<p class="jove_content"&gt; 우리는 일렉트로 일러스트 레이 션에 대 한 박사의 Yuval 고 트립 - 인 Dror 감사합니다. 이 작품은 이스라엘의 정신 생물학에 대한 국립 연구소와 니더 작센 - 이스라엘 연구 협력 프로그램의 DSD에 보조금 및 이스라엘 과학 재단, 보건 이스라​​엘 사역 및 우수성 유산 유산 센터에서 AK로 보조금에 의해 지원되었다 생명 과학 협력.</p&gt;

1. 후뇌의 Electroporation에 1.1 에그 처리 <ol><li> 가습 배양기 (37-38.5 ° C)에서 수평으로 계란을 넣습니다. 배아들은 16-17 (HH) 단계 (25-30 somites)에 도달했을 때, 배양 65 ~ 70 시간 후 electroporation하여 있습니다. </li><li> 인큐베이터에서 계란을 제거, 그들은 수평 위치에 남아 있습니다. </li></ol> 1.2 준비 <ol><li> 유리 모세관 (0.5 mm 직경)을 당깁니다. </li><li> 펄스 발생기에 어댑터 홀더 구부러진 L-모양의 금 Genetrodes 전극 (3 mm 직경)를 연결합니다. 일렉트로 매개 변수는 25 볼트 5 펄스 수, 45 밀리 초 펄스 길이 300 밀리 초 펄스 간격이 (가) 있습니다. </li><li> 입 피펫, 10 ML의 주사기 바늘, 파라 필름 (parafilm) 스트립, 부드러운 브러시, 날카로운 해부 가위, 25 ML 멸균 PBS 용액을 준비합니다. 이 금액은 일반적으로 계란 트레이 (18 알)을 처리하기에 충분합니다. </li><li> DNA 플라스미드의 적절한 혼합 (5 ㎍ / ㎕의 각을)를 준비하고DNA 주사를 시각화하는 0.025 % 빠른 그린 염료에 대해 추가합니다. 보통 4 μL의 볼륨 트레이의 주입을위한 충분합니다. </li></ol> 1.3 윈도우, 사출 및 Electroporation에 <ol><li> 70 % 에탄올로 달걀 껍질을 청소합니다. </li><li> 공기에 배아 노출 시간을 최소화하기 위해 한 번에 하나의 계란을 처리합니다. </li><li> 가위 끝 계란 극에 구멍을 뚫어 주사기와 알부민의 3-4 ML를 제거합니다. 그것은 생존을 감소로 알부민의 큰 금액을 제거하지 마십시오. </li><li> 해부 가위를 사용하여 달걀 껍질의 상단 중앙에 작은 타원형 창 (2.5 × 2 cm 크기)를 엽니 다. </li><li> 전체 과정 동안 건조를 방지하기 위해 태아의 상단에 PBS 몇 방울을 드립. </li><li> 유리에 DNA 혼합물의 작은 금액을로드하면 입 피펫을 사용하여 모세관. </li><li> 쪽으로의 후방 끝 배아를 놓습니다. 배아가 명확하게 볼 수로 잉크가 주입이 단계에서 필요하지 않습니다. 잉크 분사 증가 방지배아 생존. ~ 45 °에서 모세관을 잡고 꼬리 후뇌에 침투. 배 주위로부터 막을 제거하지 마십시오. 공기 방울을 형성하지 않고 후뇌 루멘 내쉬고 조심스럽게 DNA 용액을 주입. DNA 솔루션은 전방으로 펼쳐집니다. </li><li> 바로 DNA 주입 한 후, 정확한 AP 및 대상을 목표로 DV의 후뇌 위치에서 평행 전극을 배치합니다. 이 가능성을 줄일 수 있으므로, 마음을 건드리지 않고 약간 ventrally 전극을 밀어 넣습니다. electroporator를 펄스. 전극 (그림 1A) 전기 전도도를 나타내는 거품으로 덮여해야합니다. </li><li> 조심스럽게 전극을 제거하고 배아를 냉각하고 거품을 제거하기 위해 PBS 몇 방울을 똑. 배양 중에 건조를 방지하기 위해 파라 필름 (parafilm) 스트립이 제대로 개방 계란을 밀봉하십시오. 부드러운 브러시로 PBS에 전극을 세척 할 것. </li><li> 시간의 원하는 기간 동안 인큐베이터에 계란을 넣습니다. 배아의 생존을 2 ~ 3 일 후에 약 90 %로일렉트로, 그리고 50 %의 electroporation 후 최대 12 일이 줄어 듭니다. </li></ol> 2. 