우리는 마우스 클론 항 RVFV 항혈청 및 유동 세포 계측법에 대한 도움말 UTMB 유동 세포 계측법 핵심 시설의 M. 그리핀을 제공하는 RB Tesh 감사합니다. 이 작품은 UTMB.OL에서 제임스 W. McLaughlin이 원정대 기금 지원에 의해 지원되었다 UTMB.BK에서 백신 개발을위한 실리 센터에서 서부 지역 우수 센터, NIH 보조금 R01 AI08764301 및 자금 5 ~ U54 AI057156에 의해 지원되었다 모리스 R. Hilleman 초기 경력 조사자 포상 있습니다.

형광 현미경에 의한 전사 분석 1. MP-12와 EU 레이블을 초기 RNA와 세포를 감염 <ol><li> 12 잘 조직 배양 플레이트에 장소는 12 mm 둥근 coverslips를 잘 당 하나의 coverslip을. </li></ol> 참고 : 세포가 우물에 배치하기 전에 문제의 coverslips을 준수, 폴리-L-라이신 (MW ≥ 70,000)와 코트가있는 경우. 이 목표로, 5 분 폴리-L-라이신의 H 2 O의 멸균 0.1 밀리그램 / ML 솔루션 잠수함의 coverslips. 최소한 2 시간 동안 멸균 H 2 O와 공기 건조에 coverslips를 씻어 내시오. <ol start="2"><li> coverslips는 위에 씨앗 293 세포에 잘 당 1 ML 성장 매체 (DMEM이 10 % 태아 소 혈청, 100 U / ML 페니실린 및 100 밀리그램 / ML 스트렙토 마이신을 포함)에 5 × 10 4 세포를 추가합니다. 37 가습 배양기에서 품어 ° C와 5 % CO 2 O / N. </li><li> 3의 감염의 다중성 (모이)에서 MP-12와 세포를 감염. 포함 적어도 두<html> 감염 우물 : 두 개의 우물 중 하나가 감염되지 않은 컨트롤과 같은 역할을하고, 다른 하나는 전사 억제를위한 제어와 같은 단계 1.5에서 actinomycin D ​​(ACTD)로 처리됩니다. 성장 매체를 제거하고 바이러스 주식을 희석 그래서 전체 볼륨이 각각의 well에 추가 200 ML입니다. 37 가습 배양기에서 1 시간 동안 품어 ° C와 5 % CO 2. </li></ol> 주 : 대신에 세포를 감염 세포도 플라스미드 DNA로 형질 전환 또는 체외에서 특정 바이러스 성 단백질을 코딩 RNA를 합성 할 수있다. 이 목표로, 제조업체의 지침에 따라 해당 화학 물질의 transfection 시약으로 세포를 형질 16 시간 포스트 transfection을 1.5 단계로 진행합니다. 그것은 RNA 라벨 및 고정하기 전에 형질 전환 조건 및 배양 시간을 최적화하는 것이 좋습니다. <ol start="4"><li> 접종을 제거하고 잘 당 1 ML 신선한 성장 매체를 추가합니다. 15 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol>ove_content는 &quot;&gt; 참고 :. 다른 바이러스와 함께 사용하기위한이 프로토콜을 채택하는 경우, 그것은 RNA 라벨 및 고정을위한 최적의 시점을 결정하는 시간 코스 실험을 수행하는 것이 바람직합니다이 시간 감염 시간이 엇갈리게 될 수 있도록 코스를 모두 설정 샘플 레이블이 해결과 동시에 염색 할 수 있습니다. <ol start="5"><li> 15 시간 게시물 감염 (HPI)에서 1 mM의 유럽 연합 (EU)을 포함한 배지로 성장 매체를 교체하십시오. 모의 감염된 우물 하나에,도 5 ㎍ / ㎖의 ACTD를 추가합니다. ACTD는 DNA 의존 RNA 합성 억제로 이것은 전사 억제에 대한 제어 역할을합니다. 배양기에 세포를 반환합니다. </li><li> 16 HPI에서 매체를 제거하고 1 ML PBS (KCl을 0.20 g / L, KH 2 PO 4 0.20 g / L, 염화나트륨 8.00 g / L, 나 2 HPO 4 1.15 g / L, 산도 7.4) 한 번 coverslips를 세척 잘 당. 물론 당 4 % 파라 포름 알데히드 1 ㎖ (PFA)를 추가하고 RT에서 30 분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. </li></ol>참고 : 4 % PFA 고정 솔루션을 준비하려면, ° C 가열 자석 교반기에서 60로 가열 150 ML H 2 O에 10g 파라 포름 알데히드를 분해. 1M NaOH를 500 μl를 추가하고 솔루션 명확해질 때까지 저어 계속합니다. 미립자를 제거하고 62.5 ML 인산 버퍼를 추가하는 필터 종이를 필터링 PFA 용액 (77 mM의의 NaH 2 PO 4, 287 MM 2 나 HPO 4, 산도 7.4). 250 ML의 총 볼륨에 H 2 O를 추가 할 수 있습니다. 단일 사용 분주에서 -20 ° C에서 동결. <ol start="7"><li> 물론 당 1 ML PBS로 한 번 씻으십시오. 