우리는 그의 기술 지원이 원고와 더그 해밀턴의 비판적 검토를 위해 앤은 그림과 마이클 짐머만 감사드립니다.

1. 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 절차 <ol><li> 버퍼 및 솔루션의 준비 : 용출 솔루션 (1 패) : 시약 등급 물 1 L은 0.1 g 나트륨 polyphosphate, 0.1 ML 십대 초반-80 및 0.01 ML Y-30 antifoam을 추가하려면. </li><li> 생물 학적 안전 캐비닛에 필터 어셈블리 (그림 1) 준비 : <ol><li> Masterflex I / P 정밀 brushless 드라이브에 연결된 Masterflex I / P 쉬운로드 펌프 헤드를 통해 Masterflex I / P 73 실험실 튜브를 삽입합니다. </li><li> 나사 클램프와 펌프 헤드의 상류 NPT 지점 T-커넥터가 장착되어 0-60 PSI, 글리세린 가득한 압력 게이지에 튜브를 확보하고, 펌프 헤드의 HDPE T-커넥터 하류에. </li><li> Nalgene Masterflex L / S 15 실험실 튜브와 53-B 충전 / 방출 모자와 T-커넥터를 맞추려고하고 1 패 Nalgene 무거운 듀티 폴리 프로필렌 병에 확보하여 retentate 병을 조립. </li><li> Masterflex L / S 24 튜빙 W를 맞추기ith 핀치 클램프 (핀치 클램프 2)와 HDPE T-커넥터에 retentate 병에서 연결합니다. </li><li> 압력 게이지에서 아사히 Kasei에 Masterflex L / S 24 실험실 튜브를 연결은 나사 클램프와 초 하이 플럭스 dialyzer을 Rexeed하고 dialyzer에서 retentate 병. 중공 섬유 ultrafilter에 튜브를 연결 ¼ &quot;ID 튜빙을 수용하도록 설계된 맞춤 DIN 어댑터를 사용하십시오. </li><li> 핀치 클램프 (핀치 클램프 1) Masterflex L / S 24 실험실 튜브를 장착하고 샘플 이해 라인 역할을 제거 팁 및 목화 플러그와 함께 10 ML 플라스틱 피펫에 연결하고 HDPE에 튜브를 장착 T- 커넥터. </li><li> 램프는 필터의 출구 끝 부근 유출물 포트에 튜브 클램프 접속과 Masterflex L/S-36 실험실 튜브의 한쪽 끝을 어울린다. 폐기물 컨테이너의 다른 쪽 끝을 놓으십시오. </li></ol></li><li> 0.01 % (W / V) 10 L의 물을 샘플로 나트륨 polyphosphate 및 3 분 혼합을 추가합니다. </li><li> 핀치 클램프 2 닫기그리고 retentate 병의 배출구 뚜껑을 제거합니다. 다른 모든 클램프가 열려 있어야합니다. </li><li> 압력 게이지 (왼쪽 아래 그림 1 오른쪽)에 T-커넥터에서 유체를 이동하기 위해 펌프의 방향을 설정합니다. 최대 속도의 25 %로 펌프 속도를 조절하고 펌프를 켜십시오. </li><li> retentate 병이 3분의 2 전체, 오픈 핀치 클램프 2 빠르게 retentate 병에 환기구 뚜껑을 교체합니다. 라인과 전혀 누수가없는 있도록 부속품을 모두 확인합니다. </li><li> 천천히 누수를 확인하고, 원하는 여과 속도 (약 1.5 L / 분)로 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 졸업 실린더와 타이머 또는 플로우 미터를 사용하여 방류수 라인 (그림 1의 파란색 L / S 36 관)에서 종료 물을 여과물 속도를 확인합니다. 기포가 일반적으로 어렵게 안정적인 압력과 여과 속도를 달성하는 필터의 출구 끝에 형성할 수 있습니다. 이것은 잠시 손으로 유출물 라인을 곤란에 의해 수정되었습니다. 이 작업은일반적으로 여과물 포트에 공기 방울이 동축 케이블되며 유출물 라인을 통해 종료합니다. 완두콩 크기의 공기 방울은 종종 불가 피한 것을 염두에두고 필요에 따라 반복합니다. </li><li> 여과 과정을 모니터링합니다. 필요에 따라 압력과 여과 속도를 측정하고 기록합니다. 압력이 20 Psi를 초과하지 않습니다. 이것은 여과 속도가 2.0 L / 분을 초과하지 말아야하는 것이 좋습니다. 그것은 retentate 병의 물을 볼륨은 강물을 쏟아 내죠 결코 않도록 감시하는 것이 중요합니다. 그것은 약간 높이거나 줄일 수있는 볼륨 정상입니다. retentate 병의 저수량은 아래 3분의 1 전체 떨어지는 경우 배출구 뚜껑을 제거하고 가까운 핀치는 retentate 병 라인에서 2 클램프. 대한 삼분의이 전체로 볼륨을 지참, 클램프를 열고 신속하게 단단히 밀봉을 보장, 환기구 뚜껑을 교체하십시오. retentate 병의 볼륨이 신속하고 지속적으로 떨어지는 경우 retentate 병 뚜껑을 꽉이며 배출구 캡이 제자리에 안전을 보장하고 있다고 tubiNG는 물 시료와 접촉 여전히입니다. 