이 작품은 뇌 과학에 대 한 알 렌 연구소에 의해 투자 되었다. 저자 알 렌 연구소 설립자, 폴 G. 앨런과 조디 알 렌의 비전, 격려와 지원을 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 동물 보호, 축산, 유전형을 수행 하기 위한 알 렌 연구소 기술 지원 직원을 감사 합니다.

유전자 변형 쥐를 포함 하는 절차는 뇌 과학에 대 한 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 알 렌 연구소에 의해 승인 되었습니다. 둘 다 남성과 여성 C57BL/6 쥐 (체중 범위 10-30 g)이이 실험에서 사용 되었다. 일부 대표적인 결과 살아있는 인간 두뇌 조각에서 수집 된 데이터를 설명 합니다. Neocortical 조직 표본은 종양 제거를 위한 neurosurgeries 동안 얻은 했다. 그것은 병에 걸리는 조직에 대 한 액세스를 얻기 위해 overlying neocortical 조직을 제거 하는 데 필요한 했다. 정보 환자 동의 스웨덴 의료 센터의 기관 검토 위원회에 의해 승인 프로토콜에서 연구 목적에 대 한 신경외과 조직의 사용에 대 한 모든 사례에서 얻은 했다.
1. 미디어와 시 약 (표 1)의 준비
참고: 솔루션 여야 한다 하 추적 금속 및 기타 불순물의 순화 된 물에서. 사용 하지 않는 솔루션 저장 될 수 있습니다 4 ° C에서 최대 1 주에 대 한 원하는 경우 비록 솔루션 실험의 날에 갓 만든 수 것이 좋습니다. 위의 각 배합의 1 L 1-2 조각화 절차에 대 한 충분 하다. 모든 실제 솔루션은 안정적인 pH 버퍼링 하 고 충분 한 산소를 사용 하 여 이전 carbogen (95% O2/5% CO2)와 함께 포화 상태 해야 합니다. 모든 솔루션의 pH 7.3-7.4 및 osmolality 조정 되어야 한다 측정 하 고 300-310 mOsmol/kg을 조정.
<ol><li>(MM)에 NMDG HEPES 실제 준비: 92 NMDG, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 포도 당, 2 thiourea, 5 나 하는데, 3 Na-pyruvate, 0.5 CaCl2·2H2O, 및 10 MgSO4·7H2O. Titrate pH 7.3 5m 염 산의 0.5 mL + 17 mL와 함께 –7.4. 참고:이 적정 단계 적으로 수행 해야 피하기 위해 강 수; divalent 양이온의 추가 사전 그러나, 강 수 pH의 조정에 따라 생리 적인 범위를 되돌릴 수 있습니다.</li>
	<li>HEPES (mM)에서 실제 들고 준비: 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 포도 당, 2 thiourea, 5 나 하는데, 3 Na-pyruvate, 2 CaCl2·2H2O, 그리고 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH를 7.3-7.4의 몇 방울과 집중 10 N NaOH.</li>
	<li>(MM)에 녹음 실제 준비: 124 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4, 24 NaHCO3, 12.5 포도 당, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O, 그리고 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH를 7.3-7.4의 몇 방울과 10 N NaOH를 집중.</li>
	<li>솔루션 스파이크에서 Na+ (2m) 준비: NaCl의 580 mg 갓된 NMDG HEPES 실제의 5 mL에 용 해. 이것은 하나의 두뇌 슬라이스 준비에 대 한 충분 한 솔루션 이다.</li>
	<li>조직을 포함 하는 데 사용할 2 %agarose 준비 합니다. Agarose 형식 1B의 2 세대 분해 ( 재료의 표참조) 그냥 끓는 때까지 PBS와 전자 레인지 x 1의 100 ml에서. 혼합, 그리고 무 균 10 cm 배양 접시에 혼합물을 부 어 응고 허용에 소용돌이 친다. 사용 될 때까지 4 ° C에서 봉인된 된 비닐 봉투에 agarose 접시를 저장 합니다.</li>
	<li>재고 솔루션을 작동 하는 주 사용 마 취 준비. 2-메 틸-2-butanol의 5 mL와 2,2,2-Tribromoethanol의 2.5 g을 혼합 하 고 점차적으로 200 mL PBS, pH 7.0-7.3에에서 용 해. 사용 하기 전에 0.22 μ m 필터 재고 솔루션을 필터링 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 저장. 참고: 재고 솔루션을 작동 하는 마 취에 대 한 만료 및 폐기 절차를 결정 하기 위한 각 동물 사용 위원회 지침 및 규칙을 참조 하십시오.</li>
</ol>2입니다. 저 미 역의 설정
<ol><li>조직 기계 기계와 수술 도구 ( 재료의 표참조) 저 미 역을 설정 합니다. 기계 기계 보정, 지르코늄 세라믹 인젝터 블레이드를 블레이드 팔 빠른 접착제 접착제를 사용 하 여 연결한 다음 견본 홀더를 삽입 하 고 블레이드 긁어 하지 않습니다 보장 하기 위해 작은 차이 떠나 견본 홀더를 잎의 앞 가장자리를 정렬 금속입니다. 참고: 블레이드 가장자리 물리적으로 손상 되지 않은 경우 주 또는 심지어 많은 대 한 다시 사용할 수 있습니다 교체 하지 않고 달. 다양 한 조직 기계 모델은 상업적으로 사용할 수 있는, 많은 최적의 보정 때 우수한 성능을 제공할 수 있습니다. 이상적인 최소 z 축 편향, 직접 측정 하 고 조정 또는 경험적으로 관찰 해야 합니다.</li>
	<li>250 mL 비 커에 대 한 상수 carbogenation (가스 기관총 돌 미디어에 몰입을 통해 적용) NMDG-HEPES 실제와 얼음에 사전 오 200 mL와 함께 가득 설정 > 10 분. 참고:이 솔루션 사용 됩니다 transcardial 관류 및 단면 중 슬라이스 기계 저수지를 채우는.</li>
	<li>NMDG-HEPES 실제의 150 mL 가득 초기 뇌 조각 복구 챔버를 설정 (상수 carbogenation 유지) 챔버 32-34 ° c.에 유지 온수 물 욕조에 배치 참고: 디자인 후 슬라이스 챔버 에드워즈와 Konnerth (1992)의52 이 단계에 대 한는 것이 좋습니다. 이 챔버는 쉽게 사용할 수 있는 실험실 항목으로 만들어질 수 있다 (250 mL 비이 커, 나일론 메시 그물 세공, 50 mL 원뿔 튜브, 35 m m 플라스틱 원형 접시). 그 남아 공기의 무료 그물 조각 거품, 특히 그 조각을 플 로트 하 여 손상 될 발생할 수 있습니다 이러한 carbogen 가스 거품 돌에 의해 지속적으로 생산 되도록 주의 해야 합니다. 그물 액체 표면 아래 약 1 cm 침수 한다.</li>
