이 작품은 SEFD에게 수여 국립 보건원 (AI079442 및 AI091918)에서 교부금에 의해 지원되었다

1. 선택적 한천 매체의 준비 (BHI / L + G)은 장내 미생물을 억제하는 <ol><li> 26g 뇌 심장 주입 한천 (Difco), 7.5 g하여 LiCl 5.0 g 글리신과 1 리터 플라스크에 자리를 무게. 탈 이온수 500 ML을 추가합니다. </li><li> 자석 교반기에 열 한천 종기까지 계속 저어. 열 떨어져 플라스크를 가지고, 거품 간단히 해결하자 후 다시 종기로 가져옵니다. </li><li> . 액체 사이클 16-19 PSI에 따라 121에서 30 분간 ° C를위한 오토 클레이브 참고 : 플라스크에 교반 막대를 둡니다. </li><li> ° C의 물을 욕조에 55 미디어 평형 또는 RT로 냉각 할 수 있습니다. 솔루션 ° C 또는 결정이 한천의 형성 55보다 쿨러 얻을 수 없습니다. 결정은 L.을 억제하지 않습니다 monocytogenes의 성장 또는 미디어의 선택 속성에 영향을 미칩니다. 그러나 결정은 작은 식민지 모양이 유사하고 어려운 박테리아 CFU를 계산하게됩니다. </li><li> 부드럽게 혼합자석 교반기를 사용하여 1 분 한천. 공기 거품의 형성을 피할 것. 페트리 접시 (~ 25 ML / 플레이트)에 한천을 부어. 참고 :이 매체는 모든 L.의 성장을 지원하지 않습니다 monocytogenes를 긴장. 예를 들어, L. 모노 사이토 제네스의 가장자리는은 36-48 시간 내에 표시 식민지로,이 배지에서 잘 성장하지만, 10403s이 매체에 성장하지 않습니다. </li></ol> 2. 접종의 준비 <ol><li> 작은에 얇게 썬된 빵 (크로 거)을 잘라 (2 ~ 3 ㎜) 멸균 가위 ORA 멸균 메스 블레이드를 사용하여 큐브. 껍질을 사용하지 마십시오. 감염의 날까지 -20 ° C에서의 microcentrifuge 튜브에 각각의 조각을 저장합니다. </li><li> 멸균 메스를 사용하여, 소금 버터 (Kroger에서) 작은 (0.5 cm) 덩어리를 잘라 살균 microcentrifuge 관에 각각 배치합니다. 60 빵 조각 - 각 관은 50을 준비하기에 충분한 버터를 포함합니다. -20 ° C에서 보관 필요할 때까지. </li><li> L. 성장 BHI 국물의 monocytogenes는 &amp; 30에 떨고DEG, 문화가 ~ 0.8-1.0의 OD 600에 도달 할 때까지 C. 샘플 자주 그래서 튜브의 박테리아의 동일한 숫자를 포함 소용돌이에 관심을 가지고,의 microcentrifuge 튜브에 500 μL의 aliquots을 준비합니다. -80에서 보관 ° C. </li><li> , 세균 분주을 역가 얼음에 튜브를 해동 후 500 ㎕의 9.5 ML BHI 국물에 추가하십시오. 30에서 1.5 시간 서에 대한 품어 ° C. BHI 한천 플레이트에 시리얼 희석. . 균일 씩을 준비되어 있으면, 2 ~ 4 배의 분산과 유사한 방식으로 준비하면 튜브의 각이 역가를 얻을 것으로 예상 할 수있다 : ~ 1-5 × 10 8 CFU / ㎖ 주 역가를 기대합니다. </li><li> 쥐를 감염, L.의 나누어지는을 준비 모노 사이토 제네스는 2.4 단계에서 설명했다. L. 전에 약 20 분 monocytogenes의 문화가 준비, RT에 빵 조각을 해동. 55 버터 나누어지는을 녹여 ° C와 55 ° C.에 PBS의 사전 따뜻한 작은 양 적어도 하나의 당 마우스가 충분히 그렇게 빵 조각을 준비한다감염과 실제 접종의 역가를 결정하기위한 적어도 하나의 여분의 조각 수 있습니다. </li><li> 세균 나누어지는의 소정의 역가에 따라, L.