이러한 문제가 발생하지 않는 경우, 그때 그것은 retentate 병 뚜껑의 봉인이 불량이므로 교체해야 가능성이 높습니다. </li><li> 샘플 컨테이너가 비어있는 경우, 즉시 가까운 핀치 클램프 1, 최대 20 %까지 펌프 속도를 줄이고, retentate 병에서 배출구 뚜껑을 제거하고 램프 클램프를 닫습니다. </li><li> 램프 클램프를 강화하거나 풀어하여 약 200 ML에 retentate 병에 시료의 볼륨을 조정합니다. 볼륨이 약 200 ML되면 용출 단계 (1.11-1.12)에 대한 경사로 클램프를 조입니다. </li><li> 샘플 용기에 용출 용액 500 ML을 추가하고 컨테이너의 내부를 씻어. 용출 용액이 들어있는 용기에 시료 이해 라인에 연결된 10 ML의 피펫를 놓습니다. 진입로 클램프가 닫혀 있는지 확인합니다. 오픈 핀치 1 클램프와 가까운 핀치는 용출 솔루션을 구축하기 위해 일시​​적으로 2 클램프. </li><li> 용출 용액의 500 ML이 수립되면가까이 클램프 1과 오픈 핀치 클램프 2 꼬집어. 용출 솔루션은 최대 20 %의 펌프 속도를 5 분 동안 순환하도록 허용합니다. </li><li> 유출물 줄에 램프 클램프를 강화하거나 풀어하여 약 100 ML에 retentate 병에 시료의 볼륨을 조정합니다. 램프 클램프를 조여하고 예제 1 분 순환 수 있습니다. retentate 병에 시료의 볼륨을 확보하여 튜브에 공기를 당기는 것은 피한다 retentate 병을 입력 L / S 15 튜빙을 감추기에 충분 할만큼 높습니다. </li><li> retentate 병에 시료를 강제 펌프의 방향을 역방향. 펌프 retentate 병에 ~ 225 ML의 총 발생 20 초 동안 반대로 실행하도록 허용합니다. 펌프의 전원을 끕니다. </li><li> 펌프 헤드에서 Masterflex I / P 73 튜브를 제거하고 압력 게이지를 분리합니다. 중공 섬유 ultrafilter을 종료 Masterflex L / S 24 튜브 연결을 끊습니다. 로 모든 나머지 샘플을 강제로 retentate 병 위에 튜브를 잡아병을 retentate. </li><li> 병에서 모든 튜브를 분리하고 비 방출 캡으로 방출 뚜껑을 교체하십시오. </li><li> ~ 225 ML의 retentate으로 IMS / IFA 절차로 진행합니다. </li></ol> 2. Immunomagnetic 분리 절차 <ol><li> 버퍼 및 솔루션의 준비 : <ol><li> Cryptosporidium / Giardia 콤보 키트는 실내 온도에 도달 : Dynabeads에 포함된 버퍼를 허용합니다. </li><li> 1X SL-버퍼 : 10X SL-버퍼 9 ML 시약 등급 물 1 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 라벨 250 ML 원추형 원심 관에 retentate 병에서 액체 ~ 225 ML을 전송합니다. 시약 물 10 ML로 두 번 retentate 병을 씻어하고, 원추형 원심 튜브에 물에 빨고을 추가합니다. 4에 15 분 °없이 브레이크와 C에 대해 1,500 XG에 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 펠렛 볼륨의 모든 0.5 ML (즉, 기음 1을위한 공기 물 인터페이스에서 포장 펠렛 위의 5 ML에 뜨는을 기음5 1.3 ML의 펠릿 볼륨 위의 ML, 그리고 대기음 0.5 ML 이하)의 펠렛 5 ML합니다. </li><li> 철저하게 vortexing 및 / 또는 피펫 혼합하여 뜨는로 펠렛을 resuspend. 한 ML을 포함하는 평면 양면 Dynal 10 파운드 라니 튜브에 액체 각 1 부​​ 5 ML 볼륨을 전송하고 SL-버퍼 B. 10X는 시약 물 2.5 ML로 두 번 원추형 원심 튜브를 씻어과에 린스를 추가 SL-버퍼 10X 각 버퍼를 포함하여 10 파운드 라니 튜브 ~ 12 ML의 전체 볼륨을 데려오 10 파운드 라니 튜브. </li><li> 10 파운드 라니 튜브에 100 μl 잘 혼합 resuspended 안티 Cryptosporidium 및 안티 Giardia Dynabeads를 각각 추가합니다. 회전 믹서에 실온에서 1 시간 18 rpm으로 10 파운드 라니 튜브를 회전합니다. </li><li> MPC-6 자석 부드럽게 손으로 바위 2 분을 튜브 엔드 - 투 - 엔드, 180 ° 반대 10 파운드 라니 튜브의 평평한 면을 넣습니다. </li><li> 자석 측면과 MPC-6 자석에 10 파운드 라니 튜브를 유지할 수있다는 것은 최대, 비드 / (OO) 낭종 단지 보우 멀리 뜨는을 가만히 따르다자석에 ND. 자석에서 10 파운드 라니 튜브를 제거하고 튜브에 1X SL-버퍼 0.5 ML을 추가합니다. 