	<li>들고 챔버; 뇌 슬라이스를 설정 큰 저수지에 여러 독립적인 웰 스와 디자인 좋습니다 ( 재료의 표참조). 사용까지 HEPES 실제와 따뜻한 일정 carbogenation에서 실내 온도에 450 mL로 저수지를 채우십시오. 참고: 두뇌 분할 영역 전송 됩니다 초기 복구 상공에서 electrophysiological 녹음 하기 전에 장기 저장에 대 한이 약 실에. 그 기포의 무료 조각 그물 남아 항상 되도록 주의 해야 합니다.</li>
	<li>조직 포함을 위한 녹은 agarose를 준비 합니다. 쿠키 커터 처럼 50 mL 원뿔 유리병의 오픈 엔드를 사용 하 여 이전 준비 접시에서 2 %agarose 블록을 잘라. 느슨하게 원뿔 유리병 뚜껑 다음 전자 렌지에 10-30 s는 agarose 그냥 녹아 때까지. 과열 하지 않습니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 녹은 agarose를 부 어. Agarose 활기찬 동요와 42 ° C로 설정 하는 thermomixer를 사용 하 여 녹은 상태에서를 유지 합니다. 신중 하 게 녹은 agarose 성급 하 게 응고 하지 않습니다 확인 합니다.</li>
	<li>전이 이번에 시원한 얼음에 slicer에 대 한 블록을 재미 액세서리를 놓습니다.</li>
</ol>3. Transcardial 관류
참고: transcardial 관류 절차 성인 동물을 작업할 때 중요 한 단계는 두뇌의 급속 한 냉각을 달성 하는 것이 중요 하다 고 낮은 나+의 뇌 주입을 통해 신진 대사를 둔화, 저 캘리포니아2 +/ Mg2 + 실제 솔루션입니다. Transcardial 관류 뇌 맥 관 구조, 시각화 및 유전자 변형 라인에 붙일 레이블된 셀 인구의 타겟팅 방해할 수 있는 autofluorescence를 감소 시키는에서 붉은 혈액 세포를 또한 제공 합니다. 그건 transcardial 관류를 생략 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>깊이 복 주입 마 취 작업 재고 솔루션의 마우스 anesthetize (1.25% 마 취의 250 mg/kg: 0.2 mL 당 10 g 몸 무게 재고 솔루션을 작업 참조 하십시오 테이블의 자료). 후 ~ 2-3 분, 발가락 핀치 반사를 평가 하 여 마 취의 충분 한 깊이 확인 합니다. 필요한 경우 주사 마 취 작업 재고의 볼륨을 추가 하 고 다른 2-3 분 후 발가락 핀치 반사를 재평가.</li>
	<li>미리 냉장된 250 mL 비 커 (2-4 ° C 최적입니다, 눈 녹은 냉동된 솔루션이 아닌)에서 carbogenated NMDG HEPES 실제의 25 mL로 30 mL 주사기를 로드 합니다. 25 5/8 게이지 바늘을 연결 합니다.</li>
	<li>그것의 뒤에 마우스로 forepaws 및 안정성에 대 한 뒷 발 아래로 핀. 15 cm 유리 페 트리 접시는 기본으로 잘 강화 된 실리콘 작품으로 가득합니다.</li>
	<li>메스를 사용 하 여 횡 경 막의 수준에서 흉 강 측면 절 개를 확인 합니다. 좋은 위를 사용 하 여 어느 쪽 돌 심 혼 및 폐를 클리핑 방지 하기에 흉 곽을 통해 잘라.</li>
	<li>다시 핀 노출 심장 흉 곽의 중앙 부분. 좌 심 실에 30 mL 주사기의 바늘을 삽입 하 고 오른쪽 아 트리 움 마음을 종료 하려면 혈액 수 있도록 잘가 위로 잘라.</li>
	<li>수동 일정 한 압력을 사용 하 여 주사기 플런저를 우울 하 게 하 고 ~ 10 mL/min의 속도로 냉장된 NMDG HEPES 실제와 동물을 perfuse. 참고: 경우는 관류 성공적인 간 변경 됩니다 색깔 홍 색에서 옅은 노란색, 그리고 어떤 경우 명확한 종료 프로시저의 끝으로 콧구멍 체액을 관찰할 수 있다.</li>
</ol>4. 뇌의 해 부와 슬 라이 싱
<ol><li>동물을 목을 벨. 메스를 사용 하 여 머리에 피부를 열고 두개골 모자를 노출.</li>
	<li>두개골 모자를 통해 피부를 버려야 고 작은 절 개 옆에 꼬리/복 부 양쪽에는 두개골의 기본 사용 괜 찮 아 요 슈퍼 컷이 위. 기본 두뇌를 손상 하지 않도록 주의 복용 등 중간까지 rostral 방향에서 이동 하는 두개골의 꼬리 등 쪽 부분에서 시작 하는 추가 얕은 상처를 확인 합니다. ' T는 최종 확인 ' 후 각 전구의 수준에는 중간에 수직을 잘라. 참고: 합니다 주의 관심의 두뇌 지구에 아무 피해를 보장 하기 위해. 특히, 한번도 거기 이어야 한다 뇌 자체에 적용 되는 어떤 압축 힘.</li>
	<li>라운드 팁 집게를 사용 하 여 파악 rostral 중간 부분에서 시작 하는 두개골과 꼬리 옆 방향으로 다시 껍질. 균열을 양쪽 모두에 대 한 반복 열고 노출 뇌 두개골 모자 등 절반을 제거. 부드럽게 미리 냉장된 NMDG HEPES 실제의 비 커에 그대로 뇌 밖으로 특 종. ~ 1 분 균일 하 게 냉각 하기 위하여 두뇌를 허용 합니다.</li>
	<li>큰 주걱을 사용 하 여 비 커 그리고 필터 종이로 덮여 페 트리 접시에 두뇌를 들어올립니다. 트림 하 고 두뇌 슬 라이 싱의 기본 각도에 따라 원하는 관심 뇌 영역을 차단 합니다. 처리 중 장기간된 산소 부족을 피하기 위하여 신속 하 게 작동 합니다. 참고: 많은 조각화 각도 수 있습니다. 정확한 차단 방법 및 슬라이스 각도 정확한 뇌 영역, 셀 유형, 그리고 회로 공부에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>두뇌 블록 접착제 접착제를 사용 하 여 견본 홀더를 부착 충분히 완벽 하 게 내부 뇌 블록을 철회 견본 홀더 내부 조각 철회. 두뇌 블록은 agarose 완전히 덮여 때까지 소유자에 직접 녹은 agarose를 붓는 다. 사전 냉각된 액세서리 재미 ~ 10 견본 홀더 주위 블록 클램프 s는 agarose는 경화 될 때까지.</li>
	<li>기계 기계에 콘센트에 견본 홀더를 삽입 하 고 적절 한 맞춤을 확인 합니다. 250 mL 비 커에서 나머지 미리 냉장, 산소 NMDG HEPES 실제와 저수지를 충분 한 산소를 되도록 자르는 동안 저수지에 거품 돌을 이동.</li>
