이 프로젝트는 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소에서 NIH 교부금 U01HL098180에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 심장, 폐의 공식 견해를 대변하지 않습니다, 및 혈액 연구소 또는 국립 보건원

1. 시약 설정 1.1 해부 및 영상 매체 Leibovitz의 L-15 배지 (L15)는 기관 샘플 수확 및 이미징을 수행하는 동안 사용되는 FBS (10 %)과 페니실린 - 스트렙토 마이신 (100 단위 / 페니실린 G 나트륨과 스트렙토 마이신 황산염 100 ㎍ / ㎖의 ML)로 보충된다. 2. 얕은 벽으로 둘러싸인 문화 챔버 어셈블리 기관 조직을 보유하는 데 사용되는 챔버는 그림 1에 표시됩니다. 챔버의 바닥은 유리 35mm 배양 접시 바닥이다. 챔버의 상단과 측면이 유리 접시 위에 0.3 mm 두께의 실리콘 시트의 작은 조각을 배치하여 생성됩니다. 시트의 가장자리가 둥근 바닥 요리에 맞게 절단 및 센터는 추가 (단계 2.1-2.3 참조) 얕은 중앙 챔버를 형성하기 위해 트림합니다. 이 어셈블리의 상단에, 18mm의 둥근 유리 커버 슬립이 영상에 적합한 밀폐 챔버를 생성하기 위해 배치됩니다. <ol><li> 완전히 0.3 mm 두께의 실리콘 시트의 사각형 18mm 원형 유리 커버 슬립을 포함한다. </li><li> 표준 날카로운 해부 가위 커버 슬립 (실리콘 시트의 원형 레이어의 결과)의 가장자리 주위에서 초과 실리콘 시트를 트림. </li><li> 날카로운 메스를 잘라와 커버 커버 슬립 (따라서 이미징 챔버의 상단과 측면을 형성)의 중간에서 실리콘 시트 (약 10mm 광장)의 중앙 광장을 제거와 함께. </li></ol> 3. 기관 수확 및 준비 <ol><li> 지역 기관 동물 관리에 따라 쥐를 안락사와위원회 및 / 또는 정부의 지침을 사용하여 잠수함의 조직에 충분한 L15 미디어 (저자를 통해, 단지 임신 일 16.5에서 출생하기 전에 마우스를 사용하고있는 표준 플라스틱 35mm 배양 접시에 기관을 제거 신생아, 신생아, 성인 동물 2). </li><li> 의 외부에 부착 된 비 기관 관련 조직을 제거무딘 절개를하여 기관. </li><li> 다만 마이크로 해부 가위 (그림 2A, 선 1)를 사용하여 윤상 연골 아래에 가로 컷 후두를 제거합니다. </li><li> 마이크로 해부 가위 (그림 2A, 선 2)를 사용하여 바로 카리나 위의 가로 컷으로 왼쪽과 오른쪽 주 기관지 분지를 제거합니다. </li><li> 부드럽게 미세 집게로 기관을 보유하고 점액과 혈액을 맑게하는 P1000 Pipetman과 P1000 팁 입욕 L15 매체의 ~ 1 ml의 루멘 2 ~ 3 회 세척하십시오. </li><li> 마이크로 해부 가위 (그림 2B, 선 1) 가로 컷을 사용하여 기관지의 3-4 링 세그먼트를 잘라. </li><li> 마이크로 해부 가위 (그림 2B, 선 2)를 사용하여이 짧은기도 세그먼트의 trachealis 근육의 중앙을 세로 방향으로 잘라. </li><li> 마이크로 해부 가위 (그림 2C를 사용하여 기관 연골 고리의 중앙을 세로 방향으로 잘라 그림 2D에서와 같이)를 떠나&gt; 라인). </li></ol> 4. 