우리 기금 (CBET-0846259)에 대한 NSF 인정하고 싶습니다.

이 프로토콜에서 참조하는 모든 미디어, 버퍼 및 솔루션의 준비를 위해 표 1을 참조하십시오. 1. AHA-라벨 아데노 바이러스의 제작 <ol><li> 그들이 80에 도달하기 전까지 37 ° C에서 HEK 293 세포 성장 매체에 유지 인간의 배아 신장 세포 때문이죠 100-mm 조직 배양 접시 (HEK 293)를 (표 1 참조) 준비 - 90 % confluency. (참고 :. 90% 이상 confluency와 문화가 감염하고 원하는대로 바이러스를 생산하지 않을 수 어려울 수 있습니다) </li><li> 첫째 후 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (1 ×) 1 ML에서 한 분 동안 세포를 잠복기, TD 버퍼의 5 ML과 함께 한 rinsing, 성장 매체를 제거하여 요리 중 하나에서 셀을 풀어. </li><li> HEK 293 세포 성장 매체 9 ML을 추가하고이 요리에서 수확 HEK 293 세포의 수를 세어 hemocytometer를 사용합니다. multiplicit를 사용하여 감염에 필요한 아데노 바이러스 타입 5 (Ad5)의 양을 계산하기 위해이 번호를 사용하여10 PFU / 세포의 감염의 Y (방어) 값. 정상 Ad5 들어, 감염 지수 (입자의 총수에 대한 전염성 입자의 비율) 일반적으로 1시 20분는 사실을위한 계정. </li><li> 감염 버퍼의 10 ML을 준비합니다. </li><li> 천천히 TD 버퍼의 5 ML로 씻어 다음 10 남은 문화와 요리에서 HEK 293 세포 성장 매체를 제거합니다. 1 시간 동안 37 ° C에서 각각의 접시와 부화 감염 버퍼 1 ML을 추가합니다. 이 감염 기간 동안 부드럽게 15 분 간격으로 측면으로 각 문화 요리 측을 신난다. </li><li> 감염 후 18 시간 동안 37 ° C에서 신선한 HEK 293 세포 성장 매체와 부화 9 ML에 추가합니다. </li><li> 아하 라벨 매체 (또는 컨트롤에 대한 컨트롤 매체들을 만났고) 100 ML을 준비합니다. 레이블링 미디어를 준비하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 집중 재고 솔루션을 필터링해야합니다. </li><li> 신중하게 (그래서 같은 감염된 세포를 멀리 씻어 없습니다) 18 시간 후 HEK 293 세포 성장 매체를 제거ND는 TD 버퍼의 5 ML 각 문화 접시를 씻는다. </li><li> TD 버퍼 세척 용액을 제거하고 각 문화 접시에 아하 라벨 매체의 10 ML에 추가합니다. 컨트롤의 경우 메티오닌 제어 매체는이 단계에서 대신 아하 라벨 매체를 사용해야합니다. </li><li> 6 시간 동안 37 ° C에서 매체를 레이블링에 감염된 세포를 품어. 레이블은 12 사이에 언제든지 실시 가능 - 24 시간 이후 감염되지만이 기간이 6 시간 이하 여야한다. 보장 감염이 크게 줄어들되지 않는 동안이 간격은 바이러스 구조 단백질 번역과 중복을 최대화하기 위해 결정되었다 7. </li><li> 신중하게 라벨 매체를 제거하면 이렇게 같은 세포를 중단하는 수 없습니다. 각 요리에 신선한 HEK 293 세포 성장 매체의 10 ML을 추가하고 또 다른 18 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 이 단계 동안에 감염된 세포의 손실을 최소화하기 위해서는 전적으로 라벨 솔루션을 제거할 필요는 없습니다. HEK 293 세포 성장 매체는 M의 초과를 포함동부 표준시 이는 잔여 아하을 outcompete 것입니다. </li><li> 정화를 위해 3 단계로 진행합니다. </li></ol> 2. Azido - 설탕 - 라벨 아데노 바이러스의 제작 <ol><li> 최대 및 단계 1.5를 포함한 AHA-라벨 아데노 바이러스 생산이라는 절차를 따르십시오. </li><li> Azido - 설탕 라벨 매체의 100 ML을 준비합니다. </li><li> 44 시간 동안 37 ° C에서 신선한 Azido - 설탕 라벨링 매체와 부화 10 ML과 세포를 커버. </li></ol> 3. Azide 라벨이 표시된 Adenoviral 입자의 정제 <ol><li> 각 문화 요리와 원뿔 튜브로 전송에서 감염된 세포와 함께 미디어를 제거합니다. 4에서 10 분 동안 2천g에서 원심 ° C. 