우리는 pLPCX-히스톤 H2-GFP 플라스미드를 제공 S. 테일러에게 감사합니다. 우리는 지속적인 지원 R. Mertelsmann 감사드립니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft에 의해 지원되었다.

1. 현미경 상공 회의소 슬라이드에 U2OS 기반 Cyclin B-SNAP 리포터 세포 (클론 11 셀 6) 심는 <ol><li> 최소 48 시간의 로그 단계에서 비동기 적으로 성장 할 수 있었다 subconfluent SNAP 기자 세포를 Trypsinize. </li><li> 8 잘 현미경 챔버 (세포의 지속적인 배포)과 함께 일하는 것. </li></ol> 현미경 챔버의 전체 표면 원심 분리기 만 세포에서 일정한 분포 8 잘 현미경 챔버에 세포를 퍼 뜨리고 및 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체의 350 μl (10 % 태아 소 혈청, 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충에 resuspend에 대한 나트륨 pyruvate). 현미경 챔버 (그림 2)에 세포 현탁액을 전송합니다. 8 잘 현미경 챔버 (중앙에 최대 세포 밀도)의 협력을 참조하시기 바랍니다. 현미경 chamb의 중심에 높은 밀도로 세포의 퍼 뜨리고 들어음, 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 300 μl로 챔버를로드합니다. 현미경 챔버의 중심 (그림 2)주의 깊게 5,000 셀을 추가합니다. 96 잘 특별 광학 플레이트 (세포의 지속적인 배포)과 함께 일하는 것. 잘의 전체 표면에 걸쳐 일정한 분포에서 96 잘 플레이트로 세포의 퍼 뜨리고를 들어, 5,000 세포를 원심 분리기와 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 300 μl에 resuspend. 96 - 웰 플레이트에 세포 현탁액을 전송합니다. 필요한 세포 함유 우물의 총 수에 따라 휴대폰 번호 및 정지 매체의 총 부피 (그림 2)를 조정할 수 있습니다. 96 잘 특별 광학 플레이트 (중앙에 최대 세포 밀도)의 협력을 참조하시기 바랍니다. 96 잘 플레이트로 세포의 시딩를 들어, 신중하게 smal에 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체의 15 μl에 1,500 셀을 추가잘의 중심 (그림 2)에 세포의 성장에 제한을 달성하기위한 각도의 중심부에 난 드롭. <ol start="3"><li> 시드 세포 표준 세포 배양 조건 (37 ° C, 100 % 공기 습도, 5 % CO 2)에 따라 최소 18 시간에 성장 할 수 있습니다. </li></ol> 2. SNAP 기판과 리포터 세포의 착색 <ol><li> 전에 착색 절차의 시작 부분에 30 분은 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체의 aliquots 37까지 따뜻하게 할 수 있습니다 ° C. </li><li> SNAP 기판의 취급이 용이합니다 (우리의 경우 TMR 스타에서) -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 400 μm의 주식 솔루션에 집중을 얻기 위해 DMSO에 TMR 스타를 해산 </li><li> 이전 착색에, 1 μm의 최종 라벨 농도를 얻기 위해 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C) 200 μl에 TMR 스타 주식 솔루션의 0.5 μl를 희석. </li><li> 비동기 적으로 성장하는 세포의 정상적인 성장 매체를 제거하고 리터에 품다표준 문화 조건에서 25 분을 위해 매체를 abeling. </li><li> 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C)와 중간 및 세척 세포 네 번 라벨 제거합니다. 30 분을위한 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C) 300 μl에 세포를 배양. 이전 현미경을 운반에 잔류 언 바운드 SNAP 기판을 제거하는 신선한 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C)와 매체를 교체하십시오. </li><li> 미리 예열에 스티로폼 상자에 현미경으로 전송 셀 (37 ° C) 온도 편차를 최소화하기 위해 열 블록. </li></ol> 3. 형광 강도 측정 <ol><li> 전에 분석에 두 시간 ° C 건조 모드에서 원하는 온도로 모든 구성 요소를 사용하여 전체 현미경을 가져다하기 위해 37 기후 챔버의 공기 온도를 조정합니다. 사전 가열 습도를 설정하기 전에 현미경에 결로 및 후속 손상을 방지하는 것이 중요합니다. </li><li> 공기 습도 t을 조정O 60% 및 분석의 시작하기 전에 CO 2-5%. </li><li> 스캔 ^ R 취득 소프트웨어를 시작하고 표준 설정 (표 1 참조) 정의합니다. </li><li> 분석 할 우물의 위치를​​ 정의합니다. </li><li> Δt (수집 사이클 타임) 및 취득주기의 절대 수를 정의합니다. </li><li> 우물의 더 많은 분석이 필요하다면, 하드웨어 자동 초점을 선택, 그렇지 않으면 혼자 소프트웨어 자동 초점을 사용하기에 충분합니다. </li><li> 인수를 시작하고 처음 두 인수 사이클에 대해 감독한다. 