우리는 Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria 및 Mrs. Ximena Optiz-Araya와 협력하여 프로토콜 설정 및 플라스미드 제공에 대한 초기 지원을 받았습니다. 이 작품은 NIH / NIDCD 교부금 DC013841 (JTS)에 의해 지원되었다.

모든 절차는 노스 웨스턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 보건 지침의 국립 연구소 (National Institutes of Health Guidelines)에 따라 수행되었습니다. 1. 계란 취급 <ol><li> 현지 판매 업체에서 수정란을 구입하십시오. 배양 전 5 일 이내에 냉장고에 13 ° C로 계란을 저장하십시오. 배아 생존율은 1 주일 후에 현저히 감소합니다. </li><li> 인큐베이터에 세팅하기 전에 70 % 에탄올로 각 알을 닦으십시오. </li><li> ~ 50 % 습도에서 38 ° C로 설정된 온도의 인큐베이터에서 양 옆에 1-2 개의 달걀을 놓습니다. 이것은 electroporation과 최적의 생존 능력을위한 적절한 배아 위치를 보장합니다. 참고 : 배양 48-52 시간 후, 계란은 햄버거 - 해밀턴 (HH) 단계 ~ 12-13 일에 electroporation 준비가 될 것입니다. </li></ol> 2. 준비 <ol><li> 플라스미드 Mi싱 <ol><li> DNA 혼합물 7 μL 당 0.1 μL의 빠른 녹색 1 μL (18 MΩ 탈 이온 및 증류수 H 2 O [ddH 2 O] 0.1 %)를 첨가하십시오. </li><li> 여러 플라스미드의 공동 electroporation, 1 : 1 비율로 플라스미드를 섞는다. 최종 DNA 농도는 5-8 μg / μL이어야합니다. </li></ol></li><li> 필 주입 피펫 <ol><li> micropipette 끌어 당기는 사람에 pipettes를 당겨. 28G 주사기 바늘을 사용하여 1-2 μL 플라스미드로 피펫을 채 웁니다. </li><li> 포 셉을 사용하여 10 - 20 μm의 피펫 팁을 끊으십시오. 깨진 피펫 팁의 크기를 결정하는 데 도움이 현미경을 사용하십시오. 피코 스피 쳐의 피펫 홀더에 피펫을 부착하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 윈도우 잉 참고 : 윈도우 절차는 13 전에 게시되었습니다. 추가적인 시각적 정보는 참고 자료 13을 참조하십시오. <ol><li> 모든 악기와 작업 영역을 70 %에탄올. </li><li> 인큐베이터 (6-10 사이)에서 원하는 달걀 세트 계란을 꺼내 실온에서 놔두고 70 % 에탄올로 달걀을 따로 따로 닦아냅니다. 계란은 인큐베이터 제거 후 적어도 2 시간 동안 실행 가능합니다. </li><li> 배아의 위치를 ​​확인하기 위해 빛 조명 장치 위에 계란을 놓습니다. 어두운 영역의 중심 ( 즉 , 배아)에 연필로 동그라미를 치십시오. </li><li> 19G 바늘을 사용하여 알의 둔한 끝 부분에 구멍을 뚫습니다. </li><li> 계란의 뾰족한면에 그려진 원 근처에 다른 구멍을 뚫습니다. 19G 바늘로 외부 알 껍질 (약 16mm 2 )의 작은 조각을 제거한 다음 포 셉를 사용하여 내부 달걀 껍질 (약 8mm 2 )의 작은 조각을 제거합니다. </li><li> 19G 바늘이 장착 된 3mL 주사기를 사용하여 무딘 말단 구멍을 통해 알에서 1.5-2.5mL의 알부민을 빼냅니다. 바늘을 45 °로 기울여야합니다. </li><li> 커팅 된 구멍을 작은 테이프 조각 (1cm x 1cm)으로 덮으십시오. 그려진 원을d 테이프로 두 번째 구멍 (2.5 cm x 4 cm). </li><li> 굽은 가위 (절삭 날 = 2.5cm)를 사용하여 원 안에 창을 자릅니다. 가위는 달걀 껍질과 평행해야하며 창문의 지름은 2cm 미만이어야합니다. </li></ol> 4. 플라스마 주입 <ol><li> 피코 스피처를 켜십시오. 압력을 18 psi로 설정하고 지속 시간을 5 μs로 설정하십시오. 해부 현미경에 대한 공기 탱크와 램프를 켭니다. </li><li> 멸균 인산염 완충 식염수 (PBS)에 혼합 된 매장에서 구입 한 인도 잉크 1 : 10 희석액 30 mL 원액을 만드십시오. 4 ° C에서 보관하십시오. 