수직 위치에있는 자석으로 MPC-S에서 열리는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로를 SL은 버퍼 1X 0.5 ML의 두 개의 추가 물에 빨고을 사용하여 현탁액을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 1 분 MPC-S 자석 180 °에서 튜브를 흔들. 대신에 자석으로 microcentrifuge 튜브의 하단으로 이동 파스퇴르 피펫을 사용하여 표면에 뜨는을 기음. </li><li> microcentrifuge 튜브의 전면 측면에 1X PBS 1 ML 추가 자석을 제거하고 구슬이 resuspended 때까지 그냥 부드럽게 튜브를 흔들. 수직 위치에 자석을 교체하고 부드럽게 1 분 관 180 °를 흔들. PBS는 가능한 한 많은 파편으로 제거하는 파스퇴르 피펫을 사용하여 비드 펠렛을 방해하지 않고, 린스 기음. </li><li> 자석을 제거하고 microcentrifuge 튜브의 뒷면에 시약 물을 50 μl를 추가합니다. 와동 50 초만 전속력으로 튜브,다음 삼십초 와동이어서 10 분 동안 80 ° C에서 튜브를 품어. 자석에 비즈를 묶는 방식과 액체에 (OO) cysts두고, 한쪽으로 치우 쳤던 위치에서 MPC-S에 자석을 교체하십시오. SingleSpot 아니라 슬라이드에 (OO) 낭종 서스펜션을 적용합니다. </li><li> 최초의 분리를 포함하는 동일한 잘으로 액체를 적용, 단계 2.10를 반복합니다. 37 ° C 슬라이드도 슬라이드에 현탁액을 건조하여 1 시간 정도 따뜻한 장소에 슬라이드. </li></ol> 3. 염색법 및 심사 <ol><li> 버퍼 및 솔루션의 준비 : DAPI 솔루션을 일하는 것은 : 1X PBS의 25 ML에 DAPI 증권 솔루션 (메탄올 2 밀리그램 / ML) 25 μl를 추가합니다. 매장 재고와 1 ° C와 어둠 속에서 10 ° C 사이에서 작동 솔루션. </li><li> 물론 슬라이드에 메탄올 50 μl를 적용하고 실온에서 건조하실 수 있습니다. </li><li> 물론 슬라이드로 작동 DAPI 용액 50 μl을 넣고 실온에서 2 분 동안 품어. </li><li> Kimwi 사용PE는 우물에서 DAPI를 심합니다. EasyStain 50 μl을 적용합니다. 30 분간 35 ° C에서 품어. </li><li> Kimwipe으로 잘를 착색하고 천천히 그것이 잘 끄트머리로 흐를 수 있도록 추운 EasyStain 고정 버퍼 300 μl를 추가 위크. 실온에서 2 분 동안 품어. </li><li> 우물에서 버퍼를 등심과 EasyStain 장착 매체의 10 μl을 적용하는 Kimwipe을 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 발생하는 기포를 제거, 커버 전표를 적용합니다. 투명 매니큐어로 커버 슬립을 봉쇄해. </li><li> oocyst이나 낭종 유사 난형 또는 원형 사과 녹색 형광 개체, 200X 총 배율에서 FITC 필터를 사용하여 전체 슬라이드를 검사합니다. 또한 1000X 총 배율에서, 1000X 총 배율에서 DAPI 필터와 함께 다음 DIC있는 이러한 모든 개체를 검사합니다. 보정 안구 마이크로 미터 및 형태학의 특성을 사용하여 크기를 기록합니다. </li><li> 문서 결과입니다. </li></ol> 참고 : 추가 infor원래 프로 시저에 대한 mation은 EPA 방법 1623 12 2005년 12월 버전에서 찾을 수 있습니다. 설명 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 절차는 EPA 방법 1623의 섹션 12.0 대신 사용됩니다. 열 분해는 EPA 방법 1623의 섹션 13.3.3을 수정합니다. 절차는 또한 추가적인 PBS 섹션 13.3.2.16 후에 방법 1623의 2005년 12월 버전에 삽입될 수 IMS 과정 린스 설명합니다. 이러한 수정 사항을 포함하여 EPA 방법 1623에 사용되는 소모품, 시약 및 장비의 전체​​ 목록은 장비 목록에 나열됩니다. 4. 대표 결과 여과 및 immunomagnetic 분리의 과정을 통해 복구된 Cryptosporidium의 oocysts과 Giardia의 cysts는 현미경 분석에 의해 감지됩니다. 그림 2와 같이 200X 전체 배율에서, 각 유기체는 일반 염색법 패턴, 크기 및 모양을 전시 </stronG&gt;는 더욱 1000X 전체 배율에서 기름 침지를 사용하여 관찰해야한다. 이것은. 일반적인 정의 기능이나 긍정적인 신분을 배제 것이 비정형 특징 중의 측정 및 식별을 위해 수 Cryptosporidium은 구면 개체 난형이다 밝게 강조 모서리 (그림 3A와 함께 빛나는 사과 녹색의 FITC의 형광을 전시 직경 4-6 μm의 ). 