이 작품은 건강의 국립 연구소 (NIH) 보조금 DA030396에 의해 지원되었다. 도움이 토론과 원고의 비판에 대한 Drenan 연구실의 구성원에게 감사드립니다. 미의 특별 감사는 성인 마우스 뇌 조각에 대한 조언에 대한 기술 지원 및 조나단 토마스 팅에 대한 김 버렸네.

1. 뇌 슬라이스 준비 및 전기 생리학을위한 솔루션의 준비 <ol><li> 뇌 조각의 준비를위한 솔루션은 이전에 3, 4를 설명했다. 93 N-메틸 D-glucamine, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 : N-메틸 D-glucamine (NMDG) 기반 다음과 같은 구성의 절단 및 복구 솔루션을 (MM)를 준비 포도당, 5 그렇단 + 아스 코브 산, 2 티오 우레아, 3 그렇단 + pyruvate, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0.5 CaCl 2 • 2H 2 O. NMDG과 300-310 mOsm로 조절합니다. 10 N HCL을 7.3-7.4로 pH를 조정합니다. <ol class="lalpha"><li> 각각의 2 M 주식 솔루션을 만들기 위해 Millipore 물에 MgSO 4 • 7H 2 O와 CaCl 2 • 2H 2 O를 해산. </li><li> 나열된 순서에 다른 구성 요소를 무게 분해하는 교반하면서 Millipore 물 부분적으로 채워진 용적 플라스크에 추가 할 수 있습니다. 모든이 추가되면 작성Millipore 물 용적 플라스크입니다. </li><li> pH를 측정하고 10 N HCL을 조정할 수 있습니다. </li><li> osmolarity를​​ 측정하고 필요한 경우 NMDG을 조정할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 포도당, 5 그렇단 + 아스 코브 산, 2 티오 우레아, 3 그렇단 다음 구성의 인공 뇌척수 (aCSF)을 (MM)를 개최 HEPES 준비 + pyruvate, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. 자당과 300-310 mOsm로 조절합니다. 1 N HCL 또는 NaOH로 pH를 7.3-7.4로 조정합니다. <ol class="lalpha"><li> 나열된 순서의 구성 요소를 무게 분해하는 교반하면서 Millipore 물 부분적으로 채워진 용적 플라스크에 추가 할 수 있습니다. 모든이 추가되면, Millipore 물과 용적 플라스크를 채 웁니다. </li><li> pH를 측정하고 필요한 경우 NaOH 또는 HCL을 조정할 수 있습니다. </li><li> osmolarity를​​ 측정하고 자당 필요한 경우로 조정합니다. </li></ol></li><li> 124 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12.5 포도당, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O에 다음 구성의 표준 aCSF 녹음 솔루션을 (MM)를 준비 자당과 300-310 mOsm로 조절합니다. 1 N HCL 또는 NaOH로 pH를 7.3-7.4로 조정합니다. </li></ol> 2. 급성 뇌 슬라이스의 작성 <ol><li> 이전에 3, 4에 설명 된대로 뇌 슬라이스 절단 및 복구가 이루어집니다. 버블이 결정 요리가 95 % 산소 / 5 % CO 2 가스 (carbogen), 얼음에 하나 접시, 33의 다른 ° ​​C.와 복구 솔루션을 NMDG로 가득 </li><li> 버블 크리스탈 1 요리 상온에서 carbogen과 aCSF를 개최 HEPES로 가득. </li><li> 오세영 + pentobarbital (200 밀리그램 / kg, IP)로 성인 마우스를 (2~12개월 세) 마취. 동물이 발가락 - 핀치에 대한 응답이 없을 때 절차를 진행합니다. </li><li> 필요한 경우, 나중에 genotyp에 꼬리 조직 샘플을 잘라동물 들죠. </li><li> 가슴에 고인을 열고, 마음을 노출하고, 내림차순 대동맥 클램프. 