의 총 부피를 계산 monocytogenes의 문화 빵 조각의 필요한 번호 접종을 준비하는 데 필요한. 10 분 동안 14,000 XG에서 원심 분리하여 펠렛 박테리아는 모든 BHI 국물을 기음과 미리 예열 PBS (2 μL / 빵 조각)의 작은 양의 박테리아를 resuspend을. </li><li> 소용돌이 녹은 버터, 박테리아 (3 μL / 빵 조각에 해당하는 전체 볼륨을 사용)을 추가하고 잘 혼합 참고 :. 한 시간이나 버터를 공고히 할 것이다 개 이상의 10-15 빵 조각을 준비하지 마십시오. </li><li> 신속 microcentrifuge 관에서 하나의 빵 조각 위에 세균 현탁액의 피펫 5 μl를 작동합니다. 이 솔루션은 완전히 빵 조각에 의해 흡수되어야한다. </li><li> 접종의 실제 역가를 결정하기 위해, 빵 piec를 중 하나에 1 ML 멸균 PBS를 추가에스. 1 분간 격렬하게 소용돌이. 직렬 희석 및 플레이트 BHI 및 BHI / L 양 + G 한천을 준비합니다. </li><li> 높은 역가 (&gt; 10 9 CFU) 접종에 대한 대체 절차. 박테리아 펠릿이 너무 큰 경우에는 작은 양에 중단하기 어려울 수 있으며, 그 결과 물질은 풀처럼 점성이 있으며, 접종 중 일부는 microcentrifuge 관의 측면에 붙어 있습니다. 이 경우에는 멸균 60mm 배양 접시에 빵을 접종하고, (아래) 마우스 전체 요리 (뚜껑 없음)을 제공하는 것이 좋습니다. 빵에 흡수되지 않은 여분의 접종은 다음 마우스로 직접 먹을 수 있습니다. 매우 높은 역가 접종을 처리 할 때 일반적으로, 그것은 빵의 모든 음식과 아래에 설명 된 표준 프로토콜보다 깨끗한 접시를 핥아하는 마우스를위한 오래 걸립니다 때문에, 이것은 단지 방법입니다. </li></ol> 3. 쥐의 감염 <ol><li> 여성 BALB / C / J (재고 # 0010026) 및 C57BL/6/J으로 / (주식 매입# 000644) 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 나이 6-9 주에 사용합니다. </li><li> 빠른 음식을 제거하고 제기 (1 인치) 와이어 바닥 (3 위 메시, 앨런 타운)에 마우스를 배치하여 감염 이전에 마우스 ONE DAY (24 시간) coprophagy 방지합니다. 만 충분히 소변을 흡수하는 케이지 침구,하지만 창고 대변을 상승하는 것만으로는 충분하지 둡니다. 물에 무제한 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 붉은 빛 전구 장착 된 층류 후드에서 작업, 어두운주기의 발병 쥐를 감염. 빈 (무 침구) 케이지에 하나의 마우스를 전송합니다. 멸균 포셉 사용하여 빈 새장 바닥에 오염 된 빵 조각을 전송합니다. 일반적으로, 마우스는 빵 조각을 데리러와 2-10 분 내에 완전히 그것을 소비한다. 마우스가 바로 빵을 먹지 않으면 20 ~ 30 분 동안 그대로 마우스를 랙 떠나 새장을 반환합니다. 동물의 대부분이 시간 내에 빵을 먹을 것이다, 그러나, 마우스는 구약에 액세스하지 않고, 그대로 남아있을 수 있습니다최대 2 시간에 대한 그녀의 음식 또는 물. </li><li> 감염 후, 원래 케이지에 마우스를 반환하고 마우스 우를 보충. 실험 기간 동안 제기 와이어 바닥에 쥐를 집에 계속. </li></ol> 4. 박테리아의 수준을 모니터링 대변의 뿌리 <ol><li> 라벨과 미리 무게의 microcentrifuge 튜브는 배설물의 수집에 사용할 수 있습니다. </li><li> 마우스 케이지를 검색 한 후 빠르게 작업, 500 ML 플라스틱 비커에 각각 마우스를 놓습니다. 