녹색 테두리없이 뚜렷한 핵 (DAPI 제외), 강렬한 파란색 내부 염색법, 또는 최대 4 개의 별개의, 스카이 블루 핵 (DAPI와 하늘색 내부 염색법 : DAPI 자외선으로 oocyst는 다음과 같은 일반적인 기능 범주 중 하나를 전시합니다 긍정 - 그림 3B). 비정형 특징은 색깔, 구조, 또는 DAPI 형광 (예를 들어, 너무 많은 스테인드 핵, 붉은 색은 내부 구조를 fluorescing)의 편차를 포함합니다. 형광 객체가 일반적인 FITC와 DAPI 염색법에 대한 기준을 충족하고있다면, 그것은 차동 간섭 죄수를 사용하여 검사하고 있습니다trast (DIC). 개체는 같은 세포 벽 장식, 또는 셀을 채울 하나 또는 두 개의 커다란 핵 같은 비정형 외부 또는 내부 형태학의 특성을 면밀히 검토합니다. 비정형 구조가 관찰되지 않은 경우 개체가 전체 IFA 카운트에 기록하고 빈 비정질 구조이나 현재 1-4 sporozoites (그림 3C)로 분류됩니다. 마찬가지로, Giardia와 같은 개체는 FITC와 DAPI 염색법뿐만 아니라 axonemes, 중간 기관, 그리고 핵 같은 DIC 특성에 관한 검토되고 Giardia의 cysts는 난형의 사과 - 그린 화려한 개체, 8 라운드가 - 5.에 의해 긴 18 μm의 - 15 μm의 밝게 강조 모서리 (그림 3D)와 폭. DAPI 자외선으로 Giardia의 포낭은 DAPI-부정적인 염색법, 또는 DAPI - 긍정적인 특성 (그림 3E) 전시됩니다. Cryptosporidium에 대해 설명한 것처럼 형광 객체는 같은 방식으로 전형 및 비정형 특징을위한 DIC을 면밀히 검토합니다.비정형 기능이 관찰되지 않으면 개체는 총 IFA 카운트에 기록하고 빈 함유 비정질 구조로서, 또는 현재의 내부 구조 (그림 3 층) 중 하나 이상의 유형으로 분류됩니다. 비정형 특징을 가지고 관찰되는 모든 유기체는 (OO) 낭종으로 계산해서는 안됩니다. 환경 시료의 현미경 분석은 자동 형광 또는 FITC-복합 백신 Cryptosporidium 및 / 또는 방지 Giardia 항체 1 교차 반응 있습니다 유기체가로 도전하실 수 있습니다. 그것은 분석가가 수생 미생물, Cryptosporidium 및 Giardia을 파악 경험을 쌓을 수있는 슬라이드를 검토 수십 잘 알고 있어야하는 것이 좋습니다. 최소한 세 (OO) 긍정적인 염색법 컨트롤 슬라이드에 cysts 전에 현미경의 모든 세션에 대한 특징으로한다. 품질 관리 표본 %의 우물을 결정하기 위해 (OO) cysts를 타서 수 있습니다계산을 사용하여 각 protozoan에 대한 보임 : (OO) 낭종 비율 복구 = ((QC 샘플 백작 - Unspiked 샘플로부터 세어) / 스파이크) × 100. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> 그림 1. 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 시스템의 그래픽 표현. 튜빙은 원조를 담고 색깔 것은 시스템의 조립입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> 그림 2. Cryptosporidium 및 Giardia (OO) cysts 대표 형광 이미지. Cryptosporidium의 oocysts과 Giardia의 cysts는 FITC 분류 안티 Cryptosporidium / Giardia 항체 물들일되었다. 화살표, Giardia의 cysts, 화살촉, Cryptosporidium oocysts. 네 Cryptosporidium oocysts 여섯 Giardia의 cysts의 총 초점 비행기에서 발견되었다. 샘플 observ200X 배율 미만의 에드. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> . 특성화에 사용 Cryptosporidium oocysts 및 Giaridia의 cysts의 그림 3 대표 미세한 이미지 Cryptosporidium의 oocysts (- C가).. 뚜렷한, 스카이 블루 DAPI의 핵 (B)와 oocyst 당 1-4 sporozoites (S) (C)까지 포함하고 밝게 강조 가장자리 ()와 직경 구형 물체 4-6 μm의의 빛나는 사과 녹색의 FITC의 형광. Giardia의 cysts (D - F). 난형의 개체에 둥근 8의 빛나는 사과 녹색의 FITC 형광 - 5에 의한 길이 18 μm의 - 포 스카이 블루 DAPI의 핵 (E)까지 포함하고 밝게 강조 가장자리 (D)와 등 하나 이상의 뚜렷한 내부 구조와 폭 15 μm의 핵 등 (N), 중간 몸 (M) 및 또는 axonemes () (F). 흰색 화살표, 화려한 사과 녹색 형광 염색법의 Cryptosporidium의 oocysts 및 Giardia cysts walls, 흰 화살촉, DAPI 긍정적인 핵. 샘플 1000X 배율 하에서 관찰했다.