오른쪽 심방을 괴롭히다. </li><li> Transcardially 0-4 ° C NMDG 복구 솔루션의 5-10 ML과 동물을 perfuse. </li><li> 동물 목을 벨, 뇌를 제거하고 1 분에 대해 4 ° C NMDG 복구 솔루션에 배치합니다. </li><li> 얼음 차가운 금속 플레이트에서 관심 영역을 포함하도록 원하는 방향 (등, 수평, parasagittal, 코로나)에 뇌를 잘라. </li><li> 접사 진동 슬라이서의 건조 단계 표면에 superglue과 뇌 블록 (DSK-제로 1; Dosaka), 4 잠기 뇌 블록 carbogen과 ° C NMDG 복구 솔루션, 그리고 지속적으로 거품 솔루션입니다. </li><li> 관심 뇌 영역의 조각을 잘라. 슬라이스 두께는 특정 관심의 뇌 영역, 동물 연령, 수행 할 실험에 따라, 200-400 μm이다. </li><li> 즉시 절단 한 후에 품다 원하는 슬라이스는 33 carbogenated ° C NMDG 복구 soluti정확히 12 분에에 후 60 분의 초기 기간 동안 솔루션을 개최 carbogenated, 룸 온도 HEPES로 전송할 수 있습니다. 이 60 분의 부화 후, 슬라이스는 녹음에 사용할 수 있습니다. 조각들은이 녹음에 사용되는 때까지 하루 종일 솔루션을 가지고 HEPES에 보관됩니다. </li></ol> 3. 뇌 슬라이스의 뉴런에서 패치 클램프 녹음 <ol><li> 프로그램 불타는 브라운 풀러 (셔터 P-97 또는 이에 상응하는 수직 풀러)와 표준 패치 micropipette를 당겨. 기가 - 옴의 인감 형성을위한 최적의 아르 피펫은 일반적으로 MΩ 4-6의 저항이 </li><li> 수직 현미경 (니콘 FN-1)의 무대에, 녹음 챔버 (워너 인스트루먼트 RC-27L)에 한 조각을 전송합니다. 지속적인 superfuse (1.5-2.0 ML / 분) 32시 가열, 유지 carbogenated, 표준 기록 aCSF와 슬라이스 ° C. 또는 조각은 실온에서 유지 될 수 있습니다. </li><li> 사용 관심 뇌 영역을 찾아 센터10X 공기 목적 (니콘 계획 형석 10X, NA 0.3, WD : 16mm). </li><li> 40X에 가까운 적외선 (IR​​) 물 침적 목표 (; 0.80, WD : NA 니콘 APO 40XW 3.5 mm)을 사용하여 개별 뉴런 시각화 적외선 근처의 IR-차동 간섭 대비 (DIC) 광학 및 고속 연결이 커플 링 장치를 충전 (CCD) 비디오 카메라 (하마 마츠 C-7500). IR-DIC 관찰에서 건강한 뉴런은 부드럽고 밝은 회색 플라즈마 멤브레인을 나타냅니다. </li><li> 적절한 세포 녹음 솔루션 micropipette를 입력합니다. 135 칼륨 글루 콘산, 5 EGTA, 0.5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 MG-ATP, 그리고 0.1 GTP (산도가 트리스베이스, osmolarity를 ​​7.25로 조정 : 대부분의 응용 프로그램의 경우, 우리는 다음과 같은 솔루션을 (MM)를 사용하여 290 자당과 mOsm)로 조정. 시각화 뉴런에서 전체 셀 녹음을 설정합니다. </li></ol> 4. 슬라이스의 뉴런에 대한 약물의 로컬 응용 프로그램 <ol><li> 위에서 설명한대로 표준 패치 클램프 micropipette를 당겨. 사용여러 약물 솔루션은 동일한 휴대폰으로 사용할 수있는 경우 유리의 조각에서 두 개의 동일한 &quot;자매&quot;팁을 생산하는 셔터 P-97와 같은 피펫을 끌어 당기는이 바람직하다. 그들이 위에 설명 된 세포 솔루션으로 가득 된 경우 MΩ ~ 5의 저항이 것 팁 크기는 최적입니다. </li><li> carbogenated, 표준 기록 aCSF에 희석 약물의 솔루션 백업은 micropipette. 