인도 잉크의 주입은 닭 배아의보다 나은 시각화를 얻는 중요한 단계입니다. <ol><li> 희석 된 인도 잉크 용액으로 1 mL 주사기를 채 웁니다. 27G 바늘을 부착하고 주사기에있는 모든 거품을 뽑아 내십시오. </li><li> 배아에서 2-3mm 떨어진 난황 막 바로 아래에 바늘을 삽입하고 배아 아래에 약 0.2mL의 인도 잉크를 주입합니다. 해야 할 것배아 생존을 감소시킬 수 있으므로 인도어 잉크 0.5 mL 이상을 주입하지 마십시오. </li></ol></li><li> 해부 현미경 아래 계란 홀더에 창 계란을 놓습니다. 플라스미드 주사 부위를 가장 잘 볼 수 있도록 가장 높은 배율을 사용하십시오. </li><li> 집게를 사용하여 주입 영역 위로 막을 제거하십시오. 관심의 청각 brainstem 지역 ( 즉 , NM과 NL) Rhombomeres 5와 6 (R5 / R6)에서 발생합니다. R5 / R6은 R5 / R6 플라스미드 주사의 지표가되는 otocysts (척수 동물의 내이에 발생하는 배아 구조)에 인접 해 있습니다. </li><li> R5 / R6 지역과 otocysts 사이에있는 신경 튜브에 micromanipulator를 사용하여 DNA 채워진 피펫을 낮추십시오. 이상적인 배치의 개략도가 그림 1A 에 나와 있습니다. </li><li> picospritzer에서 공기 압력 (18 psi, 5 μs duration)을 적용하여 신경 튜브의 DNA를 추출합니다. </li></ol> 5. 일렉트로 포 레이션 <ol><li> t를 켜십시오.그는 전류 / 전압 자극기입니다. </li><li> PBS와 3 ML 주사기를 채우고 주사기 필터를 첨부하십시오. 배아에 PBS 1-2 방울을 추가합니다. </li><li> 주사 사이트 (내측) 위의 음전극과 R5 / R6 ( 그림 1A )의 양극 측면과 micromanipulator를 사용하여 배아에 양극 전극을 낮추십시오. 배아와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 전극 재료가 백금 이리듐 인 경우 양극 전극을 사용하십시오. 팁 사이의 간격을 집게로 0.5mm로 조정하십시오. </li><li> 전류 / 전압 자극기를 사용하여 50V에서 1 초 간격으로 20 회 펄스를 1 초 간격으로 펄스합니다. </li><li> electroporation 후 노출 영역 위에 PBS 한 방울을 추가합니다. 부드럽게 전극을 제거하고 실험실 조직과 70 % 에탄올로 청소하십시오. 배아를 테이프로 노출시키는 창을 닫습니다. </li><li> 주입 된 플라스미드 유형 및 해치 날짜로 달걀 껍질에 라벨을 붙입니다. </li><li> 창 측면과 함께 인큐베이터에 계란을 다시 넣으십시오. 38 ° C에서 50 °원하는 발달 단계에 도달 할 때까지 습도 %. </li><li> 유전자 발현의 일시적인 조절을 위해 tet-on vector를 일렉트로 포 레이션하면 24 시간마다 Doxycycline (Dox)을 적용하여 유전자 발현을 유도한다 (6 절 참조). </li></ol> 6. 유전자 발현의 시간 제어를위한 Tet-on 시스템 <ol><li> 다음과 같은 플라스미드를 사용하십시오 : pCAGGS-T2TP : 플라스미드를 발현하는 트랜스포 아제. pT2K-CAGGS-rtTA-M2 : Dox 결합 단백질을 안정적으로 발현하는 플라스미드. pT2K-BI-TRE-EGFP : EGFP 리포터와 관심 두 번째 유전자의 양방향 tet-on promoter (TRE) 구동 구동을 포함하는 플라스미드. 참고 : 위의 세 가지 플라스미드는 1 : 1 : 1의 비율로 공동 electroporated해야합니다. </li><li> 재고 솔루션 준비 : <ol><li> Dox를 멸균 PBS에 녹여 1 mg / mL 저장 용액을 만듭니다. -20 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> Dox 응용 프로그램 : <ol><li> 표현을 유도하려면특정 발달 단계에서 관심 유전자의 n은 24 시간마다 Dox를 적용한다. </li><li> Dox를 적용 할 때, 계란을 꺼내 창을 열고, chorioallointoic 막에 50 μL Dox를 피펫, 창문을 닫고 인큐베이터에 다시 계란을 넣어. </li></ol></li></ol> 7. 뇌간 절편을위한 해부 영역의 준비 참고 : 다음 섹션 (7-9) 및 절차는 14 전에 게시되었습니다. 