필터가 변경되어 해당 TMR 스타 이미지 (그림 3) 인수되기 전에 현미경 해당 채널의 첫 번째 이미지의 후속 취득과 함께 히스톤 H2-GFP 신호에 초점을 맞출 것이다. 이것은 다시 다음주기를 반복하기 전에 잘 내의 검사 할 우물의 각에 대한 모든 위치에 대해 반복됩니다. </li></ol> 4. Proteolytic 프로필 U 분석스캔 ^ R을 노래 <ol><li> 스캔 ^ R 분석 소프트웨어를 시작하고 세포 핵으로 이미지를 분석과 같은 신호 강도와 인근 세포를 분리하는 데 큰 도움이 분수령 알고리즘을 기반으로하는 임계 값을 사용하여, 주요 개체로 정의 된 히스톤 H2-GFP에 의해 시각화. 세포질과 핵으로 구성된 subobject는 TMRstar 분석을 위해 생성되어야합니다. (주 객체의 중요 속성 X와 Y 위치, 시간, 및 최대이며 주요 개체와 TMRstar subobject을위한 영역으로 나눈 전체 강도에 대한 GFP의 농도를 의미합니다.)이 분석 과정은 큰 데이터로 인해 몇 시간이 걸릴 수 있습니다 수량. </li><li> 분석 주요 개체 (그림 4)에 할당 된 시간이 지남에 따라 subobject 말은 TMR 별 형광 강도를 (셀 추적), 시각화 모드를 추적 변경합니다. 검사 할 셀의 수는 적어도 140 사이클을 지속 해당 측정에 게이팅 의해 H2-GFP의 높은 최대 강도로 좁혀 할 수 있습니다. 찾고세포의 큰 숫자에 첫 번째 대표하고 객관적인보기 (그림 4) 있습니다. </li><li> 단일 세포 수준 (그림 5A)에서 동시에 히스톤 H2-GFP 및 TMR 스타 형광를 시각적으로 관심 셀 추적을 선택합니다. </li><li> 관심있는 셀을 마우스 오른쪽 클릭을 사용하고 히스톤 H2-GFP 및 cyclin B-SNAP 매번 지점에 대한 TMR 스타의 그림에 내보낼 사진 갤러리를 생성합니다. </li><li> 스캔 ^ R 분석 소프트웨어 및 게이트 관심 셀이 X 대 Y 점 플롯 (그림 5B)에 표현된다 지역의 인구 모드로 변경합니다. </li><li> 게이트 지역에 새로운 점 플롯 창을 적용하고 시간이 지남에 따라 TMR 스타 형광 강도 (그림 5C)를 의미 표시합니다. </li><li> 자세한 계산 용 Microsoft Excel로 내보내기 데이터 (시간과 형광 강도). </li></ol> 5. 대표 결과 무화과우레 5D와 5E 호야는 셀의 TMR 별 형광 강도 곡선으로 표현 cyclin B 동력학을, 묘사 그 염색체 misalignment의 흔적 (그림 5E 호야)없이 일반 유사 분열을 통해 진행. 셀 prometaphase 6 입력 할 때 isomorphic 창 (다이어그램에서 밝은 영역)에 도달 할 때까지 핵 봉투 고장 (NEBD 등 빨간색 삼각형으로 표시)에 따라 세포질의 압축되면, TMR 스타 형광 강도는 갑작스런 증가를 보여줍니다. 형광 강도는 prophase와 metaphase를 통해 셀 수익금만큼 안정적인 수준으로 유지 한 후 염색체의 모든 (그림 5D와 5E 호야) 안정적인 metaphase 플레이트를 설립 한 후 빠른 속도로 떨어지기 시작합니다. 이 드롭 anaphase (곡선에 파란색 점) 동안 염색체 분리를 앞에. 후반 유사 분열에서 염색질은 decondense 시작 (파란색 바)과 형광 강도 곡선이 접근하는 동안 셀은 계면 형태를 채택유사 분열 (그림 5D와 5E 호야) 전 고원보다 낮은 고원. <table border="1"><tbody><tr><td> 자동 초점 설정 </td><td> 히스톤 H2-GFP (주 객체 수집 설정) </td><td> TMR 스타 라벨이 Cyclin B-SNAP (수집 설정) </td><td> 취득주기 시간 반복 </td></tr><tr><td> 거친 자동 초점 + / -39 μm 24 층 정밀 자동 초점 + / -5.4 μm 14 층 </td><td> GFP 필터 설정 : 노출 시간 : 100 밀리 초 빛의 세기 : 25 % </td><td> TRITC 필터 설정 : 노출 시간 : 150 밀리 초 빛의 세기 : 33.3 % </td><td> 2-5 분. </td></tr><tr><td> GFP 필터 설정 : 노출 시간 : 12 밀리 초 빛의 세기 : 12.5 % </td><td></td><td></td><td> 최대 지속적인 분석의 48 시간 (60 %의 감소 공기 중 습도에 의해 제한)에 </td></tr></tbodY&gt; </table> 표 1. cyclin B의 proteolysis의 분석에 사용 된 표준 설정입니다. 히스톤은 H2-GFP는 cyclin B-SNAP 형광 강도의 측정을 위해 초점 비행기를 정의하는 참조 구조로 사용되었다. 누적 광독성을 피하기 위해 이미지 수집 설정에 비해 초점 절차를 수행하는 동안 광도가 낮은 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> 1 그림. 내생 단백질과 유사한 열화 특성과 키메라 cyclin의 B 유도체의 표현을 통해 cyclin B의 proteolysis의 측정의 개략도. 