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미국 환경 보호국은 지하수 및 먹는물의 기술 지원 센터의 사무소와 공동 연구 및 개발에 자사의 오피스를 통해 여기에서 설명한 연구 자금. 모든 작품은 미국 EPA, 신시내티, 오하이오에서 현장에서 지원되었다. 이 문서에서 설명하는 정보가 쏘 환경 및 인프라, INC에 계약 하에서 미국 환경 보호청 (계약 EP-C-06-031)에 의해 전적으로 혹은 부분적으로 재정 지원되었지만, 그것은 필연적으로의 전망을 반영하지 않습니다 대행사없이 공식적인 승인은 그렇게 유추 해서도 안됩니다. 이것은 기관 평가를 받게 및 게시를 위해 승인되었습니다.

접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration은 Cryptosporidium의 oocysts와 물에서 Giardia의 cysts의 초기 농도에 대한 대안과 효과적인 기술입니다. 중공 섬유 ultrafiltration은 기존의 필터보다 저렴합니다. 그것이 다른 수상 매트릭스의 다양한 Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts을 집중하는 능력을 가지고 있기 때문에 그것은 EPA 방법 1623에 사용되는 현재의 여과 기술에 대한 유용한 대안입니다. 대부분의 다른 여과 방식과 마찬가지로 중공 섬유 ultrafiltration은 매우 흐린 샘플과 오염하는 경향이있다. 높은 수압에 필터가 오염으로부터 초래 하리라는 않으므로 그것은 여과 실행하는 동안 압력을 모니터링하는 것이 좋습니다. Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts 이외에 중공 섬유 ultrafiltration은 박테리아와 바이러스 1-3,5,8을 집중시킬 것으로 표시되었습니다. 중공 섬유 ultrafiltration O이 방법에 utlined은 하나의 샘플에서 여러 생물을 집중하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 200 및 250 ML 사이에 최종 볼륨을 취득하면 (OO) 낭종의 손실을 초래할 수도 여분 원심 분리 단계 있으므로 농도 절차에서 중요한 마지막 단계, (단계 2.2) 피할 수있다는 것을 주목할 것입니다. retentate 병으로 모든 oocysts 또는 cysts를 강제로 충분한 액체 부피 없을 것이다 때문에 그러나 병의 볼륨이 너무 낮게 떨어뜨 수 있도록하는 것은 recoveries에 불리한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 그것은 200 및 250 ML 사이에 최종 볼륨을 유지하는 것이 좋습니다. 열 분해는 방법 1623의 산성 분해 단계에 대한 대안입니다. 이 대안이 단계는 Cryptosporidium oocyst 복구를 개선하고 하천이나 시약 물 9 중 격리 때 메서드 편차를 줄이기 위해 표시되었습니다. 산성 및 열 분해 방법 나란히 비교 시연 그 dissocia에 열을 사용소리지르는 immunomagnetic 구슬의 생물은 Cryptosporidium 및 Giardia 모두 높은 뜻 recoveries을 생산했다. 또한, Cryptosporidium 및 Giardia recoveries의 정밀도 산성 분리 구에 비해 열 분해로 처리된 시료에서 더했습니다. 농도 단계로 HFUF의 설립은 여러 유기체를 집중하는 능력을 제공함으로써 더 많은 유연성을 허용합니다. 또한 그것은 현재의 방법 1,623 여과 옵션에 대한 저렴한 대안입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 장비 / 시약 </td><td> 공급 업체 </td><td> # 카탈로그 </td></tr><tr><td> 아사히 Kasei는 25 S / R 서부 유럽 표준시 중공 섬유 ultrafilters을 Rexeed </td><td> 의료를 여세요 </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P 73 (Masterflex R-3603) 또는 동급 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex 플래티넘 - 치유) 또는 동급 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-96410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex 플래티넘 - 치유) 또는 동급 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-96410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex 플래티넘 - 치유) 또는 동급 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-96410-36 </td></tr><tr><td> I / P 정밀 Brushless 드라이브 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-77410-10 </td></tr><tr><td> I / P 쉬운로드 펌프 헤드 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> 블랙 HDPE의 티, 1 / 4 &quot;X 3 / 8&quot;× 3 / 8 &quot; </td><td> 미국 플라스틱 </td><td> 62,064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-커넥터 L / S 15-25 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EG-30613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene 강력 응용 프로그램 1 패 병 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06257-10 </td></tr><tr><td> 10 ML의 pipettes </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-678-11C </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;튜브 용 Nalgene 충전 / 방출 모자, 53B </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06258-10 </td></tr><tr><td> 압력계 </td><td> 콜 Parmer </td><td> -680-46-10 </td></tr><tr><td> 스트레이트 커플링, NPT (F), 1 / 4 &quot; </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06469-18 </td></tr><tr><td> NPT 지점 티, 천연 PP </td><td> 콜 Parmer </td><td> - 30610-75 </td></tr><tr><td> 핀치 클램프, 1 / 2 &quot; </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06833-00 </td></tr><tr><td> 잘라내기stom 적합한 DIN 어댑터 </td><td> 성형 제품 사 </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> 링 스탠드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> 링 스탠드 클램프 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 05-769 - 6Q </td></tr><tr><td> 중사님 램프 클램프, 14mm </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06835-10 </td></tr><tr><td> 나트륨 polyphosphate </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 305,553 </td></tr><tr><td> 나트륨 thiosulfate의 pentahydrate </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 72,050 </td></tr><tr><td> Antifoam Y-30 에멀젼 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> 십대 초반-80 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 패 축소 고밀도 폴리에틸렌 cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> 병 랙을 원심 분리기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ML 원추형 원심 분리기 튜브 </td><td> 코닝 </td><td> 430,776 </td></tr><tr><td> 일회용 깔때기 </td><td> 콜 Parmer </td><td> U-6122-10 </td></tr><tr><td> 병을 씻으십시오 </td><td> 콜 Parmer </td><td> U-06252-40 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> 섹시한 버킷 로터 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 양자리 SX4750 </td></tr><tr><td> 250 ML 원뿔 튜브에 대한 버킷 어댑터를 원심 분리기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 349,849 </td></tr><tr><td> 200 μl 대형 배기량 피펫 팁 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> VacuShield 필터 </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 ML의 pipettes </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads : Cryptosporidium / Giardia 콤보 키트 </td><td> 나DEXX </td><td> 73,002 </td></tr><tr><td> 50 ML 원추형 원심 분리기 튜브 </td><td> 매 </td><td> 352,098 </td></tr><tr><td> Dynal 10 파운드 라니 평면 단면 튜브 </td><td> IDEXX </td><td> 74,003 </td></tr><tr><td> 타이머 </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6 자석 </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 한 ML의 pipettes </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1.5 ML 낮은 접착 microcentrifuge 튜브 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 μl 피펫 및 대응 장벽 팁 </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 μl 피펫 및 대응 장벽 팁 </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9 인치 파스퇴르의 pipettes </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S 자석 </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> 와동 </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads의 회전 믹서 </td><td> IDEXX </td><td> 94,701 </td></tr><tr><td> 히트 블록 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> 랩 갑옷 비즈 </td><td> 연구소 갑옷 </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> 디지털 온도계 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> 인산 버퍼 식염수 1X 산도 7.4 (1X PBS) </td><td> 시그마 </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> 단일 스팟 슬라이드 </td><td> IDEXX </td><td> 30,201 </td></tr><tr><td> 유리 커버 </td><td> 코닝 </td><td> 287,018 </td></tr><tr><td> 직접 키트를 EasyStain </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 μl 피펫 및 대응 장벽 팁 </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-Diamid아니라 구-2-페닐 인돌의 dihydrochloride (DAPI) </td><td> 시그마 </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> 매니큐어네 지우기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> 킴벌리 클라크 </td><td> 34,155 </td></tr><tr><td> 보육기 </td><td> Boekel 과학 </td><td> 133,000 </td></tr><tr><td> 따뜻한 밀어 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> 집중 훈련 오일은 노스다코타 = 1.515를 입력 </td><td> 니콘 </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> DIC 기능을 갖춘 니콘 90i 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> MBA 77,000 </td></tr><tr><td> 계획 APO 100X 오일 목표 </td><td> 니콘 </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Achro 20X 계획 </td><td> 니콘 </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC 필터 </td><td> 니콘 </td><td> 96,302 </td></tr><tr><td> DAPI 필터 </td><td> 니콘 </td><td> 96,301 </td></tr><tr><td> 형광 조명기을 X-인용 </td><td> 니콘 </td><td> 87,540 </td></tr><tr><td> 렌즈 페이퍼 </td><td> 니콘 </td><td> 76,997 </td></tr><tr><td> 바이오 해저드 일회용 봉투 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> 바이오 해저드 sharps 용기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> 3 % 과산화수소 </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> 표백 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 1,952,030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> 킴벌리 클라크 </td><td> 34,790 </td></tr></tbody></table>