일반적으로 마우스는 5 분에서 1-4 대변 알약을 추방 할 것이다. </li><li> 적절하게 레이블이 지정된 튜브에 대변을 전송하는 멸균 집게를 사용합니다. </li><li> 각 튜브의 무게를 측정하고 빈 튜브의 무게를 빼서 대변의 무게를 계산합니다. 찌끼 펠릿에 대한 일반적인 무게는 10 ~ 30 밀리그램의 범위. </li><li> 각 튜브 (200 μl/30 MG 대변)에 PBS를 추가하고 매시 배설물 펠렛에 멸균 이쑤시개를 사용합니다. </li><li> 30 초 동안 소용돌이 관에는, 관마다 다음 BHI / L의 직렬 희석 및 플레이트를 준비+ G 한천. 콜로니의 수를 계산하고 CFU / MG 대변을 계산합니다. </li></ol> 5. 감염 창자 조직의 처리 <ol><li> 쥐를 안락사, 무균 하나의 조직으로 각 마우스에서 위장을 수확 빈 100mm 배양 접시에 수집합니다. </li><li> 소장, 맹장, 얼음에 저장되어 별도의 60mm 요리에 콜론과 장소를 구분합니다. 작은 창자는 더욱 십이지장, 공장 및 내강 내용의 제거를 용이하게하기 위해 회장에 가깝게 개의 동일한 조각으로 길이로 나눌 수 있습니다. 조직 3는 다음 중 하나를 함께 처리 (전체 소장 당 CFU) 또는 분리 할 수​​ 있습니다. ~ 0.5 ML 멸균 PBS에 젖은 조직은 유연을 유지하고 처리하는 동안 눈물을 방지합니다. </li><li> 8 ML 멸균 PBS로 10 ML의 주사기를 입력하고 25g 바늘을 연결합니다. 폐기물 비커 (또는 멸균 50 ML 튜브 내강 박테리아를 수집하는 경우)에 내강 내용을 짜 살균 집게를 사용합니다. Flus조직의 한쪽 끝을 통해 H 4 ML PBS는 내용을 짜내 집게를 사용하고 다른 쪽 끝에서 조직을 뒤집어 반복합니다. </li><li> 내강 내용에 리스테리아의 수를 정량화하기 위해, 0.5 펠렛을 일시 중지 12,000 XG에서 20 분 풀 플러시 원심 분리기 - 1.0 ML 멸균 물을. </li><li> 리스테리아 세포 관련 금액의 총 수를 정량화하기 위해 작은 조각으로 조직을 슬라이스 여러 측면 컷을 한 후 멸균 메스 칼날 길이 방향으로 절단하여 각 세척 티슈를 열고 주 :.이 단계를 확인하는 것이 필수적입니다 장 조직 균질 블레이드 주위에 래핑하지 않습니다. 2 ㎖ 멸균 물을 포함하는 15 ML의 원심 분리기 튜브 장의 조각을 전송합니다. </li><li> 30 초 동안 60 %의 전력에서 70 % 에탄올에 프로브를 삽입하여 조직을 균질화 (피셔 발전기 구매 1000) 소독. 10 초 동안 멸균 물에서 공기 건조에 에탄올, 또는 프로세스를 기다립니다. 각 TI를 균질화1 분 ssue. 각 샘플 사이의 멸균 치료를 반복 샘플 그룹 사이에 70 % 에탄올을 사용합니다. </li><li> 멸균 물과 BHI / L + G 한천 플레이트에 각 시료의 연속 희석을 준비합니다. </li></ol> 6. 감염된 장간막 림프절의 처리 <ol><li> 수확 림프 무균 노드, 얼음 멸균 60mm 접시에 장소 및 연결된 모든 지방을 제거하는 살균 집게를 사용합니다. 마우스 당 3-6 노드를 찾을 것으로 기대합니다. </li><li> 스테인레스 스틸 # 80 메쉬의 1.5 인치의 정사각형 조각을 절단하여 와이어 메쉬 화면을 준비합니다. 각 모서리에 작은 상처를 만들고, 제기 침대를 만드는 네면을 아래로 접습니다. 825 ML 멸균 물을 포함하는 60mm 페트리 접시에 95 % 에탄올 후 소독 화염, 장소에 담근다. 