	<li>Agarose 포함 뇌 견본 발전 하려면 마이크로 미터를 조정 합니다. 슬라이서를 시작 하 고 경험적으로 원하는 단계로 사전 속도 진동 주파수를 조정 합니다. 참고: 설정이 모두 낮은 범위에 있어야 합니다. 최상의 결과 얻으려면 단일 생산 해야 합니다 걸릴 약 20 s와 진동 한다 명백한 맴 돌아와 매우 매끄럽고 부드러운 허 밍 소음 블레이드 팔의 전달 합니다.</li>
	<li>계속 발전 하 고 300 µ m 증가 (또는 다른 원하는 두께) 뇌 영역까지 관심의 조직 부 러 뜨 리는 구분 완전히; 조각화 절차에 대 한 총 시간 15 분 미만 이어야 합니다.</li>
</ol>5. 최적화 된 NMDG 보호 복구 절차
<ol><li>초기 NMDG 복구 단계 (중요 한 단계): 단면 절차의 완료, 모든 조각을 잘라 플라스틱 파스퇴르 파이프 t를 사용 하 여 수집 하 고 150 mL 가득 미리 따뜻하게 (34 ° C) 초기 복구 챔버로 전송 NMDG-HEPES 실제입니다. 짧은 승계에서 모든 분할 영역을 전송 하 고 모든 조각 복구 상공으로 이동 됩니다 타이머를 시작.</li>
	<li>마우스의 연령에 따라 일정 스파이크에 최적의 나+ 확인 하려면 표 2 를 참조 하십시오. 참고:이 절차 뇌 조각 챔버로 나+ 의 재 소개의 제어 속도 달성 하는 실용적인 방법을 이며는 최적화는 특정 뇌 조각 챔버 형상과 저수지 볼륨 종류 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>에 제시 된 솔루션 스파이크에서 Na+ 의 지정 된 볼륨을 추가 하 여 절차 스파이크에 stepwise 나+ 를 실행 시간. 빠른 혼합을 촉진 하기 위하여 초기 복구 챔버의 bubbler 굴뚝에 직접 솔루션 스파이크에서 Na+ 를 추가 합니다.</li>
	<li>HEPES 실제 장기 보유 약 실에 실 온에서 유지 모든 분할 영역을 전송 합니다. 조각 패치 클램프 기록 실험 시작 전에 챔버를 들고 HEPES에 추가 1 시간에 대 한 복구를 허용 합니다.</li>
</ol>6. 패치 클램프 기록
참고: 다음 기본 절차 단지 제공 하는 몇 가지 실용적인 고려 사항 및 이러한 찾을 수 있습니다 다른53,54패치 클램프 기록에 대 한 상세한 프로토콜을 대표 하기 위하지 없습니다. 패치 클램프 전기 생리학 장비는이 응용 프로그램에 대 한 필요 합니다. 이것은 일반적으로 적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC) 광학 장비 직 립 현미경의 구성 됩니다 및 형광 조명 시스템, 패치 클램프 증폭기 및 데이터 디지타이저, 동력 micromanipulator 및 현미경 플랫폼, 진동 절연, 패러데이 케이지, 테이블과 솔루션 난방 및 관류 시스템. 시료 챔버와 플랫폼 침수 슬라이스 기록을 위해 설계 되어야 한다. 다중 신경 패치 클램프 기록, 여러 앰프, 헤드 단계, 및 높은 품질 micromanipulators rig가 필요 합니다. 또한, 최상의 결과 얻으려면 rig 900 nm 적외선 대역 통과 필터를 장착 하 고 광학 구성 요소를 일치 하는 것이 좋습니다 있는 셀의 적절 한 시각화 되도록 > 50 µ m 깊은 두뇌 조각에서. Kӧhler 조명에 대 한 적절 한 정렬도 분명 시각화에 대 한 중요 하다.
<ol><li>(MM)에 세포내 피펫은 솔루션 준비: 130 K-구 루 콘, 4 KCl, 10 HEPES, 0.3 EGTA, 10 phosphocreatine 나2, 4 MgATP, 0.3 나2-GTP와 13.4 biocytin. 1 m 코 7.35에 pH 및 osmolality 285-290 mOsmol/kg 자당을 사용 하 여 필요에 따라 조정 합니다.</li>
	<li>패치 클램프 전극 두꺼운 붕 규 산 유리 모 세관;에서 준비 이상적인 패치 클램프 전극은 상대적으로 짧고 짧고 테이퍼 ~ 3-6 MOhm 가득 욕조에 팁 저항.</li>
	<li>전극 와이어 제대로 안정적인 녹음을 보장 하기 위해 chlorided 인지 확인 합니다. 이렇게 마지막 물속 여 (일반) 은색의 3-4 m m 와이어 액체 표 백제 또는 와이어 검게 될 때까지 약 30 분 동안에.</li>
	<li>솔루션 관류 오버플로가 발생 하지 않도록 유입 및 유출 일치 하도록 녹음 챔버를 통해 실제 기록 3-4 mL/분 배포 carbogenated 설정 연동 펌프를 사용 하 여 설정 합니다.</li>
	<li>단일 뇌 조각 침수 녹음 실로 전송 하 고 안전 장소 나일론 U 모양 조각 앵커를 사용 하 여 교차 문자열. 높은 전원 목표 (예를 들어, 높은 수 가늠 구멍 또는 60 X 40 X 물 침수 목표)으로 전환 하기 전에 4 X 어 목표를 사용 하 여 대상 뇌 영역을 식별 합니다.</li>
	<li>시각적으로 건강 한 목표 셀을 식별 합니다. soma에는 신경 막의 모양은 IR DIC 현미경에 의해 시각으로 패치 클램프 기록에 대 한 후보 셀의 적합성을 판단 하 사용 된다. 참고: 건강 한 신경 일반적으로 다음과 같은 기능을 전시: 수축 된도 somata, 막 가장자리, 그리고 부드러운 막 외관의 부드러운 대비를 부 어. 또한, 건강 한 세포의 대부분은 위치 > 30 µ m는 조각에 깊은 표면 신경 세포는 손상 될 가능성이 절단 수지상 프로세스. 남기고 모습을, 명확 하 게 보이는 핵 또는 '계란 튀김' 모습, 또는 매우 어둡거나 높은 대비 막 가장자리는 뉴런은 피해 야 한다.</li>
	<li>다시 채우기는 세포내 솔루션의 ~ 5 µ L로 플라스틱 패치와 전극 홀더에 그것을 로드. 피펫으로 뇌 조각 위에 녹음 목욕으로 이동 하 고 가벼운 긍정적인 압력에 있는 장애물을 제거 하. 피 펫 오프셋 0 고 막 테스트 기능을 사용 하 여 팁 저항을 모니터링 합니다.</li>
	<li>이동 대상 신경 셀 시체; 접촉 피 펫 팁 작은 보조 개는 빛 긍정적인 압력 때문에 막 표면에 형성 한다.</li>
	<li>최대한 빨리 막 보조 개 관찰 신속 하 게 긍정적인 압력을 제거 하 고 부드러운 흡입 물개 형성 촉진을 적용. 일단 피 펫 저항 증가 > 100 MOhm 예상된 휴식 막 일치 하는 수준으로 지주 명령 대상된 셀 형식에 대 한 잠재적인 설정 (-70 mV는 좋은 시작 지점).</li>
