이 기술은 광액성 니코틴 분자의 레이저 플래시 사진 용액과 함께 다중 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사를 활용합니다. 니코티닉 콜린 체 수용 체의 정확한 활성화를 허용. 이 기술은 니코틴 수용체 작용제 응용에 대한 미세한 경련성 제어를 허용하고, 수용체 기능적 발현 패턴 및 콜린성 시냅스 또는 부피 전송의 연구를 위한 강력한 도구를 제공한다.
시술을 시작하기 전에 프로그래밍 가능한 파이펫 풀러를 사용하여 20-40 마이크로미터 개구름이 있는 유리 마이크로 파이프를 당깁니다. 0.22 미크론 필터를 통해 레코딩 용액의 약 1 밀리리터를 변형시보. 그리고 여과된 레코딩 용액에서 충분한 lyophilized 광액 활성 니코틴을 재중단하여 2밀리머 최종 농도를 산출한다.
포토액티브 약물의 50 마이크로리터로 당겨진 로컬 응용 마이크로파이프를 백필하고 마이크로 조작기에 장착된 파이펫 홀더에 파이펫을 고정합니다. 적절한 튜브 길이를 통해 파이펫 홀더를 지속적인 저압 적용이 가능한 압력 배출 시스템에 연결합니다. 그리고 마이크로 조작기를 사용하여 로컬 응용 프로그램 파이펫을 세포 외 기록 솔루션으로 기동합니다.
피펫 팁을 마우스 뇌 조직 샘플 위에 약간 배치하고, 관심 있는 세포로부터 약 50 마이크로미터를 배치합니다. 그리고 간략하게 파이펫에 압력의 평방 인치 당 1 ~ 2 파운드를 적용합니다. 관심 있는 셀의 변위가 최소화되어야 합니다.
안정적인 전세포 패치 클램프를 달성한 후, 압력 배출 장치에 대한 낮은 적용을 켜고, 1~2분 동안 광액활성 니코틴으로 세포를 둘러싼 조직을 포화시한다. 로컬 응용 프로그램은 실험에 추가복잡성을 도입합니다. 그러나 화합물을 절약하고 PA-Nic의 높은 농도를 활용할 수 있습니다.
광액활성 니코틴의 목욕 적용을 위해, 먼저 100 마이크로몰러 최종 농도로 연속 재순환에 적합한 기록 용액의 부피에 용액의 충분히 용해. 그리고 결과 혼합물을 관류 시스템에 로드합니다. 그런 다음 분당 1.5~2밀리미터 속도로 광액활성 니코틴 용액의 재순환을 시작하여 최소한의 내지름과 전체 길이의 튜브를 사용하여 필요한 재순환 량을 최소화합니다.
재순환 하는 동안, 지속적으로 카보겐으로 용액을 거품, 낮은 조명 조건에서 섭씨 32도에서 목욕 온도를 유지. 목욕 응용 프로그램은 조직의 PA-Nic 투과의 단순성과 균일성의 혜택을 누릴 수 있습니다. 그러나 그것은 반드시 낮은 micromolar PA-Nic 농도 활용, 화합물의 높은 총 금액을 소비.
내측 하베눌라 뉴런의 라이브 시각화를 위해, 전송된 빛 또는 적외선 차동 간섭 대조 광학 및 비디오 카메라를 사용하여 안정적인 전세포 패치 클램프 레코딩을 설정합니다. 고저항 셀 부착 구성을 설정한 후 침입하기 전에 설정 및 소프트웨어를 레이저 스캐닝 모드로 전환합니다. 침입 후 레이저 스캐닝을 사용하여 화상 이미징 염료가 확산에 의해 신경을 수동적으로 채우고 있는지 확인합니다.
염료가 살아있는 스캔 기능을 사용하기 전에 적어도 20~30분 동안 셀룰러 구획을 채우도록 하여 신경과 셀룰러 구획을 시각화합니다. 신경 기능의 정확한 라이브 시각화를 허용하는 이미징 매개 변수를 선택하고 적절한 설정을 조작하여 디스플레이 시각화, 해상도, 신호 대 노이즈 비율 및 이미지 프레임 획득 시간에 영향을 미치거나 변경합니다. 신호 대비를 향상시키기 위해 조회 테이블 창을 열고 조회 테이블 바닥 과 천장 설정을 조정합니다.
조직 내에서 관심 영역을 찾으려면 1X 광학 줌을 선택하고 패닝 컨트롤을 사용합니다. Z 계열 도구를 사용하여 관심 셀이 포함된 시작 및 중지 위치를 선택합니다. 하나의 마이크로미터의 단계 크기를 설정하고 가장 높은 해상도의 이미지를 생성할 이미지 크기를 선택합니다.