표면에 뜨는를 제거하고 TD 버퍼의 펠렛을 (10 요리 당 TD 버퍼 8 ML 사용) resuspend. </li><li> 액체 질소와 37 ° C의 물을 욕조의 Dewar 플라스크를 사용하여 반복 (3 이상) 냉동 해동 사이클에 의해 감염된 세포를 Lyse. 10 분 동안 2천g에서 원심 분리기4에 ° C 뜨는에서 세포 파편을 분리합니다. </li><li> 첫번째 울트라 클리어 원심 튜브에 1.25 G / ML CsCl 용액 2.5 ML을 pipetting하여 CsCl 밀도 기울기 원심 튜브를 준비합니다. 그런 다음 천천히 그라디언트 인터페이스를 방해하지 않도록 돌보는 1.4 G / ML CsCl 솔루션의 2.0 ML을 추가하는 튜브 하단에 위치의 팁과 피펫을 사용합니다. </li><li> CsCl 밀도 구배 관의 꼭대기에서 단계 3.2에서 뜨는을 피펫 및 튜브를 채우기 위해 필요한 추가 TD 버퍼 경우. 15에서 1 시간을위한 125,000그램에서 스윙 버킷 로터 ° C ultracentrifuge에서에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> ultracentrifugation 완료 후, 바이러스 입자는 두 CsCl 솔루션의 인터페이스에서 두꺼운 흰색 밴드로서 표시한다. 솔루션 dropwise 드레인 수 있도록 무균 바늘과 튜브의 하단에 작은 천공을 만듭니다. </li><li> 두꺼운 흰색 밴드를 모아서 어느 끝, 라벨 Ad5 입자를 포함한다g 보험 초과 CsCl 솔루션을 제외할 수 있습니다. 바이러스 레이어 위에 밴드 것입 세포 단백질 수집을 피하십시오. 또한 약간 두꺼운 흰색 바이러스 밴드 위에 라이터 레이어를 형성 빈 virion의 capsids을 제외할 수 있습니다. </li><li> 선택적으로 레이블 Ad5 입자의 최종 정화를 수행합니다. 3.6 단계에서 4-ML ultracentrifuge 튜브에 수집한 분수를 추가하고 1.35 G / ML CsCl 용액으로 튜브를 입력하십시오. 15 ° C에서 18 시간 동안 12만5천그램에서 원심과 같이 3.5 및 3.6에 설명된대로 튜브의 중간에 형성 두꺼운 흰색 밴드를 수집합니다. (바이러스 titer가 낮은 경우, 흰색 밴드는 두 번째 원심 분리 후 보이지 않을 수도 있고, 그것이 표시된 바이러스를 복구할 수 없습니다됩니다.) </li><li> 오랜 기간 동안 바이러스 입자의 저장 용량은 수집된 바이러스 추출물의 투석은 바이러스 저장소 버퍼에 대해 수행해야합니다. -80 ° C.에 dialyzed 바이러스 샘플을 저장 </li></ol> 4. 리스트레인 프로모션 Azide-Alkyne Cycloaddition를 사용 Alkyne 프로브와 수정된 Adenoviral 입자의 gation (SPAAC) <ol><li> 바이러스 스토리지 버퍼에 azide으로 수정한 Ad5 50 μl의 솔루션으로, SPAAC의 라벨링 솔루션의 0.25 μl를 추가합니다. (상용 무한 alkynes의 venders 목록은 시약의 테이블 참조). </li><li> 실온에서 하룻밤을 수행하기 위해 스트레인 추진의 cycloaddition 반응을 허용합니다. 불빛에 민감한 프로브 (예 TAMRA)를 사용하는 경우, 알루미늄 호일과 반응 용기를 포괄합니다. </li><li> 6 단계에 따라 레이블이 바이러스를 정화. </li></ol> 5. Deoxygenated 분위기에서 구리 (I) 촉매 Azide-Alkyne의 Cycloaddition (CuAAC)를 사용 Alkyne 프로브와 수정된 Adenoviral 입자의 결합 <ol><li> 구리의 장소 7.2 밀리그램 (I) Eppendorf 튜브에 브로마이드 (CuBr) 분말은 알루미늄 박으로 덮여. </li><li> 두 번째 Eppendorf 튜브에 DMSO의 피펫 1 ML. </li><li> 준비삼분의 일 Eppendorf 튜브에 CuAAC의 라벨링 솔루션의 50 μl. alkyne 프로브는 불빛에 민감한 경우 알루미늄 박으로 표지 (예 : TAMRA-Alkyne). </li><li> 6 시간 동안 deoxygenated 장갑 가방 속에 세 개의 Eppendorf 튜브, uncapped를 놓습니다. 