더 배양 시간이 이후의 모든 세척 단계는 필요하지 않습니다. 2 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> 참고 : 장시간이 단계에서 보관하면 RNA가 퇴화로 그것은 바로 클릭 반응을 진행하는 것이 중요합니다, 세포가 4시에 1 시간 동안 유지되는 경우 RNA 형광 신호의 손실은 이미 관찰 할 수 있습니다 ° C . 마찬가지로, 당 경우시간 경과 실험을 형성하면, 라벨 반드시 해결과 동시에 모든 샘플을 얼룩. 2. 레이블 RNA를 검출하는 반응을 누릅니다 <ol><li> 1 ML PBS 0.2 % 트리톤 X-100을 첨가하여 세포를 Permeabilize. RT에서 10 분 동안 품어. </li></ol> 참고 : 단계에서 사용되는 모든 솔루션은 2.1-2.3는 핵산 무료로해야합니다. <ol start="2"><li> 물론 당 1 ML PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 습기 챔버로 12 - 웰 플레이트 및 전송에서의 coverslips를 제거합니다. 각 : 100 μL를 클릭 염색 용액 (100 mM의 아스 코르 빈산 100 MM 트리스 산도 8.5, 1 ㎜ CuSO 4, 20 μM 형광 지드 [617분의 590 nm의 여기 / 방출 최대]) - 50 각 coverslip을 커버. 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 참고 : 플라스틱 파라핀 필름 10 cm 직경과 습기 챔버, 선에게 세포 배양 또는 페트리 접시의 바닥을 조립. 디 에지의 내부를 줄젖은 종이 타월로 쉬. 플라스틱 파라핀 필름에 coverslips를 놓습니다. 참고 : coverslips를이 또는 프로토콜의 다른 단계에서 건조 않도록주의하십시오. 그것은이 습기 챔버에 배치 된 후에 바로 각 coverslip에에 얼룩 솔루션을 추가하는 것이 좋습니다. 참고 :이 단계 직전에 신선한 클릭 염색 솔루션을 준비합니다. 1.5 M 트리스 산도 8.5, 100 MM의 CuSO 4, 500 mM의 아스코르브 산의 주식 솔루션은 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 그러나 노란색되어 있다는 어떤 아스 코르 빈산 원액을 버린다. 참고 : 형광 현미경 필터와 일치하는 형광을 선택해야합니다. <ol start="4"><li> 신선한 12 웰 플레이트에 습기 챔버와 장소에서의 coverslips를 제거하고 잘 당 1 ML PBS로 3 회 세척한다. </li></ol> 참고 : 아무 드하는 경우바이러스 성 단백질의 방호가 필요한 coverslips를 마운트 될 수 있으며,이 단계 (3.3 단계로 진행) 후 군데. 3. 바이러스 성 단백질의 발현을 검출하는 면역 <ol><li> 각각의 well에 차단 버퍼 1 ML (3 % (w / v)의 소에서 (BSA) 알부민 혈청 PBS)를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 30 분간 배양한다. </li><li> 습기 챔버에 12 - 웰 플레이트에서 전송 coverslips를 제거하고 50로 커버 - 버퍼 (1:500) 차단에 희석 일차 항체 100 μL (안티 RVFV 박사 RB Tesh에서 친절한 선물, UTMB). 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 참고 : 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해이 프로토콜을 채택 할 때, 먼저 일차 항체에 대한 최적의 희석을 결정합니다. 참고 : 또는,이 단계는 어둠 속에서 4 ° C에서 O / N를 수행 할 수 있습니다. <ol start="3"><li> 12 - 웰 플레이트에 다시 습기 챔버와 장소에서의 coverslips를 제거하고 세척세 1 ML PBS와 시간을 잘 당. </li><li> 50와 습기 챔버 커버에 12 잘 곳 곳에서 coverslips를 제거 - 이차 항체 100 μL (항 - 마우스 IgG의 형광 염료 [여기 / 방출 최대 : 519분의 495 NM]을 결합) (1 버퍼를 차단에 희석 : 500). 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 참고 : 기본 항체를 인식하고 형광 현미경 필터와 일치 할 수있는 이차 항체를 선택해야합니다. 