종종 1, 024 x 1, 024 라인당 픽셀. 그런 다음 세포를 포함하는 모든 Z 평면에서 뉴런을 연속적으로 이미지화합니다. 레이저 자극을 보정하려면 이미징 레이저 전력이 최소보다 큰 시스템 스캐닝을 시작하고, 얇은 빨간색 마커 형광 층에 목표 초점을 미세 조정합니다.
형광장 내의 영역을 선택하여 이물질이 없는 부분을 고르게 코팅하고 도구, 교정 및 정렬 메뉴를 열어 끊임없는 갈증 기능을 선택합니다. 405나노미터 레이저, 400의 레이저 자극 력, 20밀리초의 자극 지속 시간을 선택하여 두 번째 갈바노미터 미러 쌍의 공간 보정을 위한 화상 반점 자습서를 따르십시오. 빨간색 마커에 1~5마이크로미터 직경의 구멍을 산출합니다.
중앙 스팟 화상 후 이미지를 자극하고 새로 고치고 둥근 빨간색 표시기를 중앙, 오른쪽 중앙 및 아래 중심 반점의 실제 스팟 위치로 이동하여 9개의 스팟그리드를 획득하도록 업데이트를 선택합니다. 교정을 테스트하려면 마크 포인트 창을 열고 샘플의 새 영역에서 정의된 스팟의 자극 매개 변수를 수동으로 활성화하여 올바른 최신 교정 파일이 마크 포인트 창에 로드되는 것을 주의하십시오. 그런 다음 테스트 펄스를 적용하여 올바른 교정을 확인합니다.
관심 있는 셀룰러 영역을 간략하게 이미지화하고 찾으려면 라이브 스캔을 선택하고 광학 줌을 늘려 필요에 따라 작은 구조를 시각화합니다. 세포막에 인접한 마크 포인트 단일 스팟 십자선을 배치하고, 사진 자극 매개변수를 1-50밀리초 지속 시간, 1-4 밀리와트 레이저 전력 및 적어도 하나의 예심으로 설정합니다. 그런 다음 실행 마크 포인트를 선택하여 마크 포인트 프로토콜을 시작하고 전기 생리학 데이터 수집을 실시간으로 관찰합니다.
1밀리머 PA-Nic의 광액 활성성 니코틴 2PE 형광은 입증된 바와 같이 현지 응용 파이펫에서 압력 배출 중에 쉽게 검출된다. 광액탄성 니코틴 광석 반응의 주요 광화학 제품의 전달은 동일한 농도 및 흥분 력 및 파장에서 형광 신호를 생성하지 않습니다. 광액 활성 니코틴 결과의 특이성을 입증.
입증된 바와 같이 뇌 조직에 적용된 광액활성 니코틴의 이미징은 국소 응용 용 파이펫의 100 내지 200 마이크로미터 내의 약물의 존재를 드러낸다. 광액활성 니코틴이 현지 응용 프로그램을 통해 뇌 조직에 효과적으로 전달될 수 있음을 확인합니다. 여기서, 뉴런 형태가 완성된 것처럼 보이는 고품질의 이미지가, 소음이 최소화되고, 파편이 세포 형태해석의 해석을 방해하지 않는, 도시된다.
그러나 이러한 이미지는 품질이 낮습니다. 신호 대 배경 비율이 낮고 상당한 이물질로 인해. 입증 된 바와 같이 PA-Nic의 레이저 플래시 사진 분해와 뇌 조각에 내측 habenula 뉴런의 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사를 페어링하면 세포 형태와 전기 생리적 반응의 조정을 허용합니다.
10초 간격으로 수행된 단일 스팟 사진 용해는 기준선 보유 전류에 대한 충분한 복구 시간을 허용합니다. 1초 간격이 짧아지지만 프로토콜이 진행됨에 따라 보유 전류가 점진적으로 증가합니다. 니코틴은 짧은 간격으로 시스템에서 확산할 시간이 충분하지 않다는 것을 시사합니다.
광액 활성 분자를 활용하는 실험을 설계할 때 형광 지표를 선택하고 호환되는 포원 방출 스펙트럼을 사용하여 형광을 보고하는 것이 중요합니다. PA-Nic은 짧은 파장 사진 용해 성수기로 인해 가장 일반적인 형광과 호환됩니다. 가장 적합한 PA-Nic 응용 기술을 선택할 때, 관심의 뉴런에서 니코틴 수용체의 기능적 발현, 생리적 활성을 신중하게 고려하는 것이 중요하다.
이 기술의 숙련된 활용은 니코틴 응용 프로그램의 미세한 현절 제어를 허용, 이는 니코틴 수용체 활성화에 의해 네이티브 니코틴 수용체 참여의 운동을 연구하기위한 흥미로운 새로운 가능성을 가능하게, 세포 세포 소세포 화, 및 뉴런 활동의 변조.