각 사용 후, 화면은 20 분 동안 70 % 에탄올에 몸을 담글 포함 된 조직을 제거하는 브러시로 닦고, 2N NaOH를 20 ~ 30 분간 비등하고 물을 광범위하게 세척하여 재활용 할 수 있습니다. </li><li> 플런저를 사용메쉬 스크린을 통해 멸균 3 ML의 주사기에서 매시에 노드. 이 접시에 물과 접촉하게 그래서 접시의 바닥에 화면을 아래로 밀어해야합니다. </li><li> 화면을 통해 825 ML 멸균 물을 통과하고 다음 화면을 씻어 여러 번 위아래로 피펫. microcentrifuge 관에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 소용돌이는 각 샘플은 적극적으로 30 초 동안 세포를 용해합니다. 하나 BHI / L + G 한천에 시리얼 희석, 접시를 준비합니다. </li></ol> 7. 감염된 비장, 간과, 및 담즙 방광의 처리 <ol><li> 멸균 집게로 비장을 잡고 두 컷, 각 끝을함으로써 해방 시키자. 2.5 ML 멸균 물을 포함하는 15 ML 튜브에 넣습니다. (참고 : 둥근 바닥을 가진 튜브 균질화와 함께 사용하기 쉬운 수 있습니다.) </li><li> 담즙 방광 (간장에 부착 된 작은 노란색 유체 가득한 골목) 및 파열하지 않고 간에서 분리하는 멸균 가위로 조심스럽게 싹둑를 찾습니다. TRANSF1 ML 멸균 물을 포함하는 microcentrifuge 관에 어. </li><li> 무균, 간을 모두 제거 엽 (叶)을 확실하게 제거 및 멸균 2.5 ML을 포함하는 15 ML의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 로 60 %의 전원을 30 초 동안 위에서 설명한 비장과 간을 균질화. Forgall 방광은 30 초 동안 격렬하게 소용돌이 후 microcentrifuge 관에서 떨어져 찢어 멸균 가위를 사용합니다. </li><li> 직렬 희석 및 BHI 또는 BHI / L 두 접시 각 샘플 + G 한천을 준비합니다. </li></ol> 8. 감염된 뇌의 처리 <ol><li> 마우스의 뒷면에서 작업, 45 ° 각도로 목 위의 피부와 조직을 잘라, 두 귀를 통해. 코쪽으로 잡아 당겨 피부의 U 자형 플랩 벗겨에 멸균 집게를 사용하여 두개골과 얼굴 뼈를 노출합니다. </li><li> 집게와 눈 사이 뼈 능선을 잡고 두개골을 고정화하고, 두개골의 측면 가장자리에 걸쳐 얕은 상처를 만들기 위해 가위를 사용합니다. 있다단지 뼈가 아닌 뇌 조직을 잘라 조심. 다음으로, 눈 사이 뼈 능선을 잘라. 뇌를 노출 (목 쪽) 두개골의 상단을 잡고 뒤로 당겨 집게를 사용합니다. </li><li> 천천히 1.5 ML 멸균 물을 포함하는 15 ML의 원심 관에 멸균 포셉과 장소를 사용하여 구멍에서 머리를 들어 올립니다. </li><li> 위에서 설명한대로 60 %의 전원을 20 초 동안 균질화. BHI 또는 BHI / L + G 한천 하나의 직렬 희석 및 판을 준비합니다. </li></ol> 9. 보충 절차 : 창자 조직의 분별 점액 분수에있는 박테리아의 9.1 절연 <ol><li> 각 장 조직의 경우, 6 개 mm N-아세틸 시스테인 (; 시그마 # A-9165 NAC) 3 ㎖를 포함하는 3 튜브를 준비합니다. </li><li> 플러시를 배치하고 세로 방향으로 적극적으로 모든 20 ~ 30 초 소용돌이, 1-2 분 동안 첫 번째 튜브에 조직을 잘라. 멸균 집게를 사용하여 조직을 선택하고 부드럽게 초과 액체 비누를 제거하기 위해 튜브의 한쪽에 짜ID입니다. </li><li> 나머지 NAC 튜브를 사용하여 두 번 더 단계 9.1.2를 반복합니다. 