배아의 분석 2.1 평면 마운트 준비와 면역 <ol><li> 후뇌의 평면 마운트 준비는 쉽게 현미경 또는 입체 음향 현미경으로 축삭을 시각화하기 위해 E6.5까지 수행 할 수 있습니다. </li><li> 주변 점막과 혈관에서 분리하여 조심스럽게 배아를 해부. PBS를 포함하는 코팅 페트리 접시 - 작은 실리콘에 배아를 놓습니다. dorsally에 직면 텅스텐 핀으로 접시에 배아를 연결합니다. 후뇌 날카로운 유리 모세관을 사용하여 지붕 플레이트 등의 슬릿을 수행합니다. </li><li> 날카로운 핀셋 및 마이크로 가위를 사용하면 머리의 상단 부분을 잡고 주동이의 꼬리에 매우 신중 후뇌 조직을 당겨. 후뇌의 분리 후 깨끗한 준비 도달하기 위해 남아있는 복부 조직을 제거합니다. </li><li> 4와 후뇌을 품어상온에서 1 ~ 2 시간 동안 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 (RT). PFA를 제거하는 PBT (PBS/0.1 % 트리톤 X-100)와 후뇌을 씻으십시오. </li><li> 평면 장착 hindbrains에서 면역 형광에 대한 차단 솔루션을 500 μL (4시 ON 1 차 항체 ° PBT와 C. 워시 (15 분 × 3)와 RT 품어에서 2 시간 동안 PBT와 부화에있는 염소 혈청의 5 %를 추가합니다. 품어은 RT에서 2 시간 동안 2 차 항체. PBT (15 분 × 3)로 씻으십시오. </li><li> 유리 슬라이드에 dorsally 직면 후뇌를 놓습니다. 후뇌에 형광등 설치 미디어를 추가 할 수 있습니다. 슬라이드 후뇌을 평평하게하는 유리 모세관 또는 텅스텐 바늘을 사용합니다. </li><li> 커버 슬립에 의해 조직의 압박을 방지하기 위해 각 모서리에 그리스의 작은 금액을 추가합니다. 후뇌의 상단에 커버 슬립을 조심스럽게 배치하고 공기 방울을 피하십시오. 준수를위한 유리제 가장자리를 커버하기 위해 매니큐어를 추가합니다. </li></ol> 2.2 극저온 섹션과 면역 형광 <ol><li> 뇌간 CA의 극저온 섹션N 축삭 궤적을 시각화하는 모든 단계에서 수행 할 수. 그러나, E6.5 후이 너무 두껍게되어 평면 장착 배아에서 축삭을 시각화하는 데 어려움으로 인해 선호하는 방법이어야한다. 또한, 시냅스의 데모 조직과 현미경 고배율보기의 단면이 필요합니다. </li><li> 배아를 해부하고 모든 주변 조직을 제거합니다. PBS로 씻어. 마이크로 가위와 날카로운 핀셋을 사용하여 수질의 꼬리 부분에서 배아를 잘라. 소뇌와 중뇌 사이의 넓은 절개를 확인하고 전체 뇌간를 제거합니다. 조직 수질, 뇌교와 소뇌를 포함해야합니다. </li><li> PBS (10 분 × 3)로 씻어 4에서 밤새 4 % PFA (ON) ° C에서 뇌간을 수정하고 ON 4 ° C에서 침몰까지 30 % 자당에 품어. </li><li> 10월 (최적 절삭 온도) 화합물 CRYO-금형 후뇌를 포함하고, 냉동, 다른 곳과 마찬가지로 11 설명까지 -20 ° C에 배치합니다. </li><li&gt; 원하는 단면 축에 그라 이오 스탯에 OCT의 블록을 놓습니다. 섹션 폭은 12 μm의 수 있습니다. </li><li> 슬라이드를 건조. RT에서 2 시간 동안 각 슬라이드에 100 μl를 차단 솔루션을 추가합니다. 항체 100 μl를 (원하는 농도 차단 용액에 희석)을 추가합니다. 1 차 및 2 차 항체 배양 기간은 4시에 ON으로 각각 RT에서 ° C 또는 2 시간. 각 배양 시간 동안 부드럽게 건조를 방지하기 위해 슬라이드의 상단에 파라 필름 (parafilm) 스트립을 추가합니다. 항체 사이의 PBS (10 분 × 3)로 씻으십시오. 필요한 경우, RT에서 20 분 동안 PBS에 희석 1:1,000 DAPI을 (4&#39;-6-Diamidino-2-페닐 인돌) 추가합니다. PBS로 씻어. </li><li> 형광등 설치 미디어 슬라이드를 장착합니다. 분석하기 전에 1 시간 동안 건조하자. </li></ol>