펄스 - 체이스 라벨 후 형광 강도의 하락은 APC / C-활동을 측정하기위한 한 방법입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> 그림 2. 8도 슬라이드 또는 96 잘 접시에 세포의 분석.의 정기 배포우물의 표면에 걸쳐 셀 300 μl의 최종 볼륨에 resuspension에 의해 달성된다 만 단일 또는 몇 위치를 수동으로 분석을 위해 정의되는 경우 권장합니다. 중심 지역에서 세포의 농축은 prefilled 또는 빈 우물의 중심에 셀의 추가에 의해 달성된다. 이 기술은 다른 우물의 자동 이미지 수집의 경우 권장합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> 그림 3. 데이터 수집의 순서가. 히스톤 H2-GFP의 A) 검색이 유사 분열 동안 염색체 정렬의 초점 평면 정의 및 모니터링에 사용됩니다. B) TMR 스타 형광 강도의 형광 강도는 cyclin B-SNAP 표시된 펄스 체이스의 절대 금액을 측정하기위한 한 방법입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> 4 그림. 평균 TMR 별 대표 스캔 ^ R 분석 소프트웨어 기반의 묘사시간이 지남에 따라 형광 강도 (면적으로 나눈 총 TMRstar 강도). 대표 셀 추적 (파란색)의 선택. 해당 이미지 (오른쪽에 표시)의 동시 시각화를 허용 히스톤 H2-GFP (녹색)와 cyclin B-SNAP (빨간색). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> 그림 5. A + B) XY-점 음모에 관심있는 셀을 나타내는 점의 게이팅을위한 예. C) 시간이 지남에 따라 평균 TMRstar의 형광 강도 (면적으로 나눈 총 TMRstar 강도)의 시각화는 점 플롯을 사용합니다. D + E) Microsoft Excel에서 생성으로 NEBD (핵 봉투 고장)와 염색질 decondensation (파란색 막대) 사이 isomorphic 창 (그림에서 brigher 필드)와 cyclin B-SNAP 대표 형광 강도 곡선. Anaphase는 t로 표시됩니다곡선에서 그는 파란색 점은. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 영화는 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">보완 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 여기 cyclin B의 proteolysis 및 염색체 정렬의 동시 모니터링을 용이하게 라이브 셀 이미징 기반의 접근 방식을 제시한다. 이 방법은에서 mitotic 컨트롤의 연구는 단일 세포 수준에서 세포 인구를 교란되지 않은 수 있습니다. Cyclin B 저하 곡선은 APC / C의 활동에 직접 통찰력을 촉진하므로 간접적으로 SAC 6의 상태를 반영합니다. 이 방법은 비록 스캔 ^ R 소프트웨어를 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 제품의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 리포터 세포 라인 </td><td> 생성 자체는 6 설명 </td><td> 11 기자 세포를 복제 (U2Os 기반 cyclin B-SNAP 표현 세포) </td><td></td></tr><tr><td> Retroviral cyclin B-SNAP 표현 벡터 </td><td> 생성 자체는 6 설명 </td><td> pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred 무료 DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> FCS, 나트륨 pyruvate, 페니실린 / strepto-mycin과 보완 필요 </td></tr><tr><td> SNAP-세포 TMR-스타 </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> S9105S </td><td> DMSO의 주식 솔루션을 400 μM </td></tr><tr><td> 특별 Opstics 판, 잘 96 </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-슬라이드 8 잘 ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80,826 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 단위 </td><td> 하늘 </td><td> 기후 챔버와 IX-81 역 현미경 </td><td></td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 하늘 </td><td> UPLSAPO 20x 목적 (NA 0.75) </td><td></td></tr><tr><td> 수집 소프트웨어 </td><td> 하늘 </td><td> 스캔 ^ R 취득 소프트웨어 (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> 분석 소프트웨어 </td><td> 하늘 </td><td> 스캔 ^ R 분석 소프트웨어 (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