장 조직을 제거하고 추가 처리를 위해 따로 설정할 수 있습니다. </li><li> 수영장 NAC (9 ML 총) 씻어, 12,000 X g에서 20 분 원심 분리기. </li><li> 30 초 동안 멸균, 소용돌이 펠렛을 resuspend을, BHI / L + G.에 연속 희석, 접시를 준비 </li></ol> 상피 세포 (EC) 분수에있는 박테리아의 9.2 절연 <ol><li> 5 % FBS (RP-5), 5 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM의 DTT로 보충 RPMI 5 mL를 (Invitrogen 사 # 21870)를 포함하는 50 ML 튜브에 멸균 가위와 장소 작은 조각으로 각 조직을 잘라. ° C 20 분 동안 37 ℃에서 흔들어 품어. </li><li> 5 ML의 RP5/EDTA/DTT을 포함하는 새로운 튜브에 장 조각을 전송하고 37 흔들어 ° C를 20 분 동안 품어. 첫 번째 튜브에서 미디어를 저장하고 37 곁에 ° C.를 RP5/EDTA/DTT 세 20 분에서 incubate 총 한번 더이 과정을 반복합니다. 얇은 판의 propria ISO로 진행하는 경우lation 단계는 빈 50 ML 튜브에 남아있는 장내 조각을 전송합니다. </li><li> 세 RP5/EDTA/DTT 세척 (15 ML의 총 부피) 및 펠렛 세포에 저속 (1,200 XG)에서 원심 분리기를 결합합니다. </li><li> 세포 박테리아를 정량화하기 위해 12,000 X g에서 20 분간 뜨는 원심 분리기를 수집합니다. 0.5 펠렛을 resuspend을 - BHI / L에서 1.0 ML 멸균 물 플레이트 시리얼 희석 + G 한천입니다. </li><li> 세포 내 박테리아를 열거하려면, 25 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 RP-5 5ml에 EC 펠렛을 resuspend을. 37 30 분 동안 단일 세포 현탁액을 품어 ° C 플러스 7 % 죽일 수있는 CO 2 남아있는 세포 L. 모노 사이토 제네스. 세포를 용해하기 위해 30 초 동안 0.5 ML 멸균 물과 소용돌이에 일시 중지, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. BHI / L + G.에 물과 플레이트에 시리얼 희석을 준비 참고 :이 단계에서 수집 된 세포는 기본 Peyer의 패치의 세포도 포함됩니다. 원하는 경우, 눈에 보이는 Peyer이다패치는 세척 및 길이 방향으로 절단하기 전에 장 조직에서 제거 할 수 있습니다. </li></ol> 얇은 판의 propria (LP) 분수에있는 박테리아의 9.3 절연 <ol><li> 튜브에 25 ML 멸균 PBS를 추가하여 장 조각에서 초과 DTT / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 씻어. 힘차게 흔들어 새로운 튜브로 전송하고 두 번 반복합니다. </li><li> 40 분 동안 37 ° C에서 동요 1 MG / ML 유형 IV 콜라​​, 40 ㎍ / ㎖ DNase의 I. 부화로 보충 RP-5로 구성된 소화 용액 4 mL를 포함하는 50 ML 튜브에 장 조각을 전송합니다. </li><li> 4 ML 소화 솔루션을 포함하는 새로운 튜브에 소화되지 않은 조각을 전송하고 조직 조각이 완전히 소화 될 때까지 한 번 또는 두 번 반복합니다. 37 해방 LP 세포를 포함하는 소화 솔루션의 각 ° C.에 저장 </li><li> 펠렛 세포에 저속 (1,200 XG)에서 합동 소화 솔루션을 원심 분리기. DESCR로 뜨는 세포 펠렛 별도로 처리각각 세포 및 세포 내 박테리아를 열거 위의 IBED. </li></ol>