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+precerebellar+nuclei+in+the+rat:+II.+The+intramural+olivary+migratory+stream+and+the+neurogenetic+organization+of+the+inferior+olive.">Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive.</a> J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).</li><li>Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+neurons+of+the+proprioceptive,+interoceptive,+and+arousal+hindbrain+networks+share+a+developmental+requirement+for+Math1.">Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1.</a> Proc. 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U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).</li><li>Storm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Olig3+marks+the+dorsal+neuroepithelium+of+the+hindbrain+and+is+essential+for+the+development+of+brainstem+nuclei.">The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei.</a> Development. 136, 295-305 (2009).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+segmentation+in+the+developing+hindbrain.">The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain.</a> Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+precerebellar+neuron+development+by+Olig3+bHLH+transcription+factor.">Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor.</a> J. 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Cell Biol. 181, 831-846 (2008).</li><li>Gardzinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+synaptotagmin+I+C2A+calcium-binding+domain+in+synaptic+vesicle+clustering+during+synapse+formation.">The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation.</a> J. Physiol. 581, 75-90 (2007).</li><li>Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV2+regulates+neurotransmitter+release+via+multiple+mechanisms.">SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms.</a> Am. J. Physiol. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+hodological+and+cytoarchitectonic+organization+in+the+vestibular+complex+of+the+11-day+chicken+embryo.">The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo.</a> J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).</li><li>Marin, F., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+fate+of+rhombomeres+in+quail/chick+chimeras:+a+segmental+analysis+of+hindbrain+nuclei.">Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

<p class="jove_content"관심&gt; 없음 충돌 선언하지 않습니다.</p

비켜 electroporation에있는 병아리 신경 시스템 개발 20시 세포의 사양과 축삭 지침을 검토하는 가능한, 신뢰할 수있는 효과적인 도구입니다. 이 프로토콜에서는 특정의 interneurons의 조건 라벨을 사용 증강 요소를 사용하여 E2.75에 병아리 후뇌에있는 일렉트로의 모드를 설명합니다. 이 전략은 배아의 고급 단계에서 축삭 노선 계획과 시냅스 사이트의 추적을 가능하게 병아리 게놈에 외?...

후뇌 오름차순와 신경 네트워크를 내림차순를 통해 중앙과 주변 신경 시스템 간의 통신에 의한 신경계의 중요한 중계 허브를 나타냅니다. 그것은 호흡, 의식, 청각,와 모터 조정 1-3 등의 기본적인 기능을 조절한다. 초기 배아 발달 동안 척추 후뇌는 일시적으로 서로 다른 신경 세포 유형을 형성하고 여러 뇌간 핵 센터 4 생성되는 반복 rhombomeres로의 전후방 (AP) 축을 따라 세분화된다. 후뇌는 개별 신경 세포의 전구 세포가 지정되고 별개의 DV 위치에 3,5,6을 차별화하는 기초와 날개의 접시에 자사의 지느러미 - 복부 (DV) 축을 따라 구분됩니다. 초기 AP와 DV 특정 신경 세포의 패턴 기능 뇌간 회로에의 설립을 관리하는 방법은 크게 알려지지 않은 것입니다. 이 기본에 대한 지식을 얻기 위해질문 도구는 초기 후뇌에있는 뉴런의 특정 하위 집합에 레이블을 지정하려면보다 고급 단계에서 자신의 축삭 탄도와 연결을 추적하기 위해 필요합니다. 우리는 이전에 특정 증강 요소를 활용하고, 초기 병아리 배아 7-9 지느러미 척추의 interneurons의 축삭 궤적을 추적 크레 / LoxP 기반 조건식 시스템에있다. 현재 원고에서 우리는 후뇌를 대상으로하고 수정 일렉트로 전략과 PiggyBac 사용 후기 배아 후뇌의의 interneurons, 축삭과 시냅스 목표를 라벨에 대한 실험 패러다임 업그레이드 - 중재 DNA 전위합니다. 우리의 새로운 전략은 2 최대 12 일 ~ 후뇌과 축삭 돌기 다양한 배아 단계에서 시냅스 사이트의 추적의 한면에 서로 다른 신경 세포 아형의 태그가 일렉트로 다음 수 있습니다. 이 방법에 따라, 우리는 후뇌의의 interneurons의 지느러미 - 대부분의 서브 그룹 (dA1/Atoh1을 + 표시 </s위로&gt; 세포)와 두 개의 반대측 오름차순 축삭 돌기 패턴을 밝혀, 각각은 별개의 삭조에서 다른 AP의 위치와이 신장에서 파생됩니다. DA1 축삭은 프로젝트와 청각 핵, 중뇌 및 소뇌 (10)의 여러 계층에서 폼 시냅스에 발견되었다. 병아리의 electroporation의 조합은 유전자가 신경 세포와 개발의 많은 고급 단계에서 투영 사이트 분석 추적 뇌의 신경 네트워크의 형성을 연구 및 회로 형성을 제어하는​​ 분자 메커니즘을 해명하는 독특한 플랫폼을 제공합니다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0162 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pulse generator, ECM 830</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0002</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound</td>
			<td>Tissue-Tek
				Sakura</td>
			<td>4583 O.C.T. Compound </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>From Any Commercial Supplier </td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

electroporation of the hindbrain to trace axonal trajectories and synaptic targets in the chick embryo