참고 : 원하는 경우, 200 NG / ML DAPI는 핵을 시각화하기 위해 차 항체 희석에 추가 할 수 있습니다. <ol start="5"><li> 다시 12 - 웰 플레이트에 습기 챔버와 장소에서의 coverslips를 제거하고 잘 당 1 ML PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 현미경 슬라이드에 Fluoromount-G 한 방울 (CA. 15 μL) 배치하여 coverslips를 장착합니다. H 2 O로 coverslip을 찍어, 일을 만져 초과 H 2 O를 제거Fluoromount-G의 드롭에 아래로 종이 타월, 장소 세포 측에 전자 쪽. 5 분 공기 건조. </li></ol> 참고 : 거꾸로 현미경 이미징 경우, Fluoromount-G 4에서 고화 할 수 있도록 ° 현미경 슬라이드 CO / N 또는 부착 coverslips를을 투명 매니큐어로 가장자리를 밀봉 있습니다. 참고 : 주까지에 대한 슬라이드를 즉시 군데 나 어두운 곳에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 4. 데이터의 취득 <ol><li> 형광 현미경을 사용하여 이미지. </li></ol> 참고 : 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 적절한 형광을 선택해야합니다. 참고로, 다음은이 책에 표시된 이미지를 얻기 위해 사용되는 형광체 및 필터 세트입니다. DAPI : 여기 필터 : BP 330-385 이색 거울 : DM 400 방출 필터 : LP 420 여기 필터 : BP 460-490 이색 거울 : DM 505 방출 필터 : LP 510 617분의 590의 여기 / 방출 최대 형광 : 여기 필터 : BP 545-580 이색 거울 : DM 600 방출 필터 : LP 610 유동 세포 계측법에 의해 전사 분석 5. MP-12와 EU 레이블을 초기 RNA와 세포를 감염 <ol><li> 성장 배지 (DMEM이 10 % 태아 소 혈청, 100 U / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신을 포함) 6 - 잘 조직 배양 플레이트에 씨앗 293 세포를. 100 % confluency에 - 37 ° C와 5 % CO 2 세포가 80에 도달 할 때까지에 가습 배양기에서 배양한다. </li><li> 모이 3시 MP-12와 세포를 감염. 적어도 두 개의 감염 우물과 같습니다 : 두 개의 우물 중 하나가 감염되지 않은 컨트롤로 제공됩니다, 다른 하나는 단계에서 ACTD으로 처리됩니다5.4. 성장 매체를 제거하고 전체 볼륨이 각각의 well에 첨가하도록 바이러스 주식을 희석하여 400 μL입니다. 37 가습 배양기에서 1 시간 동안 품어 ° C와 5 % CO 2. </li><li> 접종을 제거하고 2 ㎖ 새로운 성장 매체를 잘 당 추가합니다. 12 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 참고 : 다른 바이러스와 함께 사용하기위한이 프로토콜을 적응 경우, 라벨 및 수확에 대한 최적의 시점을 결정하는 시간 코스 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 감염 시간은 엇갈리게하고 모든 샘플 수확, 표시, 동시에 염색 할 수 있도록이 시간 코스를 설정합니다. <ol start="4"><li> 12 HPI에서 0.5 mM의 유럽 연합 (EU)을 포함한 배지로 성장 매체를 교체하십시오. 모의 감염된 우물 하나에,도 5 ㎍ / ㎖의 ACTD를 추가합니다. ACTD는 DNA 의존 RNA 합성 억제로 이것은 전사 억제에 대한 제어 역할을합니다. 배양기에 세포를 반환합니다. </li><li> 13 HPI에서 재치 번 세포를 씻으세포의 트립신에 의해 H PBS 및 수확. PBS가 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (PBS-EDTA)을 함유 수확 세포를 세 번 씻으십시오. </li></ol> 참고 :이 이후의 단계에서, 500보다 빠르게 세포를 원심 분리하지 마십시오 - 1,000 XG에 세포의 파손을 방지 할 수 있습니다. 1 세포를 원심 분리 - 침전 ~ 2 분. 참고 : 표면 면역 염색 대신 고무 경찰관 또는 일회용 세포 스크레이퍼를 사용하여 클릭 반응, 수확 따라 계획됩니다. <ol start="6"><li> RT에서 30 분 동안 4 % PFA과 부화 1 ㎖에 그들을 현탁하여 세포를 고정합니다. 4 % PFA를 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 1.6 단계를 참조하십시오. </li><li> 물론 당 1 ML PBS-EDTA 한 번 씻으십시오. 6 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> 참고 : 장시간이 단계에서 보관하면 RNA가 퇴화로 그것은 바로 클릭 반응을 진행하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 시간이 C를 수행하는 경우ourse를 실험은 동시에 모든 샘플에 레이블을 수정하고 얼룩해야합니다. 6. 