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(Krakow). 50, 1-3 (2002).</li><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).</li><li>Camejo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arsenal+of+virulence+factors+deployed+by+Listeria+monocytogenes+to+promote+its+cell+infection+cycle.">The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle.</a> Virulence. 2, 379-394 (2011).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 여기에 설명 된 모든 실험은 켄터키 대학의 ICAUC의 승인을 실험 동물 복지 (OLAW)의 사무실을 준수 하였다.

근친 마우스는 하루의 모든 시간에 먹이를 균일하게 수용하지 않습니다, 그리고 오염 된 빵을 먹는 의지는 두 균주의 종류와 생쥐 17 세의 나이에 따라 달라집니다. 우리의 경험에서 6-9 주 이전 B6 생쥐는 하루 중 어느 시간에 먹이를 수용하지만, 그것은 자신의 어두운주기 동안 제공되지 않는 한 BALB 마우스는 일관되게 빵 조각을 먹을 수 없습니다. 어두운 단계가 실험실 직원에 대한 일반 ...

리스테리아는 인간의 음식을 매개로 감염을 일으킬 통성 세포 내 세균성 병원균이다. 박테리아는 염장 등 건조 우리의 식품 공급을 보호하는 데 사용되는 프로세스의 많은 저항, 또는 냉동 1,2 감염은 일반적으로 소비하기 전에 가열하지 않는 가공 &quot;바로 먹을 수있는&quot;음식에 연결되어 . L. 여러 이전 발생에서, 소스 monocytogenes에 오염 된 식품이 확인되었으며, 노출 된 개인의 제한된 그룹이 밀접하게 3-6 측정 하였다. 이러한 예에서, 그렇지 않으면 건강한 개인에있는 임상 질환은 가벼운 자기 제한 위장관에서 더 심한 장과 전신 감염이 필요한 입원. L.로 변화 신생아와 노인을 포함하여 면역 손상 개인에 monocytogenes의 감염 심지어 항생제 치료와 함께, 높은 사망률 (25-30%)과 관련되어있다 <s7,8&gt;까지. 약간은 L.의 감염 량에 대해 잘 알려져 있습니다 monocytogenes에, 또는 작은 동물 모델의 부족으로 인해 주로 경구 전송 후 감염에 감수성을 지배하는 호스트 요인이 감염 결과의 recapitulates이 넓은 범위. 리스테리아 증의 가장 널리 사용되는 모델 쥐의 정맥 주사 (IV) 예방 접종이다. IV 모델은 높은 재현성, 그리고 감염 9,10 동안 순진와 메모리 T 세포 반응을 연구에 매우 유용했습니다. IV 모델의 단점은 완전히 감염의 창자 단계를 무시한다는 것입니다. 음식을 매개로 전송 한 후, 창자 점막은 아마도 느려지고 지속적으로 말초 조직에 배포 할 수 있습니다 박테리아의 수를 제한하는 장벽을 제공합니다. 대조적으로, 전체 접종은 정맥 투여 분 이내에 비장과 간에서 찾을 수 있습니다, 그리고 생물이 큰 알약은 타고난 면역 D를 압도 할 수 있습니다이러한 조직에서 efenses. 많은 양 (10 9 -10 11 CFU)는 일반적으로 장내 정착이 10을 달성하기 위해 필요하기 때문에 위관 쥐의 구강 감염은 일반적으로는 그다지 사용됩니다. 또한, 먹이 바늘 위내 (IG) 접종 전신 확산에 앞서 위장 감염의 재현 기간을 생성하지 않습니다. 일부 실험실은 L.보고있다 다른 사람이 48 HPI 11-15까지 더 체계적 확산을 보여 주었다 동안 monocytogenes는이 4-12 시간 후 감염 (HPI)에서 비장과 간을 도달합니다. 이 실험실 간 변동은 식도의 안감에 약간의 외상을 초래할 수있는 IG 접종의 침략 자연의 결과, 그리고 박테리아의 직접 혈류의 침략을 촉진 할 수 있습니다. 우리는 최근 경구 L.의 새로운 마우스 모델을 개발 밀접하게 인간의 질병 16의 모든 단계를 모방 monocytogenes의 감염. 마우스가 연속 조각을 섭취 할 때 감염이 발생식품, 비 외상성 인 과정을, 민화 및 실험실 연구자에 의해 전문 기술을 필요로하지 않습니다. 시간의 이산 시간 (36-48 시간)의 경우, L. 모노 사이토 제네스는 재현성 따라서 창자 점막을 통해시키다 및 주변 조직에 배포하는 리스테리아 병원균에 의해 사용되는 메커니즘의 조사를 허용, 오직 위장관 식민지. 중요한 모델이 감염 호스트 타고난 저항의 차이를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이전의 연구에서, 우리는 BALB / C / J 마우스에 의해 /는 L.의 지수 복제, 식품 매개 리스테리아 증에 매우 민감한 것으로 나타났다 창자, 비장, 간 및 담즙 방광 16에서 발생 monocytogenes에. 대조적으로, C57BL / 6 마우스 L. 만 과도 식민지로, 식품 매개 감염에 저항 하였다 monocytogenes는이 조직의 각각에서 발생. 밀접하게 인간의 질병을 모방 식품 매개 모델의 추가 기능은 자연의 보급이다뇌 감염의 나중 단계 (5-7 dpi로) 동안 발생합니다.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brain Heart Infusion Agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>BD-241830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9650</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>Omnipur</td>
 <td>4840</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15575-038</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D5545</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase, type IV</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS004089</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS002007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Diff-Quik</td>
 <td>Dade-Behring</td>
 <td>B4132-1A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PowerGen 1000 homogenizer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-261-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stainless steel type 304 mesh #80</td>
 <td>Small Parts, Inc.</td>
 <td>CX-0080-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytospin</td>
 <td>Statspin</td>
 <td>M801-22</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