속눈썹 영상 <ol><li> 이전 기관 조직 부문, L-15 매체의 100-200 μL와 35mm 유리 바닥 문화 요리의 중간에 내려 루멘 쪽. </li><li> 속눈썹 생성 흐름이 기관의 조직 샘플을 (~ 1 × 10 11 입자 / ㎖ 또는 Fluoresbrite 2.5 % 수성 microsphere의 현탁액 20 μL / ㎖) 목욕 L-15 배지에 형광 0.20 ㎛의 작은 양의 마이크로를 추가 계량합니다. </li><li> 실리콘 시트로 잘라 창에 의해 형성된 얕은 벽 챔버의 중앙에있는 기관의 샘플, 이미징 챔버 아래 기관 샘플 실리콘 시트면의 상단에 (위의 1-3 절차를 참조하십시오) 이전에 준비를 놓습니다 (그림 1 ). </li><li> 조심스럽게 제자리에 고정 coverslip을 아래로 밀어 가장자리저기서을 넘는 L-15 용지를 제거조지아 P1000 팁 P1000 Pipetman. </li><li> 100X 목적 및 DIC 광학 거꾸로 현미경에 35mm 유리 바닥 문화 요리와 기관 샘플을 장착합니다. </li><li> 고속 카메라와 영화 수집 소프트웨어를 사용하여 200 섬모 운동의 영화를 수집 +의 섬모 기관 상피에 따라 초당 프레임 (그림 2D 박스, E 윤곽 : 녹화 된 동영상에서 예를 스틸 이미지) trachealis 근육의 가장자리를 웅크 리고 (보충 영화 1). </li><li> FITC epifluorescent 이미징 및 저조도 CCD 카메라 (위의 장비 목록을 참조)를 사용하여, 속눈썹 생성 흐름 (보충 영화 2) 이후 정량화 할 수 있도록 섬모 기관 상피의 표면에 형광 microsphere의 운동의 영화를 수집합니다. </li></ol> 5. 섬모 운동성의 정량 <ol><li> ImageJ에 소프트웨어 패키지에 DIC 이미지 한 영화를로드하고 I에서 설명하는 방법에 따라아인 Drummond는 13 박동 섬모를 건너 래스터 선을 그리는 선 도구를 사용합니다. 이 라인의 &quot;다시 분할은&quot;라인에 걸쳐 섬모 운동이 파형을 생성 kymograph 형식 이미지를 생성합니다. 각 파의 피크 사이의 픽셀 수는 그들을 측정 (하나의 픽셀 = 1 동영상 프레임) 분당 비트 (즉 Hz에서)의 수는 다음 계산 될 수있는 것입니다. </li><li> ImageJ에 소프트웨어 패키지로 속눈썹을 흐름이 생성 부하 형광 구슬 영화를 측정하고 수동으로기도 상피의 표면에 형광 구슬을 추적하고 소프트웨어를 추적 각 비드 비드 속도와 방향성을 생성하도록 MTrackJ 플러그인 14을 사용합니다. </li></ol> 치는 속눈썹의 거리로 흐름을 정량화하는 강력한 측정 유량 크기에 영향을 미칠 수있는 형광 구슬을 사용하는 경우주의해야합니다. 보충 영화 2 구슬 운동은 이것의 좋은 예입니다. 이 예제 비드의운동 박동 섬모의 표면에 빠르고 훨씬 더 멀리 목욕 미디어 비즈 끊깁니다. 이를 위해 제어하려면, 구슬 트레이싱은 정확한 비교를 할 수 있도록 모든 샘플에있는 섬모 상피 위의 고정 된 거리에서 수집해야한다. 마지막으로, 유체의 흐름에 대한 대표적인 데이터를 얻기 위해, 구슬은 가급적 대해 추적해야한다, 우리는 유체 흐름을 계산하기위한 10 + 섬모 세포를 커버 비드 트랙을 사용하는 것을 선호합니다.

