나이, 감염 및이 독성 약물은 내이의 유모 세포를 퇴행시켜 청력 상실로 이어질 수 있습니다. 병아리와 같은 비 포유류 척추 동물에서는 유모 세포가 재생 될 수 있습니다. 여기에 설명된 기술은 병아리 배아 작업의 비용 효율성, 배아 획득의 용이성 및 조직 외식편의 우수한 엑소 발달을 활용합니다.
조류 내이의 털 발달 및 재생을 이해하면 청력 손실 및 잠재적 치료법에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있으며 체외이식편 배양은 다양한 약물의 이독성 효과를 평가하는 데 중요할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 갓 낳은 알을 조달하고 오염을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 청소하십시오. 알을 섭씨 37도에서 38도, 습도 45도에서 3.5-4일 동안 배양합니다.
배양 후, 5 분 동안 계란을 옆으로 눕혀 배아를 노른자 꼭대기로 재배치하십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 21게이지 바늘이 통과할 수 있도록 계란의 상단과 뭉툭한 끝에 작은 구멍을 뚫습니다. 5 밀리리터 주사기와 21 게이지 바늘을 사용하여 계란의 무딘 끝에있는 구멍에서 2 밀리리터의 알부민을 제거합니다.
투명 테이프를 사용하여 무딘 끝의 구멍을 덮으십시오. 달걀 창을 만들려면 달걀 껍질 상단에 투명 테이프를 부착하십시오. 수직 피펫 풀러를 사용하여 표준 유리 모세관에서 미세 주입에서 바늘을 잡습니다.
당긴 후 미세한 집게를 사용하여 모세관 팁을 떼어내어 끝이 가늘어진 약 50마이크로미터의 팁 직경을 얻습니다. 유전자 녹아웃 실험을 위해, 세 가지 구조물, 즉 가이드 플라스미드, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP를 1 마이크로 그램의 SP Cas9 단백질, 30 % 자당 및 0.1 % 빠른 녹색 염료 및 10 마이크로 리터의 최종 부피와 일대일 비율로 혼합합니다. 여러 플라스미드를 전기천공하는 동안 DNA의 최종 농도가 마이크로리터당 최소 4마이크로그램인지 확인합니다.
스프링 보우 가위의 도움으로 길이 2cm, 너비 1.5cm의 창을 잘라 내고 배아를 노출시킵니다. 그런 다음 집게를 사용하여 배아 위에 놓인 융모막 막을 열어 배아에 접근 할 수 있도록합니다. 귀 소포를 채우기 위해 약 200 나노 리터 부피의 DNA 용액 혼합물을 주입하십시오.
가이드 RNA 효율을 확인하기 위해 T7 엔도뉴클레아제 분석을 수행한다. 배아에 0.719% 식염수 방울을 추가하여 전기 저항을 낮추고 과열을 방지합니다. 다음으로, 계란의 둔한면에 만들어진 구멍을 통해 양극을 놓고 전극이 노른자 아래에 오도록 움직입니다.
채워진 이염용 위에 음극을 놓습니다. 전기 천공으로 플라스미드를 귀 소포로 형질감염시키려면 사각 펄스 발생기를 사용하고 50밀리초 간격으로 각각 100밀리초 동안 25볼트의 펄스 5개를 적용합니다. 개별 전기 천공 설정을 기반으로 경험적으로 조건을 결정합니다.
전기 천공 후 0.719 % 식염수 몇 방울을 추가하여 배아에 수분을 공급합니다. 투명 테이프로 알을 다시 밀봉하고 추가 배양을 위해 섭씨 37도에서 38도의 가습 인큐베이터로 돌아갑니다. 70 % 에탄올과 열을 사용하여 수술대, 현미경 스테이지 및 주변 부위를 소독하거나 최소 스프링 보우 가위, 마이크로 큐어 및 두 쌍의 미세 집게를 포함한 미세 해부 장비를 알코올로 소독하십시오.
검은색 실리콘 베이스가 있는 유리 페트리 접시, 90mm 플라스틱 페트리 접시 및 60mm 페트리 접시를 포함한 해부 플레이트를 준비합니다. 해부를 위해 HBSS라고도 하는 식힌 PBS 또는 행크스의 균형 잡힌 소금 용액을 보관하십시오. 계란을 90mm 페트리 접시에 부드럽게 깨뜨립니다.
그런 다음 병아리의 외이를 확인하고 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 60mm 페트리 접시에 머리를 옮깁니다. 다음으로, 부리의 꼭대기가 안쪽을 향하도록 배아를 향하게하고 5 개의 집게 중 하나를 사용하여 부리를 잡습니다. 두 번째 숫자 5 집게를 사용하여 눈을 퍼냅니다.
그런 다음 주둥이에서 꼬리까지 정중선을 따라 두개골을 자르고 뇌를 퍼냅니다. 얼음처럼 차가운 PBS 또는 HBSS를 더 추가하고 달팽이관 끝과 정중선 가까이에서 반짝이는 구조로 라게나의 두 이석을 찾습니다. 두 개의 내이를 분리하려면 두 개의 라게나 사이를 자르고 해당 부위의 위와 아래를 잘 자릅니다.