a modified epa method 1623 that uses tangential flow hollow-fiber ultrafiltration and heat dissociation steps to detect waterborne cryptosporidium and giardia spp.

Cryptosporidium 및 Giardia 종, 그 원인 waterborne diarrheal 질병 발생은 전세계 원생 동물문 가장 널리 두 가지입니다. 나은이 병원체의 유행을 특성화하기 위해 EPA 방법 1623가 개발하고 미국의 식수에서 이러한 유기체의 수준을 모니터링하는 데 사용된 것은 12 공급하고 있습니다. 방법은 세 가지 주요 부분으로 구성되어 있으며, 첫 번째는 원시 표면의 물이 적어도 10 패가 필터링되는 시료 농도입니다. 생물과 덫에 파편 나서 필터에서 eluted 및 추가 샘플을 집중 centrifuged있다. 메서드의 두 번째 부분은 농축 물 샘플은 특히 농축 잔해에서 기생충의 특정 제거 허용 Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts에 바인딩 immunomagnetic 구슬에 적용됩니다 immunomagnetic 분리 절차를 사용합니다. 이러한 (OO) cysts 그러면 산성 분해 proce에 의해 자석 구슬로 떨어뜨려졌다dure. 메서드의 마지막 부분 (OO) cysts는 슬라이드, 스테인드에 적용하고, 현미경으로 열거됩니다 immunofluorescence 염색법과 열거입니다. Envirochek 필터 (막 공사, 앤아버 미시건), Envirochek HV 필터 (막 공사), Filta - 맥스 필터 (IDEXX, 웨스트 브룩, MA) : 방법 1623은 물 속에 Cryptosporidium oocysts과 Giardia의 cysts를 캡처 목록에 명시된 4 가지 시료 농도 시스템을 가지고 또는 연속 흐름 원심 분리 (Haemonetics, Braintree, MA). 그러나, Cryptosporidium 및 Giardia (OO) 낭종의 recoveries는 1,14를 사용한 소스 물 매트릭스 및 필터에 따라 매우 다양합니다. 새로운 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration (HFUF) 시스템은 최근 Cryptosporidium oocysts를 복구에서보다 효율적이고보다 강력한 것으로 표시되었습니다 각종 수상 매트릭스에서 Giardia의 cysts는, 또한, 다른 캡슐 필터 옵션을보다 저렴S는 동시에 1-3,5-8,10,11을 여러 병원균을 집중하실 수 있습니다. 또한, 힐 및 동료에 의해 ​​이전의 연구들은 직접 Envirochek HV 필터 4 비해 HFUF 크게 Cryptosporidium oocysts의 recoveries를 개선한다는 보여주었다. 현재의 방법에 대한 추가적인 수정은 또한 방법의 성능을 향상시키기 위해보고되었습니다. 열 분해하여 산성 분해 절차를 교체하는 것은 어떤 매트릭스 9,13의 자석 구슬에서 Cryptosporidium를 분리에서보다 효과적인 것으로 표시되었습니다. 이 프로토콜은 열 분해 단계로 새로운 HFUF 여과 시스템을 사용하는 수정된 방​​법 1623에 대해 설명합니다. 이 수정된 방​​법으로 HFUF의 사용은 현재 EPA 방법 1,623 여과 옵션 저렴한 대안이며, 여러 생물의 농도를 허용함으로써 더 많은 유연성을 제공합니다.