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).</li><li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia.">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cilia+in+zebrafish.">Studying cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations.">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li><li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia.">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li><li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells.">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

속눈썹 비트 주파수 측정 (CBF)는 고성능 현미경 목표와 빠른 이미지 수집 하드웨어 13,15을 사용하여 비교적 쉽고, CBF 측정은 건강과 질병 중에 점막 섬모 허가를 조사하고 대부분의 연구의 기초를 형성 이유를 설명합니다. CBF 측정 혼자 CBF의 점막 섬모 정리, 측정을 이해하기위한 필수적인 반면, 섬모 생성 흐름을 측정하기가 더 어렵 자주 무시되는 둘 중 속눈썹 비트 파형 모두의 근본적인...

기도 상피 세포의 운동성 섬모 기능의 분석은 점막 섬모 통관 및 폐 건강 한 영향을 미칠 수있는 유전과 환경 요인을 해명 실험적으로 중요합니다. 영상에 마우스기도 상피를 위해 개발 된 간단한 프로토콜은 돌연변이와 녹아웃 마우스 모델에서기도 섬모 운동을 심문하는 효율적인 방법을 제공하고 마우스 기관 조직의 절개와 높은 해상도 videomicroscopy와기도 섬모 운동의 생체 이미징는 기본 기술을 필요로합니다. 이 프로토콜은 이소성 2-5과 관련된 선천성 심장 질환을 가진 돌연변이의 운동성 섬모 기능의 신속한 평가 (속눈썹 비트 주파수, 섬모 구타 모양, 속눈썹 생성 흐름)을 허용하는 대규모 마우스 돌연변이 화면 중에 설립 세련된. 기도 섬모 운동을 연구하는 데 사용되는 현재의 기술은 급성 전 생체 유형 또는 경도 하나에 그룹화 할 수 있습니다체외 실험 방법의 GER 용어입니다. 급성 실험은 생체 인간 코 /기도 브러시 생검의 시각화 6,7 간단한 가로기도 섹션 8의 분석을 포함. 체외 방식은 공기 액체 인터페이스를 문화 나기도 현탁 배양 9-11에서와 같이 차별화 된 섬모 상피의 시트를 생성하는 다양한 세포 배양 기술을 활용합니다. 모든 사용 가능한 섬모 상피 세포가 실험 (4-6주 9,10)에 대해 생성되기 전에 그러나, 이러한기도 상피 reciliation 기술은 시간과 교육에서 매우 중요한 투자를 필요로합니다. 기도 상피 브러시 생검의 급성 전 생체 분석은 일반적으로 인간의 임상 연구에 사용하고 있지만,이 방법은 더욱 악화 기계적 조직 손상 12에 의한 마우스 연구에서 사용할 수 없습니다. 양해 각서 (MOU)의 분석을 위해이 프로토콜에 설명 된 기술E 기관기도 상피 실행할 단순 아니지만, 그것은 특별한 해부 기술도 videomicroscopy하여 이미징을위한 그 표준 이외의 특수 장비 전혀 필요하지 않습니다. 이 간단한 프로토콜에 많은 장점이 있습니다. 마우스 기관 조직 수확을 실시 할 빠르고 쉽기 때문에 첫째, 그것은 쥐의 큰 숫자기도 섬모 기능의 신속한 평가를 위해 수 있습니다. 이 체외 치료 다른의 단기 효과 급성 분석을 포함 할 수 있습니다. 둘째, 생체 기술되고, 섬모기도 상피 세포는 지원 조직을 기본에 붙어 남아 있으므로 관련된 세포 신호 경로를 유지합니다. 따라서 체외 reciliated기도 상피 세포에 비해,이 혼합물은 생체 조직 환경에서 자연의 더 나은 표현입니다. 셋째,이 프로토콜을 허용 운동성 섬모 F의 객관적인 평가를 제공 할 수있는 다른 양적 변수의 숫자의 취득기름 부음. 마지막으로,기도 섬모 시각화를위한 다른 현재의 방법과는 달리,이 프로토콜은 섬모 비트의 고해상도 이미징 및 metachronal 파 생성을위한 최적 속눈썹의 프로필보기를 허용, 속눈썹 비트 방향에 직각 속눈썹의 시각화 수 있습니다 . 이 프로토콜은 이러한 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는기도 섬모 기능 및 생성 / 유지 보수 등의 점액 부하 등의 기계적 요인의 역할과 실험의 다양한 요구를 해결하기 위해 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다 기도 섬모 비트와 metachronal 파동 전파.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz's L-15 Medium </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>21083-027 </td>
 <td>No phenol red </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum </td>
 <td>Hyclone </td>
 <td>SH30088.03 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>15140-122 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x fine forceps </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-4976 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5676 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5620 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-9801-15 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 pipetman </td>
 <td>Gilson, Inc </td>
 <td>F123602 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 tips </td>
 <td>Molecular BioProducts </td>
 <td>2079E </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 mm round glass cover slips </td>
 <td>Fisher Scientific </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic 35 mm culture dishes </td>
 <td>Corning </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom 35 mm culture dishes </td>
 <td>Warner Instruments </td>
 <td>W3 64-0758 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick </td>
 <td>AAA Acme Rubber Co </td>
 <td>CASS-.012X36-63908 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.20 &mu;m diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres </td>
 <td>Polysciences </td>
 <td>09834-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters </td>
 <td>Lecia</td>
 <td>DMIRE2 </td>
 <td>Brand is not critical. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters</td>
 <td>Lecia </td>
 <td></td>
 <td>Brand is not critical.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope stage Incubator</td>
 <td>Lecia </td>
 <td>11521749 </td>
 <td>Not required if imaging cilia at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed camera bright field </td>
 <td>Vision Research </td>
 <td>Phantom v4.2 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 125 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed fluorescent camera </td>
 <td>Hamamatsu </td>
 <td>C9100-12 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 10 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Movie analysis software</td>
 <td>National Institutes of Health</td>
 <td>ImageJ with MtrackJ plugin</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