모든 샘플 CuAAC 반응의 완료까지 장갑 가방 내부에 유지됩니다. </li><li> 5.4 단계에 따라 deoxygenated되었습니다 둘 다, CuBr 분말 7.2 MG로 DMSO의 1 ML을 추가하여 CuBr 50 × 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> 5.4 단계에 따라 deoxygenated되었습니다 CuAAC 라벨 솔루션, 50 μl에이 CuBr 주식 솔루션 1 μl를 pipetting하여 CuAAC 반응을 시작하라. 장갑 가방 안에서 12 시간 동안 진행하는 반응을 허용합니다. </li><li> 6 단계에 따라 레이블이 바이러스를 정화. </li></ol> 6. 라벨 바이러스 입자의 정제 및 저장 <ol><li> Centri-9월 겔 여과 스핀 C를 사용하여 레이블이 붙은 바이러스 샘플을 정화제조 업체의 지침에 따라 바이러스 저장소 버퍼와 equilibrated olumns. </li><li> 양자 택일로, 정화는 바이러스 저장소 버퍼에 대한 투석에 의해 수행 할 수 있습니다. </li><li> 레이블이 붙은 바이러스 입자는 -80 ° C.에 저장해야합니다 </li></ol> 7. 라벨 아데노 바이러스 및 형광등 젤 스캔 SDS-PAGE <ol><li> 10 분 대한 분류 바이러스와 종기 투석을 20 μl 20 μl Laemmli 샘플 버퍼 (2 ×)를 추가합니다. precipitates 어떤 불용성을 제거하는 30 초 동안 샘플을 원심 분리기. 잔여 구리는 정화 후 있으면 샘플을 끓고 것은 시각화하는 동안 어려움을 초래, SDS-PAGE 젤의 단백질 굵은 줄무늬가 발생할 수 있습니다. 이 경우이 단계에서 샘플의 끓는를 ...없이 지내다. </li><li> 전기 영동 세포로 겔 카세트를 첨부하고 실행 버퍼를 추가합니다. 바이러스성 단백질 샘플 우물의 필요한 숫자를로드합니다. 물론 사전에 왠 일이야를로드하는 하나를 사용하여네드 분자량 마커. 200으로 1 시간을위한 젤을 실행 V. 전체 기간 동안에 알루미늄 박으로 덮여 전기 영동 세포가 형광단 라벨의 photobleaching 줄이기 위해 유지. </li><li> 최고 해상도와 모든 자유 형광단를 제거하는 경우, 추적 염료는 전기 영동 중에 젤 부족 수 있습니다. 전기 영동을 중지하고 신속하게 형광등 겔 스캐너로 젤을 전송하고 적절한 파장 (TAMRA에 대한 574 nm의)에서 형광 방출을위한 젤을 검사합니다. </li><li> 각 바이러스성 입자의 복합 염료 분자의 갯수는 몇 가지 표준 TAMRA의 농도의 형광을 측정하고 단계 7.3에서 샘플을 가지고 비교하여 계량하실 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 SDS-PAGE &amp; TAMRA - 복합 Ad5의 형광 겔 검사의 관찰된 결과는 그림 3에 표시됩니다. 이러한 형광 겔 스캔 샘플 modi에서 수행 되었으나프로브가 SPAAC 통해 출혈도 잡았 때 CuAAC 통해 얘기 들이었다, 결과는 비교할 수 있어야합니다. 이러한 겔 스캔에 따르면 세 Ad5 capsid 단백질 (Hexon, Penton 및 섬유)의 수정에 아하 라벨 결과, 설탕 라벨링에만 섬유 capsid 단백질을 수정하면서. 또한, 아하 농도의 증가 (4 MM 대 32 MM)가 아하의 정관의 큰 정도의 결과지만, 또한 감염을 줄일 보여왔다. 이전 결과 7 4mm짜리에서 생산 Ad5위한 아하, 노출 메티오닌 사이트의 대략 5 % 32 밀리미터 아하가 사용될 때이 숫자는 10 %로 증가와 함께 TAMRA - 수정된 것을 나타냅니다. 이것은 각각 약 280 및 510, Ad5 입자 당 염료 라벨이 사이트에 해당합니다. 설탕 - 라벨 1의 분석은 대략 22 Ad5에서 36 글리코 실화 사이트가 azido 설탕에 의해 점령과 이후 TAMRA으로 표시되는 지적했다. 설명된대로 열 조직 배양 플레이트는 azide으로 수정한 Ad5를 생산하기 위해 사용하는 경우<html> 이 프로토콜에서, 200 - azide으로 수정한 바이러스 300 μl는 약 1.5의 titer × 10 12 입자 / ML로 단계 3.6에서 수집한 흰색 밴드에서 얻을 수 있습니다. 이 절차의 일반적인 난이도는 낮은 바이러스 titer에 의한 것이이 정화 단계에서 바이러스 밴드의 부재이다. 감염 후 접시에서 느슨하게지게하는 - - 1 단계 기간 동안 rinsing 동안 이것은 일반적으로 하나 이상 또는 이하 - 지류, 또는 세포를 떠내려가는하여있는 세포를 감염의 결과입니다. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 프로토콜 개요. Azide 함유 아하 또는 GalNAz 처음 아데노 바이러스 입자에 통합됩니다. 형광 alkyne 프로브로 내고 그 다음 &quot;클릭&quot;화학을 통해 수행됩니다. 마지막으로, SDS-PAGE는 형광 프로브의 결합을 설명하는 데 사용됩니다. igure 2 &quot;/&gt; 그림 2. 진입 alkyne 프로브의 결합 azide-수정된 드 산소 이하 () SPAAC, (B) CuAAC 그리고 (c) 산소 분위기를 통해 바이러스를. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. TAMRA - Alkyne와 CuAAC 활용 후 azide-라벨이 아데노 바이러스 타입 5 (Ad5)의 SDS-PAGE의 형광 스캔. () 아하의 두 농도를 이용하여 Ad5 AHA-라벨. 레이블이 증가 아하 농도와 함께 증가 라벨의 범위로, 아데노 바이러스 Hexon, Penton 및 섬유 capsid 단백질에서 발생하는 것으로 나타납니다. (B) AC 4 GalNAz-라벨 아데노 바이러스는 섬유 capsid 단백질을 분류하는 것 같아요. <table border="1"><tbody><tr><td> 용액 </td><td> 준비 </td><td> 노트 </td></tr><tr><td> Ad5 저장 버퍼 </td><td> 5 MM 트리스-HCL 버퍼 (산도 8.0)가 0.5 밀리미터를 포함 MgCl 2, 50 MM NaCl, 25 % (V / V) 글리세롤 및 0.05 % (W / V) 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> -20 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> Ad5 감염 버퍼 </td><td> 2퍼센트 (V / V) 소 송아지 혈청, 1 × TC 솔루션 Ad5 저장 버퍼 (방어 10 PFU / 전지 및 1시 20분의 감염 지수를 사용하여 결정 볼륨). TD 버퍼를 사용하여 최종 볼륨에 대한 해결책을 지참 </td><td> Ad5 농도는 자외선을 흡수를 통해 확인할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> TC 솔루션 (200 ×) </td><td> 136 MM CaCl 2, 100 밀리미터 MgCl 2 </td><td> 4에서 저장 ° C </td></tr><tr><td> TD 버퍼 </td><td> 137 MM NaCl, 5 KCl 밀리미터, 밀리미터에게 나 2 HPO 4, 25 MM 트리스-HCL, 산도 7.5를 0.07 </td><td> 4에서 저장 ° C </td></tr><tr><td> HEK 293 세포 성장 매체 </td><td> Dulbecco의 수정일 이글 배지 (DMEM)는 10 % (V / V) 소 송아지 혈청 (BCS)와 1 % (V / V) 펜 Strep과 보충 </td><td> 4에서 저장 ° C </td></tr><tr><td> Cys 증권 솔루션 (100 ×) </td><td> DMEM는 (-메트로 /-Cys) 200 MM L-시스테인과 보충 </td><td> 사용하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 신선하고 필터를 준비합니다. </td></tr><tr><td> 아하 스톡 용액 (25 ×) </td><td> DMEM는 (-메트로 /-Cys) 100 MM L-Azidohomoalanine로 보충 </td><td> 사용하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 신선하고 필터를 준비합니다. </td></tr><tr><td> 아하 라벨 매체 </td><td> DMEM는 (-메트로 /-Cys) 2 MM L-시스테인 10% BCS, 아하 주식 용액 (1 ×)로 보충 </td><td> 사용하기 전에 신선한 준비합니다. 