추가 시각적 정보는이 참조 자료를 참조하십시오. <ol><li> 한천 솔루션 (40mg / ML 아가로 오스, 즉 ddH 2 O 4 %)을 준비합니다. 한천 용액을 페트리 접시에 붓고 실온에서 응고되게하십시오. 조직을 뇌간 절단하는 동안 미래의 사용을 위해 냉장고에 한천 플레이트를 덮습니다. </li><li> 95 % O 2 및 5 % CO 2 (pH 7.2-7.4 및 삼투압 : 295-310 mOsm / L) 인 인공 대뇌 척수액 (ACSF)을 지속적으로 버블 링합니다.</li><li> 작업 영역과 vibratome을 70 % EtOH로 세척하고 칼날을 증류수로 헹구십시오. </li><li> 적절한 절개 공구로 작업 영역에 깨끗한 유체 흡수 패드를 놓습니다. </li><li> 한천 플레이트를 냉장고에서 꺼내고 작은 한천 큐브 (10mm x 10mm x 8mm)를 자릅니다. 시판되는 슈퍼 접착제를 사용하여 vibratome-slicing chamber의 한천 블록을 접착하십시오. </li></ol> 8. 치킨 청각 Brainstem의 격리 <ol><li> 녹화 된 창 사이트에서 알을 엽니 다. 메스로 멤브레인 낭을 찔러서 닭 배아의 머리를 제거하십시오. </li><li> 날카로운 가위로 닭고기를 처치하십시오. </li><li> 면도날 끝을 눈의 약간 뒤로 배치하십시오. 사타구니에서 꼬리 중간 선에서 두개골을 통해 절개하십시오. 배아의 나이에 따라 약간의 압력을가하십시오. 오래된 배아는 더 많은 압력을 필요로합니다. </li><li> 부드럽게 피부와 깃털을 옆으로 밀어서 두개골을 노출시키고 정중선 절단을 확인하십시오. </li><li> 적용뾰족한 압력, 면도날로 두개골의 주둥이 부분을 자릅니다. 즉시 눈 뒤쪽에 블레이드를 놓고 전체 두개골과 뇌 조직을 잘라냅니다. </li><li> 두개골의 꼬리 부분에있는 가위로 정중선 - 절개를 만들고 머리 양쪽에있는 목 근육의 약간 앞쪽에 위치시킨다. 두개골과 과잉 조직을 당겨 뇌와 소뇌를 노출시킨다. </li><li> 가위로 brainstem에 첨부 된 조직을 잘라 버리고 두개골에서 자유롭게 분리 brainstem를 제거하십시오. </li></ol> 생체 내 전기 생리학 또는 영상화를위한 뇌간 절편 준비 <ol><li> 광학 현미경을 통해 뇌간을 고정하십시오. </li><li> 가위로 peduncles를 절단하여 소뇌를 제거하고 넷째 뇌실 바닥을 드러내십시오. </li><li> 핀셋을 사용하여 막 조직 표면에서 멤브레인 모양의 조직과 혈관을 제거합니다. </li><li> 뇌간을 막으려면 4 층 바닥의 가장 주둥이 끝 부분을 수평으로 자릅니다.대뇌 피질에 바로 꼬리 인 심실. brainstem을 격리하기 위해 시신경을 통해 수직으로 측면 절단을하십시오. </li><li> 한천 블록 앞에 직접 vibratome 무대에 슈퍼 접착제의 소량을 놓으십시오. </li><li> 족집게를 사용하여 척수에서 뇌간을 들어 올리고 비듬면이 아래쪽이고 진동 면도날쪽으로 등 쪽의 슈퍼 접착제 위에 놓습니다. 실험실 조직이나 여과지로 과량의 접착제를 제거하십시오. </li><li> 산소가 공급 된 ACSF를 vibratome 단계에 붓는다. vibratome 블레이드를 20-22 ° 각도로 설정하십시오. 진동 진폭을 최대 진폭으로 시작하십시오. 조직의 상단이 날과 평행하도록 날을 향해 스테이지를 위로 이동하십시오. </li><li> 신속하게 뇌간 조직쪽으로 움직입니다. 블레이드가 조직과 접촉하기 전에 블레이드를 상당히 천천히 감속하십시오. </li><li> 가능한 한 가장 느린 전진 속도로 조직을 슬라이스하십시오. 블레이드가 전체 관상 조직 섹션을 통과하면, 전송 피펫을 사용하여 슬라이스를 부드럽게 제거하십시오./ li&gt; <li> 200-300 μm의 단계를 낮추고 다시 슬라이스. 청각 핵의 해부학 적 랜드 마크가 눈에 보일 때까지 반복하십시오 (예 : NL의 뚜렷한 지느러미 / 복부 뉴로 필 영역 및 NL과 관련된 NM의 중간 위치). </li><li> ACFS에서 슬라이스를 조심스럽게 유지 관리하십시오. 이는 온수 욕조를 사용하여 실온 (22 ° C) 또는 생리 조건 (~ 41 ° C)에서 수행 할 수 있습니다. 슬라이스 순서에 유의하십시오. 첫 번째 슬라이스는 조직의 가장 꼬리 부분에 해당하고 마지막 슬라이스는 가장 주둥이 영역에 해당합니다. 이것은 대략 저주파수에서 고주파 인코딩 영역까지의 청각 뇌간 구조의 톤토 피스크 구성을 대략적으로 나타냅니다. </li></ol>

