이 작품은 NIH와 ACS, T32CA009135 포함 CA133027, CA070723 및 CA022443에서 교부금의 지원을받는되었다. 빌 Sugden은 미국 암 협회 연구 교수입니다.

1. 공개 Plasmids있는 세포 공학 <ol><li> 시각화 할 플라스미드에 유당 운영자 순서 (LacO)의 약 250 사본을 포함하는 DNA 조각을 소개 표준 제한 소화 또는 동종 재조합 기술을 사용합니다. 우리 플라스미드는 약 170 kbp의 BACmid이고 Kaposi 육종 - 관련 헤르페스 바이러스의 전체 게놈 (KSHV)와 hygromycin 12 인코딩 저항이 포함되어 있습니다. </li><li> 소개 LacO을 포함 Lipofectamine 2000 transfection하여 포유류의 세포에 플라스미드 DNA합니다. 우리는 25 μl Lipofectamine 2000, 0.5 ML OptiMEM, 및 3.5 ML DMEM으로 플라스미드 DNA를 정제 10 μg을 4 시간에 60mm 요리 헬러와 SLK 세포를 transfected. </li><li> 48 시간 10 % 태아 소 혈청 및 배양 세포 5 개 ML DMEM으로 문화 매체를 변경합니다. </li><li> 소개 찮아에 대한 항생제 선택을 포함하는 중간에 대형 요리와 문화 세포에서 낮은 밀도의 플레이트 세포smid, 우리는 300 μg / 3 주 ML의 hygromycin과 10% 태아 소 혈청과 DMEM에서 셀을 선택했습니다. </li><li> 새로운 문화 요리에 hygromycin 방지 식민지를 전송하는 살균, 트립신 - 젖은 거름 종이 조각을 사용합니다. </li><li> transfected 클론은 접시를 채우기 위해 성장했을 때, 제한 소화를 위해 DNA를 분리하고 남부는 플라스미드 LacO의 폴리머는 동질이며, 예상 크기 있도록 blotting. </li><li> 플라스미드는 LacI의 융합을 표현하기 위해 설계되지 않은 경우, 해당 LacI-tdTomato 같은 붉은 색 형광 단백질에 융합 유당 억제 (LacI)를 인코딩 레트로 바이러스와 적절한 클론을 감염. 우리는 tdTomato보다 긴 시간 14 여러 노출에서 발생하는 것 photoxicity을 최소화 할 녹색에 가까운 형광 단백질을 사용합니다. </li><li> 일단 LacI 융합 단백질은 문화 바인딩에서 융합 단백질을 차단하는 200 μg / ML 이소 프로필-BD-thiogalactoside (IPTG)의 존재에서, 세포 소개합니다DNA. </li><li> 문화 적어도 3 일 동안의 전지 LacI-tdTomato 단백질의 표현을 허용합니다. </li><li> 언 바운드 융합 단백질의 최소한의 배경 수준 별개의 신호를 보여 LacI - tdTomato의 최적 수준있는 사람을위한 화면 클론 (IPTG을 멀리 세척하고 아래에 설명 된대로 세포를 확인하여). </li></ol> 2. 이미징 시스템의 개발 우리의 이미징 시스템은 동력 무대와 계획 - Aochromat 63x/1.4 오일 목적 갖춘 Zeiss Axiovert의 200M으로 구성되어 있습니다. 형광 여기 광은 Colibri 시스템의 LED &quot;중립적 인 화이트&quot;에 의해 제공됩니다. 방출은 CascadeII에 의해 감지 : 1024 EMCCD 카메라를. 이 증폭기 신호의 게인 레지스터와 냉각, 백 얇게 카메라, 어두운 현재는 초당 픽셀 당 0.061 전자이며, 양자 효율은 0.90보다 큽니다. 시스템은 SmartExperiments 모듈을 포함 Axiovision 4.8 소프트웨어에 의해 제어됩니다. tdToma의 검출을위한우리가하는 통과 빛의 85 %는 형석 및 방출 빛의 95 %을 자극 할 수있는 Zeiss 필터 세트 75HE를 사용하면 방출 필터를 통과합니다. <ol><li> 여러 긴 시간 간격으로 이미지의 자동화 인수에 민감한 신호의 감지, 특정 여기 빠르게 shuttering, 동력 무대와 초점 팔의 LED 광원 및 소프트웨어 제어를위한 역 현미경과 EMCCD 카메라와 이미징 시스템을 조립 Z-스택. 이 시스템은 진동으로부터 격리 할 공기 테이블에 앉아해야합니다. </li><li> 37 ° C, humidified 챔버에 5~10%의 CO 2 세포를 유지하기 위해 무대 위로 배양기를 조립. 