이건 4 MM C에 해당아하의 oncentration 다른 농도는 (대표 결과 참조) 사용될 수 있지만. </td></tr><tr><td> 메트로 주식 용액 (25 ×) </td><td> DMEM는 (-메트로 /-Cys) L-메티오닌 100 MM로 보충 </td><td> 사용하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 신선하고 필터를 준비합니다. </td></tr><tr><td> 메트로 제어 매체 </td><td> DMEM는 (-메트로 /-Cys) 주식 용액 (1 ×)를 만나 10 % BCS와 보완이 MM L-시스테인 </td><td> 사용하기 전에 신선한 준비합니다. </td></tr><tr><td> AC 4 GalNAz 주식 솔루션 (1,000 ×) </td><td> 메탄올에서 50 밀리미터 peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) </td><td> 4 ° C.에 저장 AC 4 GalNAz은 GlcNAz으로 신진 대사 전구체이다. </td></tr><tr><td> Azido - 설탕 라벨 매체 </td><td> 100 μl AC 4 GalNAz 주식 솔루션, 100 ML HEK 293 세포 성장 매체 </td><td> 메탄올은 HEK 293 세포 성장 매체를 추가하기 전에 증발하도록 허용합니다. </td></tr><tr><td> 세슘 염화물 솔루션 </td><td> CsCl은 TD 버퍼에 녹아 : 1.25 G / ML (18.08 g / 50 ML H 2 O) 1.35 G / ML (25.60 g / 50 ML H 2 O) 1.40 G ​​/ ML (31.00 g / 50 ML H 2 O) </td><td> ultracentrifugation에 대한 밀도 기울기 </td></tr><tr><td> 바이러스 스토리지 버퍼 </td><td> 인산염은 CaCl 2, 0.9 밀리미터 MgCl 2, 10 % (V / V) 글리세롤 0.5 밀리미터를 포함, 식염수 (PBS), pH를 7.2 버퍼 </td><td> -20 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> TAMRA-BCN (SPAAC) 라벨링 솔루션 </td><td> DMSO의 TAMRA-BCN : <ol><li> 자외선 AB를 사용단계 4.1 바이러스 솔루션의 titer를 결정하는 sorbance (OD 260 검정) </li><li> 50 μl 나누어지는의 바이러스 입자의 총 개수 (N Ad5)를 결정 </li><li> TAMRA-BCN의 molarity는 (M)을 사용하여 결정됩니다 : C BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo) N Avo = 6.022 × 10 23 (단계 중 4 단계에서 준비 반응 혼합물은 virion 당 100 alkyne 프로브를 포함하고 있으므로) </li></ol></td><td> 스트레인 추진 alkyne 프로브 SDS-PAGE, 대략 10 12 입자 / ML의 바이러스 titer가 제안되어 들어 </td></tr><tr><td> TAMRA-Alkyne (CuAAC) 라벨링 솔루션 </td><td> 바이러스 스토리지 버퍼에 azide으로 수정한 Ad5 (N Ad5 위의 같이 결정) 50 μl, 1.5 밀리미터 batho<html> phenanthroline disulfonate (예 : 1.5 × 최종 CuBr 농도), TAMRA-Alkyne. TAMRA-Alkyne의 molarity는 (M)을 사용하여 결정됩니다 : C 하시죠 = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (5 단계에서 준비 반응 혼합물은 virion 당 100 alkyne 프로브를 포함하고 있으므로) </td><td> 트리스 버퍼는 구리의 경쟁력과 억제 리간드로 알려져있다 8. </td></tr><tr><td> Laemmli 샘플 버퍼 (2 ×) </td><td> 125 MM 트리스-HCL (산도 6.8), 4 % (W / V)은 SDS, 20 % (V / V) 글리세롤 10 % (V / V) 2 - 메르 캅 토 에탄올, 그리고 0.004 % (W / V) bromophenol 블루 </td><td></td></tr><tr><td> 버퍼를 실행 </td><td> 187 MM 글리신, 19 MM 트리스-HCL, H 2 O 3.5 MM SDS </td><td> 4에서 저장 ° C </td></tr></tbody></table>T &quot;&gt; 표 1.이 프로토콜에 필요한 버퍼 및 솔루션의 작성.