병아리 배아 신경 튜브의 일렉트로는 신경 세포에 외래 유전자의 발현에 대한 신속하고 효율적인되는 등 많은 장점이 있습니다. 이 논문에서 우리는, 특별히 신경 전구 세포의 하위 집합에 레이블을 지정하기 위해 E2.75에 새 후뇌로 DNA를 electroporate하는 방법을 독특하게 보여줍니다 방법, 방법 개발의 많은 고급 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 수행하는 방법 제공 최대 E14.5합니다. 기반의 플라스미드와 후뇌 세포 (의 interneurons, DA1의 지느러미 가장 하위 그룹)의 하위에 GFP 발현을 유도하는 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템 - 우리는 특정 증강 요소, 크레 / 훈제 연어 등의 소설 유전 도구를 활용했다. 축삭의 탄도와 DA1 축삭의 목표는 다양한 뇌간 지역에서 초기 및 후기 배아 단계에서 다음입니다. 이 전략은 배아 후뇌에 대한 관심의 세포를 타겟팅하고 tra에 대한 고급 기술에 기여개발의 여러 단계에서 회로 형성의 cing.

이 프로토콜은 최근 병아리 후뇌 10의 interneurons의 DA1 하위 그룹의 축삭 패턴 및 프로젝션 사이트를 발견하는 데 사용되었다. 특히 이러한 축삭에 레이블을 지정하려면, 이전에 척추 DI1 신경 8,12,13 특정으로 특징 된 증강 요소 (Atoh1은), 후뇌 DA1 세포를 10으로 표현할 수 있도록이 확인했습니다. 요소는 크레 재조합 플라스미드 크레 따라 세포질 GFP 기자 (; 그림 1BI</strong...

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Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

발달 신경 생물학의 근본적인 문제는 어떻게 신경 네트워크가 배아 뇌에 설립되어있다. 여기에서 우리는 크레 / 훈제 연어 - 플라스미드와 지느러미의 interneurons 레이블을 다양한 발달 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 추적하는 조류 후뇌의 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템과 같은 새로운 유전 도구와의 electroporation 기술을 결합했다.

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

electroporation-hindbrain-to-trace-axonal-trajectories-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.8K 조회수.  The Hebrew University of Jerusalem. 발달 신경 생물학의 근본적인 문제는 어떻게 신경 네트워크가 배아 뇌에 설립되어있다. 여기에서 우리는 크레 / 훈제 연어 - 플라스미드와 지느러미의 interneurons 레이블을 다양한 발달 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 추적하는 조류 후뇌의 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템과 같은 새로운 유전 도구와의 electroporation 기술을 결합했다.

비디오: Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

연구

신경과학

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

Murine 신경 크레스트 줄기 세포의 배양 칙의 배아 추출 생산

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

태아 알코올 스펙트럼 장애의 쥐 모델에서 Hippocampal 기능 장애를 평가 하기 위해 추적 Eyeblink 클래식 컨디셔닝의 사용

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions in the immature and adult brain. Here we describe a zinc histochemical staining procedure that reveals differences in staining patterns among different layers and brain regions. Others have utilized this procedure not only to reveal the distribution of zinc-containing neurons and circuits in the brain, but also to successfully delineate areal and laminar boundaries in the developing and adult brain in several species. Here we illustrate this staining procedure with images from developing and adult ferret brains. We reveal a zinc-staining pattern that serves as an anatomical marker of areas and layers, and can be reliably used to distinguish visual cortical areas in the developing and adult visual cortex. The main goal of this protocol is to present a histochemical method that allows the accurate identification of layers and regions in the developing and adult brain where other methods fail to do so. Secondarily, in conjunction with densitometric image analysis, this method allows one to assess the distribution of synaptic zinc to reveal potential changes throughout development. This protocol describes in detail the reagents, tools, and steps necessary to successively stain frozen brain sections. Although this protocol is described using ferret brain tissue, it can easily be adapted for use in rodents, cats, or monkeys as well as in other brain regions.

We describe a histochemical procedure that reveals characteristic laminar and areal zinc staining patterns in different brain regions. The zinc-staining pattern may be used in conjunction with other anatomical markers to reliably distinguish layers and regions in the developing and adult brain.

시 냅 스 아연 Histochemistry 다른 지역과 개발 및 성인 두뇌에서 하기의 사용

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...