실험이 진행되는 동안 이동 유물을 최소화하기 위해 안정적인 온도에 와서 할 수있는 시스템에 대한 충분한 시간을 허용합니다. </li><li> 샘플에서 열을 빼돌 렸에서 목적을 방지 할 수있는 목적을위한 온수 칼라를 사용하십시오. </li></ol> 3. 레이블 DNA의 시각화 <ol><li> 35mm의 플레이트 세포셀의 쌍 중복없이 8-16 세포의 식민지로 분할 할 수 있습니다 미만 10 % 합류의 밀도에 유리 바닥 요리. 가능한 세포가 분열 할 시간이 너무 이미징 전에 최소한 24-48 시간을 수행합니다. </li><li> 영상의 시작 전에 1 ~ 3 시간은 선택 마약과 IPTG를 모두 부족 문화 매체로 판에게 3 번 씻어. 이 절차는 거리에 비 가능한 세포를 씻어하고 LacI 융합 단백질은 plasmids의 LacO 사이트를 바인딩 할 수 있습니다. </li><li> 10% 태아 소 혈청과 25 밀리미터 HEPES 2 개 ML DMEM으로 문화 매체를 교체하십시오. </li><li> CultFoil있는 배양 접시의 상단을 바꾸기 35mm 요리에 장착 링에되었다. 이 커버는 시간이 지남에 따라 소금 농도를 증가하고 세포를 죽일 문화 매체의 증발을 억제합니다. </li><li> 세포를보고보기의 여러 분야에서 상단 및 세포 하단의 초점 비행기를 결정하는 차동 간섭 대비 (DIC) 이미지를 사용합니다.각 분야에서 세포의 정상에서 초점 평면에 방식의 약 1 / 3 아래로 이동합니다. , y를 x를 저장, z는 저장 단계 위치 목록에서 조정합니다. 참고 : 플라스미드 신호는 세포가 LacI 융합 단백질에 적합한 파장의 LED가에 의해 조명하는 접안 렌즈를 통해 표시되지 않을 수 있습니다. 약 신호는 시간이 지남에 따라 신호의 통합을 허용하기 때문에 효율적으로 약한 신호를 증폭 EMCCD 카메라의 사용과 표시 될 수 있습니다. </li><li> 현미경 제어 소프트웨어에서 각 저장 단계 위치에 수행 할 이미지의 Z-스택을 정의합니다. Z 치수 14 대략 나이 퀴 스트 (Nyquist) 샘플링로 수 0.35-0.50 μm의 AZ 단계 크기를 선택합니다. 셀이있는 위하고 비행기 아래의 &quot;추가&quot;조각을 포함,이 조각은 세포주기 동안 세포 움직임에 따라 검색을 할 수 있으며, 또한 이미지 스택의 후 수집 처리 (deconvolution)에 사용됩니다. 이 포함 거예요셀의 두께에 따라 40-60 이미지의 스택에 발생. </li><li> 현미경 제어 소프트웨어 (plasmids를 시각화를위한 10-60 분 간격으로 30 분 간격 (긴 시간 동안 세포 분열 및 마이그레이션을 추적하기위한)와 형광 이미지에서 Z-스택의 시야 이미지를 수집하기 위해 시계열 실험을 정의 세포 내에서). 이 긴 실험의 과정을 통해 광독성에 불필요한 셀을 표시 할 수 있습니다 표준 시야 영상,보다 더 많은 빛을 필요로 실험이 진행되는 동안 DIC 이미지를 사용하지 마십시오. </li><li> 소프트웨어 제어 실험을 시작합니다. 시스템이 실험이 진행되는 동안 (초과 객실 조명 등에 노출 친) 방해하지 않습니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 필요한 경우, 실험이 진행되는 동안 가습 시스템에서 물을 보충. </li></ol> 4. 이미지의 후 수집 처리 <ol><li> 각 Z-스택 및 시간 포인트에 대한 이미지를 검토합니다. 불필요한 지역을 자르기다음 단계에서 컴퓨터 처리 시간을 줄일 수있는 이미지. </li><li> 각 Z-스택 15 원산지의 픽셀에 신호 강도를 다시 할당 할 deconvolution 알고리즘을 사용합니다. 이 deconvolution가 이미징 시스템을위한 이론적 점 확산 함수 (point spread function)를 기반으로 할 수 있지만, 영상 형광 마이크로하여 특정 시스템의 점 확산 함수 (point spread function)를 측정하고, deconvolution 알고리즘에서이 측정을 사용하는 것이 바람직합니다. 우리는 우리의 이미징 시스템의 점 확산 함수 (point spread function)을 측정하고 적용 AxioVision 소프트웨어 (AxioVision 소프트웨어 설명, Zeiss)의 최대 가능성 알고리즘을 반복 제약. </li><li> 강도의 변화와 움직임 plasmids의 세포주기 동안과 딸 세포에 plasmids의 파티션을 추적 할 이미지를 검사합니다. </li></ol>