그런 다음 비스듬한 조명 아래에서 내이의 윤곽을 시각화하고 외부 조직과 현관을 제거하십시오. 분리된 달팽이관을 얼음처럼 차가운 PBS가 있는 검은색 실리콘 베이스 플레이트에 옮깁니다. 달팽이관을 얻기 위해 5번 집게를 사용하여 연골 달팽이관 캡슐을 벗겨냅니다.
그런 다음 달팽이관의 물결 모양의 층 또는 tegmentum을 찾아 55 번 집게를 사용하여 제거하여 기저 유두 또는 BP를 노출시킵니다. 다음으로, 지각막을 제거하여 55 번 집게를 사용하여 유모 세포와지지 세포를 노출시킵니다. 기저 유두의 막 배양을 위해 6웰 조직 배양 플레이트를 가져다가 웰당 하나의 배양 멤브레인 삽입물을 배열합니다. 200 마이크로 리터 피펫에 일부 배지를 작성한 다음 하나의 X HBSS 버퍼로 해부 된 기저 유두 체외 이식편을 흡인합니다.
체외 이식편을 막으로 옮기고 기저 유두가 위쪽을 향하고 모발과지지 세포가 위에서 보이도록 방향을 정하십시오. 일단 체외이식편이 위치되면 HBSS 완충액을 배양막 표면으로부터 천천히 흡인한다. 이 과정에서 체외이식편은 배양막에 부착됩니다.
멤브레인 인서트와 웰 벽 사이에 1.2ml의 dulbecco의 변형된 독수리 배지 또는 DMEM 배양 배지를 추가하여 6웰 플레이트의 웰을 채웁니다. 달팽이관의 콜라겐 배양을 준비하려면 새로 준비된 콜라겐 혼합물 3방울을 4웰 플레이트의 각 웰에 넣고 해부된 달팽이관을 각 콜라겐 방울에 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하고 5%이산화탄소를 배양하여 콜라겐 매트릭스를 경화시킵니다.
배양물의 소분자 처리를 위해, 배양 배지를 페니실린과 같은 약리학적 조절제가 보충된 700마이크로리터의 배지로 교체하고, 이전에 입증된 바와 같이 플레이트를 배양한다. 매일 배양 배지의 50%를 교체합니다. 적절한 배양 시간 후, 배양 배지를 제거하고, 하류 분석을 위해 체외이식편을 사용한다.
전기 천공 설정에서 올바른 전극 위치는 양쪽 전정 기관의 내이에서 더 높은 GFP 발현과 형질 감염을 확인하는 청각 기저 유두를 초래했습니다. CRISPR Cas9는 내이에서 Atoh1 유전자 녹아웃을 매개하여 유모 세포의 손실을 초래했습니다. Atoh1 유전자 녹아웃은 난자 전기천공을 통한 후 E10까지 배양한 후 빈 플라스미드 대조군에 비해 감소된 유모 세포 발달을 보였습니다.
전기천공은 모자이크이지만, 대조군 전기천공된 세포는 유모 세포를 형성할 수 있었다. Atoh1 gRNA 전기천공 샘플에서 녹색 형광 단백질 양성 세포는 유모 세포 발달의 마커를 나타내지 않았습니다. 콜라겐 및 유모 세포 항원에 대한 항체로 염색하는 것과 같은 3D 매트릭스의 기저 유두의 장기 배양은 최대 5일 동안 조직 형태의 우수한 보존을 제공했습니다.
유모 세포 및 지지 세포의 조직은 이러한 배양 조건에서 유지되었다. 막 상의 기관 배양물은 모발 다발 무결성을 유지하면서 최대 5일 동안 유지될 수 있습니다. 이는 팁 링크 단백질인 프로토카데린 15의 국소화에 의해 대표적인 이미지에서 알 수 있다.
모발 다발의 발달을 조사하기 위해, 초고해상도 현미경 또는 주사 전자 현미경과 같은 고해상도 이미징이 더 많은 정보를 제공할 수 있다. 멸균 상태는 절차 전반에 걸쳐 유지되어야합니다. 전기 포근하는 동안 배아가 마르지 않도록하십시오.
약리학적 억제제를 적정할 때, 치사율을 극복하기 위해 농도를 감소시킬 수 있다. 배아와 체외이식편 모두 영상 실험을 위해 채취할 수 있습니다. 프로토콜에 표시된 대로 실시간 비디오 마이크로스코핑 또는 정적 광 컨포칼 전자 마이크로스코핑을 수행합니다.
병아리 내이 외이식편 사용의 용이성과 접근성을 감안할 때 증거 스크리닝을 통해 배지를 사용하여 유모 세포 재생에 필수적인 새로운 분자를 식별할 수 있습니다.