oral transmission of listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food

L. monocytogenes에 인간의 음식을 매개로 감염을 일으킬 통성 세포 내 세균성 병원균이다. 거의 밀접하게 인간의 질병을 모방 작은 동물 모델의 부족으로 인해 리스테리아 증의 위장 단계에 대한 알려져있다. 이 문서는 L.의 구두 전송을위한 새로운 마우스 모델을 설명 모노 사이토 제네스. 쥐 먹이 L.,이 모델을 사용하여 monocytogenes에 오염 된 빵 감염 (BALB / C / J으로 /) 또는 저항 (C57BL / 6) 마우스 종자의 전신 확산의 정도를 변화 뒤에 위장 감염의 이산 위상을 보유하고 있습니다. 감염의 나중 단계 동안, 담즙 방광과 뇌에 보급이 관찰된다. 리스테리아 증의 식품 매개 모델은 높은 재현성 전문 기술을 필요로하지 않으며, 세균 분리 및 실험실 마우스 종자의 다양한에서 사용할 수 있습니다. 따라서, 그것은 L.에 의해 사용되는 두 독성 전략을 연구하는 이상적인 모델입니다 monocytogenes에 </EM&gt; 장 식민지뿐만 아니라, 침략 음식을 부담 세균 감염에 대한 숙주의 반응을 촉진합니다.