아래 팁을 가리킨 솔루션의 항목에 갇혀있는 공기 방울을 제거 할 수있는 약물이 가득한 micropipette을 버려야지. </li><li> 이러한 Picospritzer III (일반 밸브 (주))와 같은 적절한 압력 분출 시스템에 튜브로 연결 피펫 홀더에있는 약물이 가득한 micropipette를 탑재합니다. manipulators 일반적으로 (예를 들어, 셔터 MP-285) 패치 클램프 녹음에 사용되는 피펫 홀더는 동일한 해상도로 micromanipulator에 장착해야합니다. 또한, 머니퓰레이터는로와 슬라이스의에서 대각선 움직임을 허용해야합니다. 사람ually 유체의 열 뒤에 적절한 압력을 구축하기 위해 micropipette에 압력을 3-4 회를 꺼냅니다. </li><li> IR-DIC 광학 아래의 팁을 시각화하는 동안 micromanipulator 컨트롤 사용하여 슬라이스에 약물 피펫을 낮 춥니 다. 이상적으로, 하나는 시각적으로 확인하고 센터 이전에 슬라이스에 기록 micropipette을 낮추는에 셀 근처의 약물 피펫의 위치 다음에서 기록 할 수있는 뉴런을해야합니다. 약물 피펫을 위치하면 약물 피펫은 gigaohm 인감을 맺은 후 위치로 이동하는 경우 녹화를 중단 할 수있는 기록 세포의 주변에 조직의 움직임을 일으킬 수 있습니다. </li><li> IR 비디오 사용하여 조직 슬라이스의 상단 표면에 약물 micropipette를 배치. 한 압력 방출 및 모니터 1) 분사에 관한 파편의 움직임에 대한 팁 주변 및 팁이 막혔거나 차단되어있는 표지판 2) micropipette 팁을 실행합니다. 끝이 차단 / 막힌 경우, pipett를 철회전자하고 새로운 하나를 교체하십시오. </li><li> 이러한 슬라이스의 상단에서 대각선 녹화 셀을 접근 그 마지막 위치에, 약물 가득한 피펫의 끝은 기록 된 셀 기록 전극의 끝과 같은 초점 평면 (또는 약간 아래)에 1) 인 경우 , 그리고 2) 기록 세포 10-40 μm. 약물 가득한 피펫 팁이 기록 된 셀 위에있는 경우, 압력 방출의 힘은 gigaohm 인감을 방해 수 있습니다. </li><li> 전압 클램프 모드 또는 현재 클램프 모드에서 셀을 누른 상태에서 원하는 세포 반응을 기록합니다. 우리는 정기적으로 아세틸 콜린을 기록 및 / 또는 전압 클램프 모드에서 뉴런을 누른 상태에서 세포의 전류를 니코틴 -이 elicited. Picospritzer III를 사용할 때 압력 분사를 수동으로 트리거 될 수 있지만, 더 많은 재현 결과는 디지털 TTL 펄스를 수집 시스템 (축삭 Digidata 1440 및 pClamp 10.3)를 사용하여 압력 분사를 실행하는 것이 좋습니다. </li></ol> 5. 제어압전 번역기로 마약이 가득한 Micropipette <ol><li> 가능하면 단일 차원 압전 변환기에 약물이 가득한 피펫 홀더를 마운트 (예 : Piezojena PA-100 Burleigh PZM-150)가있는 아날로그 전압 입력 (다시 수집 시스템에서)을 허용 할 수 있습니다 고정밀 micromanipulator (셔터 MP-285)에 장착. 약물 가득한 피펫의 움직임에와 입국 / 출구의 타이밍과 속도를 포함하여 슬라이스, 부족이 더 쉽게 통제 및 실험에서 실험 재현 할 수 있기 때문 압전 번역 유용합니다. 피펫 만 압력 방출의 순간을 위해 압전 번역으로 셀 근처에 이동 될 때 nAChRs을 공부하면 약물이 가득한 피펫에서 니코틴 누설​​의 desensitizing 효과, 그들은 지금까지 발생한다 최소화하고 있습니다. </li><li> 압전 전압 제어 증폭기에 수동으로 제어 포텐를 사용하여 전압을 다이얼의 최대 값. </li><li> micromanipulator, 위치에게 피펫가 기록 된 셀에 내용을 추출하고, 수동으로 압전 전압 제어 증폭기에 0으로 전압을 줄여 피펫를 철회 할 슬라이스의 약물이 가득한 피펫을 사용합니다. </li><li> 기록 수집 시스템에서 아날로그 출력 신호를 사용하여, 250의 압력 분출 TTL 펄스가 발생하기 전에 밀리 초 300 밀리 초를 시작 기간 동안 슬라이스로 약물이 가득한 피펫 이동합니다. TTL 펄스가 끝난 후에 50 밀리 초를 시작, 250 밀리 초 기간 동안 피펫을 철회. </li></ol>