ex vivo method for high resolution imaging of cilia motility in rodent airway epithelia

점막 섬모 정리 기능에 대한 통찰력을위한 중요한 운동성 섬모 기능의 정량적 분석을위한 영상 마우스의기도 상피 세포에 대한 생체 기술이 설립되었습니다. 갓 수확 마우스 기관은 trachealis 근육을 세로로 잘라 유리 바닥 접시에 얕은 벽 챔버에 장착된다. 기관의 샘플은 길이 방향으로 컬하는 trachealis 근육을 활용하기 위해 긴 축을 따라 배치됩니다. 이 전체 기관 길이에 따라 프로필보기 섬모 운동의 이미지를 수 있습니다. 200 프레임 / 초의 영상은 섬모 비트 주파수와 섬모 파형의 정량 분석​​을 할 수 있도록 차등 간섭 대비 현미경과 고속 디지털 카메라를 사용하여 얻을 수 있습니다. 영상 중에 형광 구슬의 추가와 함께, 섬모 발생 유량도 측정 할 수 있습니다. 프로토콜 시간은 챔버 준비를위한 5 분에서 약 30 분, 샘플에 대한 5-10 분에 걸쳐설치 및 videomicroscopy 10 ~ 15 분.

동영상 재생 100 %, 속눈썹 비트 (보충 영화 2의 방향으로 눈에 띄는 흐름; 통제기도 섬모가 명확하게 볼과 조정 방법 (동영상 재생이 15 % 실시간으로 느려집니다 보충 영화 1)에서 이길 볼 수 있어야합니다 ) 시간 진짜. 섬모 영화의 정량은 그림 3에서 본 것과 유사한 결과를 얻을 수 있어야합니다. 형광 구슬의 추적 섬모 생성 유속의 측정 (그림 3D)을</strong...

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Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한​​ 쉽고 안정적​​인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.

설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

ex-vivo-method-for-high-resolution-imaging-cilia-motility-rodent

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

20.7K 조회수.  University of Pittsburgh. 기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한​​ 쉽고 안정적​​인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.

비디오: Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

성장 콘스의 고해상도 이미징을위한 Aplysia에서의 연결을 셀 문화

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

연구

생물학

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

운동성의 시공간 매핑<em&gt; 전의 VIVO</em내장의&gt; 준비

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

고해상도 방법 IRF3의 인산화에 의존 활성화를 모니터링하려면

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...