레이블 RNA를 검출하는 반응을 누릅니다 <ol><li> PBS 0.2 % 트리톤 X-100 0.5 ㎖에 현탁하여 세포를 Permeabilize. RT에서 10 분 동안 품어. </li></ol> 참고 : 단계에서 사용되는 모든 솔루션은 6.1-6.3는 핵산 무료로해야합니다. 참고 : 세포가이 단계에서 침전 제대로하지 않으면 5 분에 원심 분리 시간을 증가시킨다. 침전 동작은 한 번 세포는 FACS 버퍼 (단계 6.4)에서 일시 중지됩니다 향상됩니다. <ol start="2"><li> 1 ML PBS로 한 번 씻으십시오. </li></ol> 참고 :이 구리 2 + 이온을 클릭 반응에 필요한 킬레이트되므로이 단계에서 EDTA를 사용하지 마십시오. <ol start="3"><li> 200 μL를 클릭 염색 용액에 세포를 resuspend (100 MM 트리스 산도 8.5, 1 ㎜ CuSO 4, 형광 염료 [당일로 표시된 200 ㎚ 지드itation / 방출 최대 : 665분의 650 NM], 100 mM의 아스 코르 빈산). 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 참고 :이 단계 직전에 신선한 클릭 염색 솔루션을 준비합니다. 1.5 M 트리스 산도 8.5, 100 MM의 CuSO 4, 500 mM의 아스코르브 산의 주식 솔루션은 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 그러나 노란색되어 있다는 어떤 아스 코르 빈산 원액을 버린다. 참고 :이 단계에서 함께 세포 덩어리하면, 여러 번 위아래로 pipetting에 의해 resuspend을. 참고 : 흐름 cytometer에 의해 감지 할 수있는 형광을 선택해야합니다. 참고 : 또한 클릭 염색 절차에 노출되지 않습니다 감염된 세포의 하나의 샘플을 준비, 이러한 흐름 cytometer의 교정을 위해 필요합니다. 하나는 감염된 세포의 절반을 사용하거나 단계 5.2에서 잘 감염 추가적인 있습니다. 이 콘트롤 세포 단계 7.1에서 면역 염색 될 것입니다. <ol start="4"><li> FACS 버퍼 (PBS가 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 0.5 % (W / V) BSA를 포함)로 두 번 씻으십시오. </li></ol> 참고 : 바이러스 성 단백질에는 면역 염색이 요구하지 않으면, 세포를 분석 할 수있는 즉시 (8 단계로 진행). 7. 바이러스 성 단백질의 발현을 검출하는 면역 <ol><li> 일차 항체 200 μL의 세포를 resuspend (안티 RVFV)는 FACS 버퍼 (1:10,000)에 희석과 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 참고 : 또는,이 단계는 어둠 속에서 4 ° C에서 O / N를 수행 할 수 있습니다. 참고 : 또한 클릭 염색 절차의 대상이되었지만 면역 염색되지 않습니다 감염되지 않은 세포의 하나의 샘플을 준비, 이러한 흐름 cytometer의 교정을 위해 필요합니다. 하나는 모의 감염된 세포의 절반을 사용하거나 추가 감염도에 포함5.2 단계. 참고 : 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해이 프로토콜을 채택 할 때, 먼저 일차 항체에 대한 최적의 희석을 결정합니다. <ol start="2"><li> FACS 버퍼에 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 이차 항체 200 μL의 세포를 resuspend (항 - 마우스 IgG의 형광 염료 [여기 / 방출 최대 : 519분의 495 NM]에 복합) FACS 버퍼 (1:1,000)로 희석하여 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> FACS 버퍼에 한 번 세포를 씻으십시오. </li></ol> 참고 :이 시점에서, 세포가 어둠 속에서 4 ° C에서 O / N를 저장할 수 있습니다. 8. 데이터의 취득 <ol><li> 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 500 ㎕의 FACS 버퍼 전송에 세포를 resuspend을하고 흐름 cytometer에를 사용하여 분석합니다. 기기를 보정하는 MP-12에 감염된 세포 (단지 아니요를 클릭 반응, 안티 RVFV 염색) 및 모의 감염된 세포를 (단지 반응을 클릭)를 사용합니다. </li></ol> 아니E : 악기에 의해 감지 될 수있다 적절한 형광을 선택해야합니다. 참고로, 다음은이 책에 표시된 데이터를 수집하는 데 사용되는 레이저 라인과 필터 세트입니다. 519분의 495의 여기 / 방출 스펙트럼 형광 : 레이저 : 488 nm의 필터 : 30분의 530 665분의 650의 여기 / 방출 스펙트럼 형광 : 레이저 : 640 nm의 필터 : 20분의 670