세포 분열 동안 두 딸 세포 사이의 염색체의 동등한 배포 유전자 안정성 1 보장을위한 전제 조건입니다. 염색체 분리시 부정확 한이 종의 특징이며 진행성 질환 2-4와 관련된. 스핀들 조립 검사 점 (SAC)는 모든 단일 염색체는 mitotic 스핀들 1 안정적인 바이폴라 첨부 파일을 확립 할 때까지 다시 metaphase에서 세포를 보유하고 mitotic 감시 메커니즘입니다. SAC는 활성화와 간섭에 의해 그 기능을 발휘 APC / C securin와 cyclin B의 proteolysis하므로 염색체 분리와 mitotic 출구를 차단하는 subunit Cdc20. 염색체의 부적절한 첨부 파일 SAC 신호의 입을 방지하고 문제가 염색체 missegregation, aneuploidy와 악성 growths 일을 피하기 위해 해결 될 때까지 APC / C Cdc20의 지속적인 억제가 발생합니다. 내가 연설을 대부분의 연구APC / C에 의존 proteolysis에 부적절한 염색체 첨부 파일의 nfluence는 미소로 염색체 첨부 파일을 방해하는 약물을 depolymerizing 또는 미세 소관 - 안정화를 사용하여 스핀들 혼란을 이용했다. 미세 소관의 동력학과 간섭이 교통 및 중요한 규제의 국산화에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이러한 절차는 인공 효과, 5를 일으킬 위험을 맺습니다. SAC는에서 유사 분열 동안 APC / cyclin B의 C-의존 proteolysis을 방해하는 방법 공부하는 세포 집단을 교란되지 않은, 우리는 허용 히스톤 H2-GFP-기반 시스템을 설립 metaphase mitotic 염색체의 정렬 및 cyclin B 6 proteolysis의 동시 모니터링 . proteolytic 프로필을 묘사하기 위해, 우리는 C-터미널 SNAP 잔기 6 (그림 1) 키메라 cyclin의 B 기자 분자를 생성. 자체 라벨 반응에서 SNAP-잔기가 함께 공유 결합 채권을 형성 할 수 있습니다alkylguanine - 반송파 (SNAP 기판) 7,8 (그림 1). SNAP 기판 분자 쉽게 사용할 수 있으며 다른 fluorochromes의 폭 넓은 스펙트럼을 가지고 다니십시오. 키메라 cyclin B-SNAP 분자는 성장 매체 7 (그림 1)에 막 투과성 SNAP 기판의 추가에 표시됩니다. 라벨 반응 후, cyclin B-SNAP 형광 강도는 펄스 추격전 반응과 같은 방식으로 형광 강도 cyclin B 저하 6 (그림 1)의 수준을 반영에 떨어. Google 시스템은 병렬 셀 (또는 여러 세포 집단)의 큰 숫자 mitotic APC / C에 의존 proteolysis의 모니터링을 용이하게한다. 따라서, 시스템은 에이전트 / 전환을 anaphase 할 metaphase에서 proteolytic 활동을 방해 할 수있는 작은 분자를 식별 할 수있는 귀중한 도구가 될 수 있습니다. 또한, 유사 분열 동안 cyclin B의 합성으로 최근 중요한 mechanis으로 제안 된안정적인 cyclin B 표현 수준 9,10를 유지하여 마우스와 인간의 mitotic 블록을 조성하는데있어,이 시스템은 우리가 균형 잡힌 평형 6 항 중 어느 한 요소로 cyclin의 B의 proteolysis를 분석 할 수있게.

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

전환이 anaphase-추진 단지 (APC / C)에 의존 ubiquitination과 여기 cyclin B.의 후속 파괴를, 우리는, 펄스 - 체이스 라벨에 따라, 시스템을 설립 전체 세포 인구에서 cyclin B의 proteolysis를 모니터링 할 수 있으며를 통해 실행됩니다 anaphase에 Metaphase mitotic 검문소에 의한 간섭의 검색을 용이하게한다.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.4K 조회수.  University Medical Center Freiburg. 전환이 anaphase-추진 단지 (APC / C)에 의존 ubiquitination과 여기 cyclin B.의 후속 파괴를, 우리는, 펄스 - 체이스 라벨에 따라, 시스템을 설립 전체 세포 인구에서 cyclin B의 proteolysis를 모니터링 할 수 있으며를 통해 실행됩니다 anaphase에 Metaphase mitotic 검문소에 의한 간섭의 검색을 용이하게한다.

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Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

연구

생물학

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

인간의 사후 뇌 조직에서 단세포 집단의 고품질 RNA 구하기

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

단일 세포의 Zebrafish의 분할 시계의 이미징을위한 분산 Presomitic 중배엽 세포 배양의 생성

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

단일 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스 분석

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.