	<li>일단 팁 저항 ≥1 gigaohm에 도달, 날카로운 흡입;의 간단한 관찰을 사용 하 여 패치 피 펫 아래 막 파열 하 여 셀에 침입 하려고 '써' 기능 필요에 따라 휴식을 촉진 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 참고:-70의 지주 잠재력 mV 전압 클램프 실험 대뇌 피 질의 뉴런에 대 한 제안. 건강 한 신경 해야한다 현재 누설-100 pA 보다 더 부정적인 실험의 기간에 대 한 하지만이 부분에 셀 형식에 따라 달라 집니다. 휴식 막 잠재력은-50 보다 더 depolarized 경우 신경 분석에서 제외 될 것 이다 mV, 또는 액세스 저항 20% 이상 변경 하는 경우.</li>
	<li>
안정적인 전체 셀 패치 클램프 기록 얻은 단계 6.6-6.10을 반복 하 여 녹음에 대 한 추가 뉴런을 대상. 첫 녹음을 잃고는 기계적 장애를 피하기 위해 주의.
	<ol>
<li>100 µ m 이내 추가 뉴런 synaptically 결합 뉴런을 찾는 합리적인 가능성을 보장 하기 위해 첫 번째 신경에서 선택 합니다. 참고: 그것은 경우에 따라 여러 후보 뉴런 앞을 식별 하 고 사전 로드 하 고 미리 첫 번째 패치 클램프 기록을 수립 하기 전에 다양 한 타겟된 세포에 가까운 모든 펫 위치 도움이 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Na + 스파이크에 개선 Gigaohm 물개 형성 및 패치 클램프 기록 성공 NMDG 보호 복구 방법의 초기 버전 성인 노화 동물2,5에 대 한 특별히 설계 되었다. 일부 얼 리 어댑터는 또한 청소년 동물 뇌 조각화에이 방법론을 적용 하고자 (즉, 마우스 < 30 일). 그러나, 그것은 그 뛰어난 시각적으로 확인 신경 보존이 연령 범위에서 NMDG 보호 복구 방법으로, 달리 gigaohm 물개 형성 수 있습니다 자주 마구간, 실패 한 패치 클램프 기록 시도로 이어지는 지적 하고있다. 한 가설이 이다 NMDG 양이온 성인 뇌 조각 기준으로 청소년 뇌 조각에 갇혀 더 쉽게 인감 형성;를 방해 할 수 있습니다. 그러나, gigaohm 물개 청소년 뇌 조각 NMDG 실제 (데이터 표시 되지 않음)에 완전히 잠긴 동안에 쉽게 형성할 수 있다, 따라서 나타내는 해당 NMDG 실제 라기보다 하지 방해한 gigaohm 물개 형성.
초기 뇌 조각 복구 단계 완료에 로우 하이 나+ 솔루션에서 신속한 전환을 신경 세포 막에 손상을 원인과 perturbs 인감 형성 과정. 이것은 직관적인 주어진 Mg2 + 비율 낮은 높은 Na+, 감기-따뜻한 온도, 및 캘리포니아2 + 의 극적인 상승 전환 총칭 자발적 시 냅 스 활동의 대규모 부활 이어질. 이 금지 리바운드 단계 절차를 부 러 뜨 리는 두뇌에서 reperfusion 상해 다음 허 혈 성 모욕을 거울 것입니다. 따라서, 추가 Na+ 농도 NMDG 보호 복구 보육 실에서의 고도 천천히 점진적 절차 나+ 스파이크에 통합 되어 초기 복구 단계에서 신경 막 손상 완화 그리고 reproducibly 정확한 타이밍으로 상승. 원래 보호 복구 절차에서 온도 나+ 상승 및 캘리포니아2 +/Mg2 + 비율 상승의 임시 분리 도움이 됩니다. 하지만 또한, 절차 나+ 스파이크에 extracellular 나+ 농도 작은 증분 증가 초기 시간 포인트 및 그로 인하여 뇌 조직 affording 늦은 시간 포인트 향해 큰 증가 더 나은 상승 없음+ 수준에 맞게 기회. 이 절차는 점진적 솔루션 exchange 대신 제어 관류 펌프 또는 중력에 의해 물방울 라인 나+ 수준에 일정 한 증가에 지도 하 고 유입 및 유출 슬라이스 챔버의 오버플로가 발생 하지 않도록 주의 해야. 특히,이 나+ 에서 스파이크에 절차 슬라이스 챔버에 솔루션의 osmolality 점차적으로 상승 조각 정상 osmolality 솔루션, 반환 됩니다 있지만이 부정적인 슬라이스 상태를 영향을 받지 않았다 하기 전에 몇 분 동안 또는 패치 클램프 기록 성공. 높은 osmolality 절단 솔루션 이전 midbrain 슬라이스 준비에 대 한 더 나은 것이 임시 패치 클램프 기록57,58, 따라서 시연에 대 한 도파민 뉴런을 보존 하기 위해 사용 되었습니다. hyperosmolality는 어떤 상황에 도움이 될 수 있습니다.
NMDG 보호 복구 방법 및 점진적 나+ 를 결합 하 여 최적화 된 절차를 구현 하 여 스파이크에 단계가 뇌 조각 방법론의 유틸리티 성숙한 성인 동물 나가를 통해 청소년을 충당 하기 위해 확장 되었습니다. 이 업데이트 된 프로토콜은 이제 단일 최적의 NMDG 실제 수립 및 절차를 사용 하 여 동물의 넓은 범위에 적합. 필요한 경우, 절차 나+ 스파이크에 점차적으로 더 이상 지연 또는 느린 시간 과정 오래 된 동물에서 뇌 조각의 생존 능력을 향상 시키기 위해 적용 될 수 있으며 권장된은 스파이크에 따라 일정의 기본적인 가이드를 제공 하는 우리 동물의 나이 ( 표 2참조). 우리가 다양 한 응용 프로그램에 대 한 적절 한 기본 프레임 워크를 제공 하는 동안 더 생존 및 성인 및 노화 동물에서 뇌 조각의 수명 향상을 위한 추가적인 고급 단계를 탐험 수 있습니다. 예를 들어 티 복원이 점에서 특히 효과적 전략과2,6설명 되어 있는 대로 실행 될 수 있다.
도전 하는 실험에 대 한 처리량을 개선 패치 클램프 기록에 의해 시 냅 스 연결의 분석은 성공의 높은 신뢰성을 달성 하기 위해 신경 구조와 기능 둘 다의 우수한 보존을 필요로 하는 까다로운 응용 이다. 동시에 기록 하는 뉴런의 숫자로 올라간다 선형, 기술 난이도 위에 선형 올라간다. 실패의 가장 빈번한 원인 중 하나는 하나 이상의 대상된 셀에 양식 적절 한 gigaohm 물개를 및 수많은 실패 모드, 있다. 이 극적으로 진행, 3 때 특히 속도가 느려질 수 또는 더 많은 뉴런을 동시에 기록 합니다. 빠른 찾기와 일치 gigaohm 최적화 된 NMDG 보호 복구 방법으로 형성 시간 인감, 유전자 변형 두 성인 성공률 및 다중 신경 패치 클램프 기록 실험의 처리량 표시 개선 했다 마우스 뇌 조각 고 인간의 신경외과 뇌 조각. 향상 된 효율은 거의 확실히 더 신속 하 고 신뢰할 수 있는 gigaohm 물개 형성 및 조각이 프로토콜의 향상 된 신경 보존에 기인. 이 프로토콜은 명시적으로 패치 클램프 기록 응용 프로그램에 대 한 혜택에 초점을 맞추고, 비록 유사한 이득은 뇌 조각 생존 능력은 최고 이다 다른 도전적인 실험 응용 프로그램 예상 됩니다.