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	<li>Fakan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+support+for+RNA+synthesis+in+the+cell+nucleus.">Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus.</a> Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).</li><li>Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+RNA+synthesis+using+bromouridine+labelling+and+bromodeoxyuridine+antibodies.">Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies.</a> Cytometry. 14, 455-458 (1993).</li><li>Jao, C. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

제공되는 프로토콜은 초기 RNA에 딘 아날로그 EU의 결합을 통해 숙주 세포의 전사에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 방법을 설명합니다. 그것은 빠르고, 민감하고, 방사성 동위 원소의 사용에 의존하지 않는이 방법은 이전 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 또한,이 방법은 형광 현미경이나 본질적으로 같은 시약을 사용하여 유동 세포 계측법을 통해 정량적 데이터를 질적 데이터를 산출?...

<html> 전통적으로 전사 활동은 방사성 (3 H-딘 1) 하나의 법인을 통해 측정 또는 초기 RNA로 (BRU) 2 클레오 할로겐되었습니다. 이 딘 유사체는 세포에 의해 촬영 클레오 회수 경로를 통해 딘 - 삼인산 (UTP)로 변환하고, 이후 새로 합성 된 RNA로 통합. 3 H-딘은 많은 시간이 소요될 수 있습니다 기록법, 또는 섬광에 의해 감지 될 수있다 전문 장비를 필요로하는 계산. 또한, 방사성 동위 원소의 사용은 높은 억제 생물 안전성 연구소 등의 실험실 설정의 숫자에 실용적이지 않을 수 있습니다. BRU는 RNA 이차 구조는 항체 바인딩에 대한 입체적 방해가 될 수도로 핵 또는 RNA의 부분적인 변성에 항체의 접근을 보장하기 위해 거친 permeabilization이 필요할 수 있습니다 안티 - BRU 항체로 면역 염색을 통해 감지 할 수 있습니다. _content &quot;&gt; 여기에서 설명하는 프로토콜은 최근 RVFV 변형 MP-12에 감염된 세포에서 전사 활성을 측정하는 화학 3을 누릅니다 개발했다. 클릭 화학은 매우 선택적이 고 효율적인 구리 (I) 촉매 알킨 사이 사이클로 반응에 의존 활용 4,5 지드 부분은.이 프로토콜에 감염된 세포의 초기 RNA가 먼저 딘 아날로그 EU의 결합을 통해 표시되어 있습니다. 두 번째 단계에서는 통합 된 유럽 연합 (EU)이 형광 지드와 반응을 통해 검출된다.이 방법의 주요 장점은 있습니다 (1) 방사성 동위 원소의 사용을 필요로하지 않습니다 (2) 그 그것은 가혹한 permeabilization 또는 RNA의 변성을 필요로하지 않습니다. 부족에 의해 방해되지 않습니다 미만 50 다, 형광 지드의 액세스 분자량 클래스와 RNA의 검출을 결합 할 때 permeabilization 또는 RNA 이차 구조. 또한, 연구자들은 일차 항체의 자신의 선택에 국한되지 않습니다바이러스 성 단백질의 iCal 면역 염색. 두 가지 방법이 프로토콜에 설명되어 있습니다 : 형광 현미경 (1-4 단계) 및 유동 세포 계측법 (5-8 단계)를 통해 전사를 정량화 하나를 통해 전사를 시각화 한. 두 방법 모두 셀 단위 기준으로 전사 활성과 바이러스 감염 사이의 상관 관계를 허용 바이러스 단백질에 대한 세포 면역 염색으로 초기 RNA의 라벨을 결합한다. 저자는 성공적 프로토콜 RVFV 변형 MP-12 6 토스카나 바이러스 (TOSV) 10에 감염된 다른 MP-12 돌연변이 7,8, 9, 세포와 감염된 세포에 감염된 세포에서 전사 활동을 결정하기 위해 여기에 설명 된 사용했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 쉽게 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해 적응 특정 바이러스 또는 세포 단백질의 면역 형광 염색을 포함하도록 수정 될 가능성이있다 할 수 있습니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-uridine</td>
			<td>Berry &amp; Associates</td>
			<td>PY 7563</td>
			<td>dissolve in DMSO for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-mm round coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D (ActD)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9415</td>
			<td>dissolve in DMSO for 10 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2323</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8027</td>
			<td>dissolve in H2O for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-9542</td>
			<td>dissolve in H2O for 5 mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10270</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10277</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5960</td>
			<td>dissolve in H2O for 500 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper filter</td>
			<td>VWRbrand</td>
			<td>28333-087</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine (MW &ge; 70000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1274</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. Olympus IX71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using click chemistry to measure the effect of viral infection on host-cell rna synthesis