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비켜에서 electroporation는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 를 분석하기 위해 관심 유전자를 표현하거나 노크하는 방법입니다. 닭 배아에서, 그것은 다른 청각 brainstem 지역 8 로 플라스미드 인코딩 유전자를 표현하기위한 혁신적인 방법입니다. 최적의 발현을 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. 첫째, otocysts 명확하게 볼 ...

소리의 빠른 신경 부호화는 정상적인 청각 기능에 필수적입니다. 여기에는 음향 국소화 능력 1 , 잡음 차별 2 에서의 발언 및 다른 행동 관련 통신 신호 이해 3이 포함 됩니다. 조류와 포유류 모두의 청각 뇌간에 위치한 유사 뉴런은 빠른 신경 엔코딩을 전문으로합니다 4 . 이들은 닭 핵 magnocellularis (NM), 핵 laminaris (NL) 및 그들의 포유류 유사체, anteroventral 달팽이관 핵 (AVCN) 및 중간 우수한 올리브 (MSO), 각각 5 . 그러나, 빠른 신경 부호화를 조절하는 발달 기전은 청각 뇌간에서 잘 이해되지 못한다. 따라서 au에서 발현, 조절 및 기능을 더 잘 이해하기 위해서는 빠른 신경 엔코딩을 담당하는 특정 유전자를 연구하는 것이 유리하다ditory 개발. 개발중인 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본 생물학적 질문을 연구하는 효과적이고 잘 정립 된 연구 도구이다. 최근의 분자 진보는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 을 분석하기 위해 관심있는 유전자를 발현하거나 파괴함으로써 닭 배아를 개발하는 생물학적 문제를 해결했습니다. 특정 유전자의 규제 역할을 조사하는 것은 청각 적 결핍과 관련된 병리학을 이해하는 데 중요한 진보입니다. 여기, 우리는 빠른 신경의 소리의 인코딩이 발생 치킨 청각 brainstem에 플라스미드 인코딩 유전자의 비켜 electroporation에 제시 10 . rhombomeres 5 및 6과 관련된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써 11 , 12 (R5 /R6), NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염의 공간 제어를 나타낸다. 또한, tet-on 벡터 시스템을 채택하여 표현의 시간적 조절을 보여줍니다. 이것은 doxycycline (Dox) 8 의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td>
			<td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td>Picospritzer III, single or dual channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current/voltage stimulator</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>SD9</td>
			<td>SD9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil syringe needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1280</td>
			<td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating microelectrode</td>
			<td>FHC</td>
			<td>PBSA1075</td>
			<td>PBSA1075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank/regulator</td>
			<td>NU Laboratory Services</td>
			<td></td>
			<td>Air dry 300 CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>F7258-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear plastic tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg refrigerator</td>
			<td>Vissani Wine Refrigerator</td>
			<td></td>
			<td>13.3-16.1&#176; C (56-61&#176; F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hova-Bator</td>
			<td></td>
			<td>37.8&#176; C (100&#176; F), ~50% humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.35E+15</td>
			<td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.36E+15</td>
			<td>CL6000 LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model: MM-3</td>
			<td>2 Micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD Precision Glide&#160;</td>
			<td></td>
			<td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>No. 5 Super Fine Dumont</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg holder</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>Clay base works as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Model P-97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Ultra Cruz</td>
			<td>sc-358811</td>
			<td>PVDF 0.22 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