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	<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li><li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi's+sarcoma.">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li><li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome:+application+for+genetic+analysis.">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 설명 된 방법은 여러 세대에 걸쳐 시간이 지남에 따라 실시간으로 포유류의 세포에 plasmids를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 여기 빛에 노출을 제한함으로써, 우리는 최소 72 시간, 3 셀 부문을 대표하는 16-32 세포의 콜로니를 통해 새로 분할 쌍의 세포를 수행하는 이러한 기술을 사용했습니다. 이 실험은 정량 PCR, blotting 남부 및 어류와 같은 정적 assays에서 얻을 수없는 정보를 제공합니다....

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11,965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> GIBCO </td><td> 31,985 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 </td><td> 시그마 </td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td> 스트렙토 마이신 황산 </td><td> 시그마 </td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycin </td><td> Calbiochem </td><td> 400050 </td><td> SLK 400 μg / ML, 300 μg / 헬러에 ML </td></tr><tr><td> 이소 프로필 - BD-thiogalactoside (IPTG) </td><td> 로슈 </td><td> 10 724 815 001 </td><td> 최종 농도 200 μg / ML </td></tr><tR&gt; <td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15,630 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 바닥 요리 </td><td> MatTek </td><td> P35G - 1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> Axiovert 200M </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colibri </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td> 중립 백색 LED </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 큐브 75 HE </td><td> Zeiss </td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> 계획 - 고차 색지움의 63x/1.4 목표 </td><td> Zeiss </td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII : 1024 EMCCD 카메라 </td><td> Photometrics </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 미니 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 37-2 디지털 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> CTI 컨트롤러 3700 디지털 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td> 목표 히터 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> 무대 난방 삽입 P </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td> 무대 위로 보육 S </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td> 가습기 시스템 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring plasmid replication in live mammalian cells over multiple generations by fluorescence microscopy