급성 뇌 슬라이스 준비 신경 과학에 필수적인 실험 모델 시스템입니다. 대략 세기의 절반,이 플랫폼은 다양 한 해부학 적 뇌 영역 및 동물 종 살아있는 뇌의 동적 기능 연구 활성화. 인지 의도 한 응용 프로그램이 생화학, 기능적인 화상 진 찰, 형태학, 생리학, 최적의 무결성과 슬라이스 조직의 생존을 보장 하기 위해 매우 중요입니다. 그것은 따라서 탁월한 청소년 설치류 두뇌 슬라이스 준비 (즉, 마우스에 대 한 출생 후 하루 30 미만) 날짜를 가장 선호 되었습니다. 충분히 건강 한 뇌를 얻기에 있는 어려움 성숙한 어른에서 조각 하 고 동물 노화 대부분에 대 한 강력한 도전을 입증 성숙 뇌의 기능적인 건축을 공부에 대 한 심각한 한계를 부과 했다. 이것은 특히 패치 클램프 기록, 우수한 형태학 및 기능 보존을 요구 하 고 확인 된 단일 뉴런의 상세한 본질적인 속성과 시 냅 스 특성화를 위한 불가결 한 기술에 대 한 사실. 지난 몇 십년에 대 한 패치 클램프 electrophysiologists의 대다수는 건강 한 두뇌 조각에서 청소년, 그리고 훨씬 덜을 준비 하기 위한 낮은 나+ 실제 자당 대체1 을 사용 하 여 '보호 절단' 방법에 의존 해야 범위, 젊은 성인 동물입니다. 이 방법은 수동 나+ 유입 및 후속 물 항목 및 셀 슬라이스 절단 단계 동안 붓기는 주된 모욕 뉴런의 가난한 생존에는 특히 그 신경에 위치한 대 한 전제에 기반으로 합니다 표면 층 블레이드 운동에서 직접 외상을 유지할 가능성이 높습니다. 그러나, 보호 절단 방법 아직도 구현 특정 실제 배합에 성숙한 성인 동물에서 뇌 슬라이스 준비에 대 한 원하는 수 많은 나뭇잎.
이 문제에 대 한 간단 하지만 효과적인 솔루션 되었습니다2,,34,,56 을 설명 하 고 '보호 복구' 뇌 조각 방법 되 나. 이 메서드의 원래 버전 사용 NMDG 대체 실제 NMDG가 가장 다양 하 고 효과적인 다양 한 다른 후보 나트륨 이온 대체 (자당, 글리세롤, 콜린, 트리 스 포함) 들로 식별 합니다. 미디어 배합 HEPES 뇌 조각 부 종에 저항 하 여 강한 pH7, 버퍼링를 제공의 추가 산화 스트레스 (표 1)의 해로운 효과 중화 하는 보충의 추가 의해 더 강화 되었다. 그것은 경험적으로 초기 복구 인큐베이션 낮은 나+, 낮은 캘리포니아2 +에 그리고 높은 Mg2 + NMDG 실제 필요 하 고 충분 했다 성인 뇌 조직을 자르는 직후 신경 향상을 결정 했다 뇌 영역, 세포 유형, 및 동물 연령대3,,56의 넓은 범위에 보전.
특히, 무엇 지금 보호 복구 방법 별명의 이전 화신은 문학1,,89,10,11,12, 에서 찾을 수 있습니다. 13비록 완전 한 잠재력에 대 한 성숙한 성인 아니었다 노화 동물 뇌 조각과 패치 클램프 기록 인식 또는이 이전 작품에서. 또한, nuanced 절차 유사 계속 특정 실험적인 응용 프로그램4,14,,1516지원 등장 하. 이러한 수많은 연구 그룹의 작품의 집단 시체는 향상 된 조직 보존의 보호 복구 방법의 견고성에 높은 자신감을 부여. NMDG 보호 복구 방법은 이제 널리 채택 되었고 동물 뇌 슬라이스 준비를 이용 하 여 수많은 출판된 연구 연구에서 구현. 이러한 급성 슬라이스 연구 스팬 neocortical3,,1718, hippocampal15,,1920,21, striatal22 , 23 , 24, midbrain25,26,27,,2829, 그리고 hindbrain30,,3132, 33 , 34 지역, 그리고 다양 한 신경 전달 물질 neuromodulator 형식과 glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,35 포함 하 여 ,36, dopaminergic24,29,,3738, 해14,,3738, 39, noradrenergic40및28 neurotransmission serotonergic27,. 방법은 또한 유전자 변형 동물3,39 에서 또는 vivo에서 바이러스 주사17,27, 다음 파생 된 조각에 신경 활동의 optogenetic 제어에 적합 28,40,41,,4243, 잘 기능 캘리포니아2 + 신경 활동2,44의 영상으로 ,,4546. 단기적인이 소성4,,4748 및 다양 한 형태의 장기 소성16,,3548 의 분석 되었습니다. 보고. 최근 연구에서 성숙한 성인 마우스 두뇌 분할 구성49 를 기록 하는 octopatch를 사용 하 여 시각 피 질에서 시 냅 스 연결의 광범위 하 고 체계적인 검색을 촉진 하기 위하여 NMDG 보호 복구 방법을 적용-강력한 유틸리티 및이 방법의 견고성의 데모. 보호 복구 방법 있다도 등, 맥 관 구조 및 대뇌 피 질의 뇌 조각50, 패치 클램프에서 기록에 pericytes의 향상 된 보존 이전 뜻하지 않은 실험적인 문맥에서 성공적으로 적용 된 1-1.5 년 오래 된 Alzheimer의 질병 마우스 모델20에는 성인 뇌 조각 수용 체 밀매 분석 결과51interneuron 인구를 이식.
다음 프로토콜 뇌 슬라이스 준비 급성 뇌 조각의 생존 능력을 개선 하는 최적화 된 NMDG 보호 복구 방법 구현에 대 한 단계별 절차를 설명 합니다. 복잡 한 다중 신경 패치 클램프 실험 젊은 성인 유전자 변형 마우스 뇌 조각에 성숙한 성인 기록에 대 한이 방법론의 명확한 혜택의 데모 뿐만 아니라 향상 된 신경 보존에 대 한 원리는 설명 신경외과 뇌 조각입니다. 다음 프로토콜 성인 환자에서 파생 된 인간 신경외과 표본에 관해서는 더 이상의 세 일에서 마우스 뿐만 검증 않았습니다.