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본 논문에서 제시하는 방법은 뇌 슬라이스 준비에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 공부 폭넓게 유용합니다. 그러나, 상당히 실험 데이터이 방법을 활용에서 그 결과의 품질과 재현성에 영향을 미칩니다 요인이 있습니다. 예를 들어, evoked 전류는 약물이 가득한 피펫의 팁의 직경에 매우 민감합니다. 작은 팁 약물 솔루션, 낮은 저항을 제공하는 대형 팁이 기록 된 셀 기록 전극 사이의 gigaohm 인감를 ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong시약의&gt; 이름</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-메틸 D-glucamine</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KCl</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 아냐<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaHCO<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 포도당</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 오세영<sup&gt; +</sup&gt; 아스 코브 산</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 티오 우레아</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 오세영<sup&gt; +</sup&gt; pyruvate</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgSO<sub&gt; 4</sub&gt; • 7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CaCl<sub&gt; 2</sub&gt; • 2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaCl</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 오세영<sup&gt; +</sup&gt; pentobarbital</td&gt;<td&gt; Vortech 제약</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 칼륨 글루 콘산</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MG-ATP</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DSK-제로 1 기계를 진동</td&gt;<td&gt; 테드 펠라 주식회사</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 불타는 / 브라운 micropipette 풀러</td&gt;<td&gt; 셔터</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RC-27 녹음 챔버</td&gt;<td&gt; 워너</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344B 재관류 히터 컨트롤러</td&gt;<td&gt; 워너</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SH-27B 솔루션 히터</td&gt;<td&gt; 워너</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 니콘 FN-1</td&gt;<td&gt; 니콘</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 CCD 비디오 카메라</td&gt;<td&gt; 하마 마츠</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt; 일반 밸브 (주)</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285 Micromanipulator</td&gt;<td&gt; 셔터</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100 압전 변환기</td&gt;<td&gt; piezosystem 예나 주식회사</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40 압전 증폭기</td&gt;<td&gt; piezosystem 예나 주식회사</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt; 분자 장치 업체</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt; 분자 장치 업체</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices

담배 사용은 암, 심장 질환, 폐기종, 그리고 뇌졸중 등 수많은 건강 문제로 연결됩니다. 흡연에 중독 중추 신경계에 걸쳐 nicotinic 아세틸 콜린 수용체 (nAChRs)에 니코틴의 biophysical 및 셀룰러 행동에서 유래 유행 neuropsychiatric 장애입니다. 니코틴 중독과 관련된 뇌 영역에 존재하는 다양한 nAChR의 하위 유형을 이해하는 것은 중요한 우선 순위입니다. 이러한 전체 세포 패치 클램프 또는 두 전극 전압 클램프 녹음 등의 전기 생리학 기술을 채용 실험은 관심 nAChRs의 약리 특성에 유용합니다. 같은 포유류의 조직 배양 세포 또는 Xenopus laevis의 oocytes과 같은 세포 표현 nAChRs는 물리적으로 격리되어 있으며 따라서 쉽게 현대 약리학의 도구를 사용하여 공부하고 있습니다. 대상 수용체가 이미 알려진 특히 때 많은 진전은 이러한 기술을 사용하여 만들어졌습니다차 이소성 표현은 쉽게 달성했습니다. 심하게 실험실 쥐 쥐에서 채취 한 뇌 슬라이스 내의 뉴런에 : 종종, 그러나, 그것은 그들의 모국어 환경에서 nAChRs을 연구 할 필요가 있습니다. 예를 들어, 쥐 등 α4 L9&#39;A 마우스 1 α6 L9 &#39;S 마우스 2로 &quot;지나치게&quot;nAChR의 subunits을 표현, 특정 nAChR의 subunit 자신의 기능 표현을 바탕으로 뉴런의 모호 식별 할 수 있습니다. 뇌 조각의 뉴런에서 전체 세포 패치 클램프 녹음이 정기적으로 숙련 된 electrophysiologist에 의해 수행되어 있지만, 로컬 등 아세틸 콜린이나 뇌 슬라이스 내에 기록 된 셀 니코틴 같은 약물을 적용하는 도전입니다. superfusate에 약물의 희석은 (목욕 응용 프로그램) 빠르게 되돌릴 수 없습니다, 그리고 U-튜브 시스템은 쉽게 뇌 슬라이스와 함께 작동하도록 구성되지 않습니다. 이 논문에서, 우리는 빠르게 성인 m에 기록 된 뉴런에 nAChR - 활성화 약물을 적용하는 방법을 설명뇌 조각 ouse. 표준 전체 셀 녹음 조각의 뉴런로 만든되며, 이익의 약물로 가득 두 번째 micropipette는 기록 세포 근처의 위치로 maneuvered입니다. 약물 가득한 피펫에 가압 공기 또는 불활성 질소의 주입은 기록 세포에 피펫에서 배출되는 약물 솔루션의 작은 금액을 발생합니다. 이 방법을 사용 nAChR로 인한 전류는 밀리 초 정확도로 해결 될 수 있습니다. 약물 응용 프로그램 시간은 쉽게 변할 수 있으며, 약물이 가득한 피펫은 농도 - 반응 곡선은 단일 신경 세포를 만들 수 있도록 허용하는 새로운 피펫으로 후퇴하고 교체 할 수 있습니다. nAChR 신경 생물학의 맥락에서 설명했지만,이 기술은 뇌 조각의 뉴런의 리간드 - 개폐 이온 채널이나 수용체의 다양한 종류를 공부하는 데 유용해야합니다.

