50 밀리리터 튜브를 자석 홀더에 5분 간 배치한 후 튜브 내용내용을 4개의 새로운 50밀리리터 튜브 의 세 번째 세트로 조심스럽게 옮기십시오. 그런 다음 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 계산을위한 멸균 PBS의 총 10 밀리리터에서 모든 4 개의 세포 펠릿을 재중단합니다.
계산 후, 37섭씨 37도의 혈청 프리 RPMI 1640 배지의 밀리리터 당 10번에서 6번째 세포로 1회 10회에서 분리된 단핵구를 재연하여 항생제로 보충하고 생물안전 성 캐비닛에 있는 35mm 플레이트로 재중단된 세포의 1밀리리터를 플레이트로 플레이트한다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 30-60분 동안 배치하여 세포가 우물 바닥에 부착할 수 있도록 합니다. M1과 같은 표현형을 가진 대식세포에 대한 프라이머, 각 접시에 GM-CSF의 밀리리터 당 25 나노그램을 포함하는 태아 소 혈청의 100 마이크로 리터를 추가합니다.
M2와 같은 표현형을 가진 대식세포에 대한 프라이머, 각 플레이트에 M-CSF의 밀리리터 당 50 나노그램을 포함하는 태아 소의 100 마이크로 리터를 추가합니다. microRNA 모방, 억제제 또는 작은 간섭 RNA를 가진 단핵 환전의 경우, 트랜스페션 키트에 대한 제조업체의 프로토콜에 따라, 10 마이크로리터의 희석 모방 또는 제5 세포의 10 마이크로리터에서 완충제에서 선택된 RNA를 희석시켰다. 경질 시약을 준비하기 위해 제공된 폴리머의 마이크로리터 1개를 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브에 추가하고 즉시 키트 제공 버퍼의 90 마이크로리터를 추가하여 트랜지션당 총 91마이크로리터의 시약을 얻습니다.
3~5초 동안 리젠트를 소용돌이시키고 희석 된 RNA 10 마이크로리터를 포함하는 튜브내로 전환 용액의 파이펫 90 마이크로리터를 소용돌이시다. 부드러운 혼합 후 실온에서 15분 동안 용액을 배양한 후 100마이크로리터의 트랜스페션 복합체를 하나의 셀에 추가합니다. 섭씨 37도에서 4시간 후, 배지를 적절한 성장 인자를 포함하는 완전한 중간 크기의 3밀리리터로 교체하십시오.
문화의 여섯 날에, 태아 소 세럼, 항생제, 리포 폴리사카라이드, 인터페론 감마로 보충 된 매체의 3 밀리리터로 M1 배양 문화 의 초월제를 대체하고 태아 소 혈청, 항생제, M-CSF, 및 인터루크4로 보충 매체로 M2 문화권에서 초퍼를 대체합니다. 24시간 의 배양 후, 활성화된 대식세포 의 각 플레이트를 세척당 신선한 PBS로 두 번 씻으시면 씻습니다. RNA 및 단백질 분석을 위해, 부착된 세포를 플레이트에 직접 리세하여 분석을 위해 방출된 세포 내용물의 수집을 허용한다.
유동 세포 측정 분석을 위해 PBS에서 밀리머 EDTA 2개를 10분 동안 섭씨 37도에서 분리한 후 플레이트 바닥에서 세포를 부드럽게 긁어 내어 수집을 1.5 밀리리터 미세원심분리기로 분석합니다. 여기서 는 비활성화 T0 세포에 비해 CD163 및 CD209의 증가된 수준을 가진 CD80 및 CD83 및 M2 활성화 세포의 증가된 수준을 가진 M1 활성화 제어 및 환자 유래 세포의 대표적인 히스토그램이 도시된다. 흥미롭게도, CD80 및 CD83은 HIV 유래 세포에 비해 대조군 유래 세포에서 더 높게 발현되는 것으로 나타났다.
스크램블근적외선 표지 된 microRNA를 사용하여 갓 수집 된 단핵구의 트랜스페션은 유동 세포 측정 및 공초점 현미경 검사법에 의해 결정된 바와 같이 90 % 이상의 트랜스페션 효율을 초래합니다. 또한, 형질전환은 세포 성숙 또는 경질 조건의 단계에 관계없이 환자 유래 또는 제어 세포의 생존가능성을 크게 감소시키지 않는다. 트랜스펙트 결과 1일 및 4일째 사후 격리에서 특정 소형 간섭 RNA를 통해 트랜스포팅 시 표적 유전자의 효과적인 다운레충이 초래됩니다.
또한, microRNA 모방으로 감염된 세포는 모든 트랜스퍼션 컨트롤이 유의할 수 없는 변화를 보이지 않는 동안, 미감염 된 세포에 대한 microRNA 발현의 48 ~ 72 배 증가를 입증한다. 도금된 세포의 수는 생존에 매우 중요합니다. 35mm 접시당 100만 개의 셀을 권장합니다.
혈청이 없는 배지로 도금도 세포 부착을 크게 향상시킬 것입니다. 이 방법으로 얻은 세포는 관심있는 환자와 건강한 통제의 환자에 있는 차동 반응을 공부하기 위하여 사이토카인 또는 성장 인자로 취급될 수 있습니다.