<table style="width:948px;" width="948">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:319px;height:21px;">Compresstome VF-200</td>
			<td style="width:185px;">Precisionary Instruments</td>
			<td style="width:131px;">VF-200</td>
			<td style="width:315px;">Vibrating tissue slicer (recommended)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2,2-Tribromoethanol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Anesthetic component 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-methyl-2-butanol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>240486</td>
			<td>Anesthetic component 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved blunt forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11065-07</td>
			<td>Brain dissection tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine dissecting scissors (supercut)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>Brain dissection tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large heavy duty scissors 7&#39;&#39;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-18</td>
			<td>Brain dissection tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal spatula</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z511455-1PAK</td>
			<td>Brain dissection tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89031-954</td>
			<td>Brain dissection tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain Slice Keeper-4</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>S-BSK4</td>
			<td>brain slice holding chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nylon netting&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0198</td>
			<td>For building small slice recovery chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyrex glass beakers (250 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-434</td>
			<td>For building small slice recovery chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm plastic dish, round</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100488-376</td>
			<td>For building small slice recovery chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas diffuser stones (10 &#181;m)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59277</td>
			<td>For constant carbogenation (fine bubbles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose Type I-B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0576</td>
			<td>For embedding brain specimens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro loader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491229</td>
			<td>For filling patch clamp electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td>For making a custom dissecting platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td>For pH adjustment of media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465-25G</td>
			<td>For pH adjustment of media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td>For pH adjustment of media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipets 3 mL graduated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89497-676</td>
			<td>For slice transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zirconium ceramic injector blades</td>
			<td>Cadence Specialty Blades</td>
			<td>EF-INZ10</td>
			<td>http://cadenceinc.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KG-33 borosilicate glass capillary w/filament</td>
			<td>King Glass Company</td>
			<td>custom quote</td>
			<td>ID: 0.87mm, OD 1.50mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphocreatine disodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4500-100G</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2-GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51120</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heated water bath (2.5L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:131px;">13491-060</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter paper rounds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28456-022</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000BQRBO6</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-326</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mL syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD302832</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD-309628</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 5/8 gauge needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-292</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer (w/1.5 mL tube block)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89232-908</td>
			<td>To keep agarose molten&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute brain slices using an optimized n-methyl-d-glucamine protective recovery method