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A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

이 프로토콜은 waterborne의 검출을위한 다른 단계로 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 샘플 농도 시스템의 사용 및 열 분해를 설명<em&gt; Cryptosporidium</em&gt;과<em&gt; Giardia</emEPA 방법 1623을 사용하여&gt; 종.

Waterborne를 검색하는 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 및 열 분해 단계를 사용 수정일 EPA 방법 1,623<em&gt; Cryptosporidium</em&gt;과<em&gt; Giardia SPP.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

20.3K 조회수.  Office of Research and Development, US Environmental Protection Agency. 이 프로토콜은 waterborne의 검출을위한 다른 단계로 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 샘플 농도 시스템의 사용 및 열 분해를 설명 Cryptosporidium과 Giardia 종.

비디오: A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

연구

면역학 및 감염병학

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜<em&gt; 아노펠레스</em&gt; 종.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

루트 - 매듭 Nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 Meloidogyne SPP.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

옥내 핵산 흐름 Cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (LNA 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 RNA 감지하는 방법

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

집중 Waterborne 바이러스와 농업 Zoonotic 병원균에 대한 유리 양모 필터

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기<em&gt; 체외</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Dalbavancin에 대한 참조 국물 Microdilution 방법<em&gt; 체외</em호기성 박테리아의 성장&gt; 감수성 테스트

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...