L. monocytogenes에 식민지는 37 ℃에서 36-48 시간 배양 한 후 BHI / L + G 플레이트에서 볼 수 식민지 부드러운 돔 모양의 크림색 외관 (그림 1A)가 있습니다. 성장은 장내 미생물의 대부분을 억제하지만, L.없는 일부 식민지를 참조하는 것이 일반적입니다 수 monocytogenes에 직접 중요한 희석 (그림 1B)없이 소장이나 대장 도금 특히. 의심 식민지 ChromAgar TM <...

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Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

이 논문은 사용하는 마우스의 경구 감염에 대한 새로운 방법을 설명<em&gt; 리스테리아</em음식&gt; - 오염. 프로토콜은 쉽게 다른 식품 매개 세균성 병원체에 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.

경구 전송<em&gt; 리스테리아</em&gt; 오염 된 음식의 섭취를 통해 마우스의

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

oral-transmission-listeria-monocytogenes-mice-via-ingestion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

19.1K 조회수.  University of Kentucky. 이 논문은 사용하는 마우스의 경구 감염에 대한 새로운 방법을 설명 리스테리아 - 오염. 프로토콜은 쉽게 다른 식품 매개 세균성 병원체에 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.

비디오: Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

연구

면역학 및 감염병학

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA 정제는 세포 내에서 재배<em&gt; 리스테리아</em&gt; 식세포 세포에

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

Listeria monocytogenes 뇌의 감염

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

리스테리아 단세포 유전자 감염 다음 마우스 비장에서 시투 인터페론 감마 생산의 이미징

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Inducing Meningococcal Meningitis Serogroup C in Mice via Intracisternal Delivery

Neisseria meningitidis (meningococcus) is a narrow-host-range microorganism, globally recognized as the leading cause of bacterial meningitis. Meningococcus is a transient colonizer of human nasopharynx of approximately 10% of healthy subject. In particular circumstances, it acquires an invasive ability to penetrate the mucosal barrier and invades the bloodstream causing septicaemia. In the latest case, fulminating sepsis could arise even without the consequent development of meningitis. Conversely, bacteria could poorly multiply in the bloodstream, cross the blood brain barrier, reach the central nervous system, leading to fulminant meningitis. The murine models of bacterial meningitis represent a useful tool to investigate the host-pathogen interactions and to analyze the pathogenetic mechanisms responsible for this lethal disease. Although, several experimental model systems have been evaluated over the last decades, none of these were able to reproduce the characteristic pathological events of meningococcal disease. In this experimental protocol, we describe a detailed procedure for the induction of meningococcal meningitis in a mouse model based on the intracisternal inoculation of bacteria. The peculiar signs of human meningitis were recorded in the murine host through the assessment of clinical parameters (e.g., temperature, body weight), evaluation of survival rate, microbiological analysis and histological examination of brain injury. When using intracisternal (i.cist.) inoculum, meningococci complete delivery directly into cisterna magna, leading to a very efficient meningococcal replication in the brain tissue. A 1,000-fold increase of viable count of bacteria is observed in about 18 h. Moreover, meningococci are also found in the spleen, and liver of infected mice, suggesting that the liver may represent a target organ for meningococcal replication.

Here, we describe a method to induce meningococcal meningitis through an intracisternal route of infection in adult mice. We present a step by step protocol of meningococcal infection from the preparation of inoculum to the intracisternal infection; then record the animal survival and evaluate the bacterial loads in murine tissues.