이 프로토콜은 N에 실용적인 가이드-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 많은 최근의 연구 신경 보존 및 전반적인 뇌 조각 생존 능력 강화를 위한이 방법의 유틸리티를 확인 했습니다. 얼으로이 기술의 구현 동물, 뇌 영역, 세 종류의 넓은 범위에 걸친 다양 한 실험적인 응용 프로그램을 사용 하 여 뇌 기능에 대 한 자세한 조사를 촉진가. 단계는 패치 클램프 전기 생리학에 대 한 건강 한 뇌 슬라이스를 안정적으로 최적화 된 NMDG 인공 척수 (실제) 미디어 수립 및 향상 된 절차를 사용 하 여 보호 복구 뇌 조각 기술 수행에 대 한 설명. 이 업데이트 방법에서는 속도에 상당한 개선을 관찰 하 고 gigaohm의 신뢰성 밀봉 대상된 패치 클램프 실험 도전 촉진 함으로써 우수한 신경 보존을 유지 하면서 녹음 하는 동안 형성 실험적인 응용 프로그램입니다. 대표 결과 neocortical 두뇌 조각에서 시 냅 스 연결 젊은 성인 유전자 변형 생쥐와 성숙한 성인 인간의 신경외과 표본에서 준비 하는 여러 신경 패치 클램프 실험 분석 결과를 기록에서 제공 합니다. 또한, 뇌 조각화의 최적화 된 NMDG 보호 복구 방법 모두 청소년 및 성인 동물, 따라서 원래 방법론의 한계를 해결와 호환 됩니다. 요약 하자면, 다양 한 수 종과 우수한 생존 능력 및 조직 보존을 달성 하는 연령대에 걸쳐 단일 미디어 수립 및 절차를 부 러 뜨 리는 두뇌를 구현할 수 있습니다.