<ol>
	<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells.">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+"Clickable"+Amino+Acids+and+Sugars.">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors:+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability.">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li><li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation.">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li><li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover.">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+(Ad)+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors.">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li><li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation.">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Strain-Promoted+[3+++2]+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems.">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li><li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells.">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

azides의 포함 chemoselective 및 bioorthogonal 클릭 반응,의 개발 연구가 빠르게 진화 영역이며, 이후 bioconjugation 어플 리케이션에 선택할 수있는 이러한 반응의 증가가있다. 우리는 우리 자신의 실험실 및 모든 시약의 상업적인 가용성으로 인해 그들의 유용성 때문에 선택받은 단 두 가지 방법을 포함하도록이 프로토콜의 범위를 제한했습니다. 최초의 루트에서는 - 스트레인 추진 azi...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> GFP transgene을 포함하는 아데노 바이러스 타입 5 (Ad5) </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> 인간의 배아 신장 (HEK 293)은 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정일 독수리 중간 (DMEM), 높은 포도당 </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정일 이글 매체, 노 메티오닌, 노 시스테인 (DMEM-메트로 /-Cys), 높은 포도당 </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> 소의 송아지 고기 세럼 </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 100 × 솔루션 (펜 Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0.5 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (10 ×) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100mm의 세포 배양 접시, 조직 문화 처리 폴리스티렌 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353,003 </td></tr><tr><td> 셀 문화 CO 2 배양기 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biosafety 캐비닛 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 멸균 주사기 필터 (0.2 μm의, 셀룰로스 아세테이트) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (유럽) </td></tr><tr><td> 아벤티 JE의 원심 분리기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 369,001 </td></tr><tr><td> 원뿔 튜브 (50 ML, 무균) </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,098 </td></tr><tr><td> 튜브, Thinwall, 울트라 클리어, 13.2 ML, 14 X 89mm </td><td> Beckman </td><td> 344,059 </td></tr><tr><td> SW 41, SW 60 R 갖춘 Ultracentrifugeotor </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf Biopur 안전 잠금 튜브, 1.5 ML </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> 5418을 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-9월 겔 여과 스핀 컬럼 </td><td> 프린스턴 분판 </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> 멸균 바늘, 18 게이지 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 질소 장갑 가방 (deoxygenated CuAAC가 수행되어야하는 경우) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewar 플라스크 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 액체 질소 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 전기 영동 세포 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 형광등 겔 스캐너 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 준비 젤 트리스-HCL 젤 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63,669 </td></tr><tr><td> 예나 Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> 써모 과학 </td><td> 88,905 </td><td></td></tr><tr><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Bathophenanthroline disulfonic 산성 (BDA) 나트륨 소금 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 (트리스 (히드록시 메틸) aminomethane) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 인산 (나2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 식염수 (PBS)를 버퍼 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M HCL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 소의 알부민 세럼 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-시스테인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-메티오닌 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (나트륨 dodecyl 황산) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 - 메르 캅 토 에탄올 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 글리신 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol 블루 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 세슘 염화물 (CsCl) </td><td></td><td> &amp; NBSP; </td></tr><tr><td> 구리 (I) 브로마이드 (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 염화칼슘 (CaCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 염화칼륨 (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> CuAAC * 용 Alkyne 프로브 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA Alkyne </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> SPAAC * 용 긴장 alkyne 프로브 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO Alkyne </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> 클릭 화학 시약 및 키트 * 주목할만한 업체는 Invitrogen, 예나 Biosciences, 베리 어소 시에이츠, 시그마 - 올드 리치, 글렌 연구, 화학 도구를 클릭하고 Baseclick를 포함합니다. alkyne 염료 및 타겟팅 리간드의 다양한는 이러한 공급 업체의 카탈로그에서 찾을 수 있습니다.

chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry

바이러스 입자의 수정은 유전자 치료, oncolytic 응용 프로그램 및 백신 개발에 영향을 미치는위한 엄청난 잠재력에 대한 관심의 상당 금액을 받았습니다. 대부분은 유전학 기반입니다 바이러스 표면, 수정에 1,2,3 전류 접근법은 종종 감쇠에 걸리다 바이러스 생산, 감염 및 세포 형질 도입. 4,5 chemoselective 클릭 화학을 사용하여, 우리는 매우 유연하고 접근을 모두 유지하면서 이러한 문제를 sidesteps 간단한 대안적인 접근 방식을 개발했습니다. 1,2 이 프로토콜의 목표는 아데노 바이러스 타입 5 입자의 표면을 수정 bioorthogonal 클릭 화학을 이용의 효율성을 입증하는 것입니다. 그것이 단백질에 타겟팅 분자, 염료 또는 관심있는 다른 분자의 chemoselective 결합을 허용으로이 두 단계 프로세스는 모두 therapeutically 1 또는 analytically, 2,6 사용할 수 있습니다azide 태그로 미리 분류. 이 방법의 세 가지 주요 장점은 (1) 신진 대사 라벨링은 바이러스성 적합성에 영향, 1,7에 약간을 보여주는 것이있다 (2) 효과기 리간드의 다양한 배열이 활용될 수 있으며, (3) 그것은 매우 빠르고, 신뢰할 수있다 액세스가 용이합니다. 1,2,7 이 절차의 첫 단계에서 아데노 바이러스 입자는 기능 azide (-N 3)를 포함 둘 다 azidohomoalanine (아하, 메티오닌 대리) 또는 부자연스러운 설탕 O-연결된 N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz) 중 하나를 베어링 생산됩니다 그룹. azide으로 수정한 바이러스 입자의 정화 후, 형광 TAMRA 잔기를 포함하는 alkyne 프로브 미리 표시된 단백질이나 glycoproteins에 chemoselective 방식으로 출혈도 잡았있다. 마지막으로, SDS-PAGE 분석은 바이러스 capsid 단백질에 프로브의 성공적인 결합을 설명하기 위해 수행됩니다. 아하의 설립은 모든 바이러스 capsid를 붙여 표시됩니다단백질 (Hexon, Penton 및 섬유), 전용 섬유의 라벨에있는 O-GlcNAz의 설립 결과 동안. 이런 진화 필드에 azide - alkyne 내고 여러 가지 방법이 성공적으로 개발되었습니다 있지만 우리가 가장 편리한 것으로 나타났습니다만이 두 사람은 본 시연 - 스트레인 추진 azide - alkyne의 cycloaddition (SPAAC)과 구리 촉매 azide - alkyne의 cycloaddition (CuAAC) deoxygenated 분위기 하에서.

Watch this Scientific Journal Video about Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry at JoVE.com

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록 설계되었습니다<em&gt; O</em&gt; - GlcNAz. 각각의 azide 그룹 chemoselectively 바이러스 표면 개조의 수단으로 &quot;클릭&quot;화학 반응을 통해 출혈도 잡았있다.

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K 조회수.  Stony Brook University. 아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록 설계되었습니다 O - GlcNAz. 각각의 azide 그룹 chemoselectively 바이러스 표면 개조의 수단으로 "클릭"화학 반응을 통해 출혈도 잡았있다.

비디오: Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em&gt; Coxiella burnetii의</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...