일렉트로 포 레이션 (Electroporation)은 닭 배아와 같은 생물학적으로 관련된 생물체에 관심있는 유전자를 도입하는 방법입니다. 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본적인 생물학적 기능을 연구하기위한 효과적인 연구 모델이라는 것이 오랫동안 입증되어왔다. 보다 최근에, 닭 배아는 청력과 관련된 유전자 발현, 조절 및 기능을 연구하는데 특히 중요하게되었다. 귓볼에서 일렉트로 포 레이션은 고도로 전문화 된 청각 기능을 담당하는 청각 뇌간 영역을 표적으로하는 데 사용될 수 있습니다. 이 지역은 닭 핵 magnocellularis (NM)과 핵 laminaris (NL)을 포함합니다. NM 및 NL 뉴런은 rhombomeres 5 및 6 (R5 / R6)의 별개의 전구체로부터 발생합니다. 여기, 우리는이 지역에서 유전자 관련 특성을 연구하기 위해 플라스미드로 암호화 된 유전자의 비켜 일렉트로 포 레이션을 제시한다. 우리는 기능적 표현형의 증가 또는 감소를 촉진시키는 유전자 발현의 공간적 및 일시적 제어 방법을 제시한다es. R5 / R6와 연관된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써, 우리는 NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염을 나타낸다. 유전자 발현의 일시적인 조절은 tet-on 벡터 시스템을 채택함으로써 성취 될 수있다. 이것은 doxycycline (Dox)의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다. 생체 화학, 약리학 및 생체 내 기능 분석과 함께 in ovo electroporation 기술은 청각 신경 세포 발달 및 관련 병리 생리 현상을 연구하는 혁신적인 방법을 제공합니다.

우리는 비켜 일렉트로 포 레이션에서 정상적으로 발전하는 생물계에서 유전자 발현이 가능하다는 것을 보여줍니다. 플라스미드 - 코딩 유전자는 R5 / R6 위에있는 신경 튜브에 국소 적으로 주사된다. 중요한 해부학 적 마커와 관련된 전극 및 피펫 배치의 개략적 인 예가 그림 1A 에 나와 있습니다. 플라스미드 주사의 정확한 위치는 electroporati...

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In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

8.4K 조회수.  Northwestern University.  조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다. 

비디오: In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation에 접근

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

소설<em&gt; 예 비켜</em&gt; 밴딩 기법 닭 배아 시스템에서 심장 내 혈류를 변경할

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에<em&gt; Ciona intestinalis의</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

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차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

개발에 미세 주입을 대상으로 기술

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한

소설

척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화