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Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

preparation-acute-brain-slices-using-an-optimized-n-methyl-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

45.7K 조회수.  Allen Institute for Brain Science. 이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

비디오: Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

연구

신경과학

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Optimized Management of Endovascular Treatment for Acute Ischemic Stroke

This manuscript describes a streamlined protocol for the management of patients with acute ischemic stroke, which aims at the minimization of time from hospital admission to reperfusion. Rapid restoration of cerebral blood flow is essential for the outcomes of patients with acute ischemic stroke. Endovascular treatment (EVT) has become the standard of care to accomplish this in patients with acute stroke due to large vessel occlusion (LVO). To achieve reperfusion of ischemic brain regions as fast as possible, all in-hospital time delays have to be carefully avoided. Therefore, management of patients with acute ischemic stroke was optimized with an interdisciplinary standard operating procedure (SOP). Stroke neurologists, diagnostic as well as interventional neuroradiologists, and anesthesiologists streamlined all necessary processes from patient admission and diagnosis to EVT of eligible patients. Target times for every step were established. Actually achieved times were prospectively recorded along with clinical data and imaging scores for all endovascularly treated stroke patients. These data were regularly analyzed and discussed in interdisciplinary team meetings. Potential issues were evaluated and all staff involved was trained to adhere to the SOP. This streamlined patient management approach and enhanced interdisciplinary collaboration reduced time from patient admission to reperfusion significantly and was accompanied by a beneficial effect on clinical outcomes.

The outcome of patients with acute ischemic stroke depends on swift restoration of cerebral blood flow. This protocol aims at optimizing the management of such patients by minimizing peri-procedural timings and rendering the time from hospital admission to reperfusion as short as possible.

급성 허 혈 성 뇌졸중 혈관 내 수술 치료의 최적화 관리

This manuscript describes a streamlined protocol for the management of patients with acute ischemic stroke, which aims at the minimization of time from ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

성인 소뇌 슬라이스에 장기 우울증 유도의 평가

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...