많은 RNA 바이러스는 세포의 방어를 회피하는 수단으로 숙주 세포의 전사를 억제하는 능력을 진화했다. 이러한 바이러스의 연구에 감염된 세포에서 전사 활성을 측정하는 신속하고 신뢰할 수있는 방법을 가지고하는 것이 중요합니다. 전통적으로, 전사는 H-딘 같은 면역 염색을 통해 감지 한 다음 5 bromouridine (BRU) 등 할로겐 딘 유사체의 autoradiography를 또는 섬광 계수 또는 법인을 통해 탐지 다음과 같은 3 등 방사성 클레오의 내장으로도 측정되었습니다. BRU의 검출이 번거로울 수 있습니다 낮은 감도에서 고통 수도 있지만 방사성 동위 원소의 사용은, 그러나, 특수 장비가 필요하며 실험실 설정의 숫자에 적합하지 않습니다. 아 지드와 알킨에서 구리 촉매 트리아 졸의 형성을 포함 최근에 개발 클릭 화학은 이제 신속하고 highl를 제공합니다이 두 가지 방법에 대한 예 민감 대안입니다. 클릭 화학은 초기 RNA가 먼저 형광 지드와 라벨의 검출에 이어 딘 아날로그 5 ethynyluridine (EU)의 결합에 의해 표시되는 두 단계 프로세스입니다. 이러한 지드 시각화 옵션의 넓은 범위를 허용, 여러 가지 형광체로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 긴장 MP-12 클릭 화학을 사용하여 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV)에 감염된 세포에서 전사 억제를 측정하는 방법을 설명합니다. 동시에,이 세포에 바이러스 성 단백질의 발현은 고전적인 세포 면역 염색에 의해 결정됩니다. 8 세부 유동 세포 계측법을 통해 전사 억제를 정량화하는 방법을 5 단계 동안, 4 세부 형광 현미경을 통해 전사 억제를 시각화하는 방법을 통해 1 단계를 반복합니다. 이 프로토콜은 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수있다.