몇 자연스럽게 - 발생 plasmids은 포유류의 세포에 보관됩니다. 이 중 여러 사람이 malignancies 1-3의 원인 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus (KSHV)를 포함 감마 herpesviruses의 genomes이 있습니다. 이 두 genomes들은 부족 전통 centromeres 4-8에도 불구하고 라이센스 방식으로, 하나의 바이러스 단백질과 세포의 복제 기계를 사용하여 각 복제하고 있으며, 세포 분열 동안 딸 세포에 전달됩니다. 많은 작품은 그러한 남부 blotting 및 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광과 같은 방법을 사용하여 이러한 플라스미드 genomes의 복제를 특징 완료되었습니다. 이러한 방법은하지만 제한됩니다. 양적 PCR 및 남부 blots은 세포의 인구 세포 당 plasmids의 평균 개수에 대한 정보를 제공합니다. 물고기는 평균 수와 플라스미드의 배포를 모두 보여 단일 셀 분석입니다<html> 하지만 세포 인구의 당 세포 검사 셀의 부모 나 자손에 대한 정보를 허용하지 정적입니다. 여기, 우리는 라이브 셀의 plasmids를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 관심을 9 플라스미드의 여러 사이트에 휘황 태그 유당 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 관심 DNA는 유당 연산자 (LacO) 시퀀스의 약 250 탠덤 반복을 포함 할 수 있도록 설계되어 있습니다. LacO은 특히 형광 단백질에 융합 할 수있는 유당 억제 단백질 (LacI)에 의해 구속된다. 융합 단백질은 하나 엔지니어링 플라스미드 또는 retroviral 벡터에 의해 도입에서 표현 할 수 있습니다. 이러한 방법으로, DNA 분자는 휘황 태그하므로 형광 현미경을 통해 볼 수가 있습니다. plasmids이 볼 수 할 준비가 될 때까지 융합 단백질은 IPTG의 존재의 배양 세포에 의해 플라스미드 DNA를 바인딩에서 차단됩니다. ontent는 &quot;&gt;이 시스템은 plasmids은 여러 세대에 걸쳐 세포를 생활의 합성의 속성을 드러내고과 딸 세포에 파티션에서 모니터 할 수 있습니다. 이상적인 세포가 자기편 있으며, 쉽게 transfected, 대형 핵을 갖추고 있습니다.이 기술은 결정하는 데 사용 된 것으로 EBV-파생 plasmids의 84 %가 각 세대를 합성하고 새로 합성 plasmids 파티션의 88 %가 충실하게 헬러 셀의 딸 세포에.이 EBV의 plasmids의 페어가에서 자신의 합성 이후에 묶여 또는 자매 chromatids와 관련된 것으로 볼 수 있었다 S- 그들이 Anaphase 10 구분 자매 chromatids로 분리 볼 때까지 단계가. 방법은 현재 헬러 셀 및 SLK 세포에서 KSHV의 genomes의 복제를 연구하는 데 사용하고 있습니다. 헬러 세포는 인간의 상피 세포를 불후의하고 있으며, SLK 셀이 남을 아르 내피 인간 세포. SLK 세포가 원래 KSHV의 병변에서 파생 된 있지만, 헬러이나 SLK 셀 라인도 자연스럽게 harbors KSHV의 genomes 11. 바이러스 복제를 공부하는 것 외에도,이 시각화 기술은 또한, 제거, 또는 합성, 현지화 및 기타 재조합 플라스미드 DNAs의 파티션에 대한 다양한 DNA 시퀀스 요소의 돌연변이의 효과를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

<html> 대표 실험에서 얻은 Z-스택의 최대 강도 계획은 그림 3에 표시됩니다. 일반적인 플라스미드 신호들은 단일 또는 plasmids의 클러스터 대표 여부에 따라 Z-스택의 3-8 조각,에 존재한다. 셀 유사 분열에 도달 할 때까지 EBV 및 KSHV 파생 plasmids의 경우, 신호가 세포 내에서 천천히 이동합니다. 세포 자체가 실험의 과정을 통해 마이그레이션. 또한 구형이되고 유사 분열 동안 음식에서 분리....

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Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

라이브 셀에서 개별 DNA 분자를 관찰하는 방법이 설명되어 있습니다. 기술은 관심의 DNA에 설계 구속력이 사이트에 휘황 태그 LAC 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 이 방법은 시간이 지남에 라이브 세포에서 많은 재조합 DNAs를 수행하도록 구성 할 수 있습니다.

형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.7K 조회수.  University of Wisconsin - Madison. 라이브 셀에서 개별 DNA 분자를 관찰하는 방법이 설명되어 있습니다. 기술은 관심의 DNA에 설계 구속력이 사이트에 휘황 태그 LAC 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 이 방법은 시간이 지남에 라이브 세포에서 많은 재조합 DNAs를 수행하도록 구성 할 수 있습니다.

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

와이드 필드 현미경을 사용하여 장기 이미징 포유 동물 세포

연구

생물학

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...