우리의 실험에서, 우리는 정기적으로 도파민 (DA) 생산 복부 tegmental 지역 (VTA)와 substantia nigra 갈 거예요 compacta (SNc)의 뉴런을에서 기록합니다. 전압 클램프 모드에서 아세틸 콜린하거나 세포에 니코틴의 압력 응용 ​​프로그램은 일반적으로 100-200 밀리 초 (그림 1A-B)에서 정상에 도달 빠른, 안쪽 양이온 현재이 높아집니다. 현재의 부패는 크게 작업의 사이트에서 약물의 확산에 의해 ?...

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Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

이 논문에서, 우리는 심하게 절연 뇌 조각의 뉴런에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 연구 할 수있는 유용한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 패치 클램프 기술을 사용하여 기록 뉴런에 약물의 로컬 응용 프로그램에 대한 약물 채워진 micropipette의 사용을 포함한다.

마우스 뇌 슬라이스의 Nicotinic 아 세티 콜린 수용체 기능을 공부하는 약물의 로컬 응용 프로그램

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

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Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Cholinergic Agonists and Antagonists Agents

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18.9K 조회수.  Purdue University. 이 논문에서, 우리는 심하게 절연 뇌 조각의 뉴런에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 연구 할 수있는 유용한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 패치 클램프 기술을 사용하여 기록 뉴런에 약물의 로컬 응용 프로그램에 대한 약물 채워진 micropipette의 사용을 포함한다.

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

연구

신경과학

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2. Consequently, investigation of structural details of the interaction between 5-HT2A and mGlu2 affecting schizophrenia-related behaviors represents a powerful translational tool. As previously shown, the head-twitch response (HTR) in mice is elicited by hallucinogenic drugs and this behavioral response is absent in 5-HT2A knockout (KO) mice3,4. Additionally, by conditionally expressing the 5-HT2A receptor only in cortex, it was demonstrated that 5-HT2A receptor-dependent signaling pathways on cortical pyramidal neurons are sufficient to elicit head-twitch behavior in response to hallucinogenic drugs3. Finally, it has been shown that the head-twitch behavioral response induced by the hallucinogens DOI and lysergic acid diethylamide (LSD) is significantly decreased in mGlu2-KO mice5. These findings suggest that mGlu2 is at least in part necessary for the 5-HT2A receptor-dependent psychosis-like behavioral effects induced by LSD-like drugs. However, this does not provide evidence as to whether the 5-HT2A-mGlu2 receptor complex is necessary for this behavioral phenotype. To address this question, herpes simplex virus (HSV) constructs to express either mGlu2 or mGlu2&#916;TM4N (mGlu2/mGlu3 chimeric construct that does not form the 5-HT2A-mGlu2 receptor complex) in the frontal cortex of mGlu2-KO mice were used to examine whether this GPCR heteromeric complex is needed for the behavioral effects induced by LSD-like drugs6.

This article describes how to inject viral vectors into the mouse frontal cortex to test behavioral assays that require GPCR heteromeric formation.

키메라를 구축의 HSV-중재 형질 전환 유전자의 발현은 마우스의 GPCR Heteromers의 행동 기능을 연구하는

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

뇌 조각에서 뉴런 연구를위한 자동 이미지 유도 패치 클램프의 적용

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.

전체 셀 전류 두뇌 분할 영역에서 GABA의 퍼프 응용 프로그램에 의해 유도 된

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with subcellular location within cells where this function is carried out. To study the subcellular location of nicotinic ACh receptors (nAChRs) in native brain tissue, an optical method was developed for precise release of nicotine at discrete locations near neuronal membranes during electrophysiological recordings. Patch-clamped neurons in brain slices are filled with dye to visualize their morphology during 2-photon laser scanning microscopy, and nicotine uncaging is executed with a light flash by focusing a 405 nm laser beam near one or more cellular membranes. Cellular current deflections are measured, and a high-resolution three-dimensional (3D) image of the recorded neuron is made to allow reconciliation of nAChR responses with cellular morphology. This method allows for detailed analysis of nAChR functional distribution in complex tissue preparations, promising to enhance the understanding of cholinergic neurotransmission.

This article presents a method for studying nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in mouse brain slices by nicotine uncaging. When coupled with simultaneous patch clamp recording and 2-photon laser scanning microscopy, nicotine uncaging connects nicotinic receptor function with cellular morphology, providing a deeper understanding of cholinergic neurobiology.

Photoactivatable 니코틴의 레이저 플래시 Photolysis를 통해 마우스 뇌 조각에서 Nicotinic 아 세 틸 콜린 수용 체 기능을 프로 빙

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

일반적인 마모 셋에 전체 피 질 Electrocorticographic 배열의 만성 이식

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

성인 소뇌 슬라이스에 장기 우울증 유도의 평가

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...