RVFV의 NSS 단백질 (가족 Bunyaviridae, 속 Phlebovirus)는 11 두 가지 메커니즘을 통해 숙주 세포의 일반적인 전사를 억제 (I) 봉쇄에 의한 P62의 프로 테오 분해를 촉진하여 기저 전사 인자 TFIIH 11 (II)의 P44 소단위 TFIIH 6 소단위. MP-12 균주는 바이오 안전성 수준이 실험실에서 처리 될 수 있으며에 다른 야생 적용되는 미국의 선택 에이전트 규칙에서 제외되기 때문에 RVFV MP...

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Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

이 방법은 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV) 변형 MP-12와 감염 후 숙주 세포의 전사의 변화를 측정하는 클릭 화학의 사용을 설명합니다. 결과는 형광 현미경을 통해 질적 시각 또는 유동 세포 계측법을 통해 정량적으로 얻을 수 있습니다. 이 방법은 다른 바이러스와 함께 사용하기위한 적응이다.

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

using-click-chemistry-to-measure-effect-viral-infection-on-host-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K 조회수.  University of Texas Medical Branch. 이 방법은 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV) 변형 MP-12와 감염 후 숙주 세포의 전사의 변화를 측정하는 클릭 화학의 사용을 설명합니다. 결과는 형광 현미경을 통해 질적 시각 또는 유동 세포 계측법을 통해 정량적으로 얻을 수 있습니다. 이 방법은 다른 바이러스와 함께 사용하기위한 적응이다.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

표준 임상 Assays에 의해 탐지의 한도 이하 바이러스성로드와 HIV 감염된 개인의 확장 및 HIV - 1 RNA를 Quantifying

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recently there were several publications on the bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of the spectrum (400 nm-500 nm) is responsible for killing various pathogens1-5. The phototoxic effect of blue light was suggested to be a result of light-induced reactive oxygen species (ROS) formation by endogenous bacterial photosensitizers which mostly absorb light in the blue region4,6,7. There are also reports of biocidal effect of red and near infra red8 as well as green light9.
In the present study, we developed a method that allowed us to characterize the effect of high power green (wavelength of 532 nm) continuous (CW) and pulsed Q-switched (Q-S) light on Pseudomonas aeruginosa. Using this method we also studied the effect of green light combined with antibiotic treatment (gentamycin) on the bacteria viability. P. aeruginosa is a common noscomial opportunistic pathogen causing various diseases. The strain is fairly resistant to various antibiotics and contains many predicted AcrB/Mex-type RND multidrug efflux systems10.
The method utilized free-living stationary phase Gram-negative bacteria (P. aeruginosa strain PAO1), grown in Luria Broth (LB) medium exposed to Q-switched and/or CW lasers with and without the addition of the antibiotic gentamycin. Cell viability was determined at different time points. The obtained results showed that laser treatment alone did not reduce cell viability compared to untreated control and that gentamycin treatment alone only resulted in a 0.5 log reduction in the viable count for P. aeruginosa. The combined laser and gentamycin treatment, however, resulted in a synergistic effect and the viability of P. aeruginosa was reduced by 8 log's.
The proposed method can further be implemented via the development of catheter like device capable of injecting an antibiotic solution into the infected organ while simultaneously illuminating the area with light.

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

We show that a developed biomedical device involving continuous or pulsed visible laser based treatment that is combined with antibiotic treatment (gentamycin), results in a statistically significant synergistic effect leading to a reduction in the viability of P. aeruginosa PAO1, by 8 log's compared to antibiotic treatment alone.

에 보이는 빛과 젠타 마이신의 상승 효과<em&gt; Pseudomona 녹농균</em&gt; 미생물

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

뉴 클레오 캡시드 소둔 매개 전기 영동 (NAME) 분석은 HIV-1 뉴 클레오 캡시드 억제제의 신속한 식별을 할 수 있습니다

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호스트 세포 RNA의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

요약

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바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

표준 임상 Assays에 의해 탐지의 한도 이하 바이러스성로드와 HIV 감염된 개인의 확장 및 HIV - 1 RNA를 Quantifying

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

에 보이는 빛과 젠타 마이신의 상승 효과

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

뉴 클레오 캡시드 소둔 매개 전기 영동 (NAME) 분석은 HIV-1 뉴 클레오 캡시드 억제제의 신속한 식별을 할 수 있습니다

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