Neisseria 뇌막염은 전 세계 인간 인구 중 패혈증과 뇌막염의 일반적인 원인 중 하나이며 박테리아는 인간의 숙주로 제한됩니다. 이 실험 프로토콜에서, 우리는 박테리아의 인종 차별성 접종을 기반으로 마우스 모델에서 수막 구균 수막염의 유도를위한 맞춤형 절차를 설명합니다. 이 뮤린 모델은 심각한 인간 질환으로 수막 구균 수막염의 특징적인 병리학적 사건을 재현했습니다.
따라서 숙주 병원체 상호 작용을 평가하고 이 치명적인 질병에 대한 병원체 메커니즘을 분석하는 유용한 도구를 나타냅니다. 감염 모형은 CSF로 박테리아 복제를 직접 방지하기 위하여 혁신적인 치료 전략을 평가하는 것 뿐만 아니라 인간 병원체에 대하여 가능한 수동 면역 요법의 효험을 분석하기 위하여 유용할 수 있었습니다. 이 기술은 인인종 차별성 무접종뿐만 아니라 일반적으로 질병 유도의 성공을 보장하기 위해 훈련 단계가 필요합니다.
절차를 시연하는 것은 연구원으로 로버타 콜리치오와 키아라 Pagliuca, 그리고 엘레나 스카글리오네 박사 과정 학생으로, 모두 내 실험실에 의해 될 것입니다. 시작하려면, 신선한 Neisseria 수막염 문화에서 단일 식민지를 선택 고노코칼 한천 판에 1% 폴리비톡 스 보충 및 접종 10 밀리리터 GC 브로스. 수막구치의 사용을 포함하는 모든 절차는 라미나르 흐름 바이오 안전 큐브 캐비닛에서 수행해야합니다.
220 RPM에서 궤도 쉐이크 인큐베이터에서 37도에서 박테리아를 성장시키고 분광계로 다른 시점에서 배양의 광학 밀도를 계속 검사합니다. 초기 지수 단계에 해당하는 0.7의 OD600에 도달할 때까지 배양을 성장시다. 이 광학 밀도가 얻어지면 10% 글리세롤을 추가하고 저온 바이알에 배양 1밀리리터를 분배하여 냉동 주식을 만듭니다.
사용 전까지 바이알을 섭씨 80도에 보관하십시오. 감염 전에, 실온에서 냉동 박테리아를 해동한 다음 1500xG에서 15 분 동안 원심분리기의 원심분리기 튜브로 옮기고 1킬로그램 철 분당 5 밀리그램을 포함하는 신선한 GC 국물의 1 밀리리터에서 다시 중단하십시오. 실험을 시작하기 전에 동물의 무게를 측정하고 체온을 평가합니다.
동물을 목 아래에서 긁어 내고 복부를 70%에탄올로 소독합니다. 감염 전 약 2시간 전에, 25 게이지 바늘을 사용하여 복부의 오른쪽 아래 사분면에 철 드레이펜을 내분비로 주입한다. 동물을 마취 한 후 발가락을 꼬집을 때 통증 반응의 부재를 확인하여 마취의 깊이를 확인하십시오.
라미나르 플로우 캐비닛에 마우스를 배치한 후 흉골 디큐비투스에 마우스를 배치하고 팔다리와 자궁경부 척추를 조심스럽게 스트레칭하여 척추 컬럼을 직선 위치로 유지합니다. 일관된 세균 현탁액을 유지하려면 8밀리미터 30 게이지 바늘로 주사기에 적재하기 전에 부드럽게 섞습니다. 70%에탄올로 머리를 소독합니다.
동물을 측면 의식으로 놓고 귀를 길에서 꺼내 목을 적당히 구부리면 됩니다. 목과 머리의 중간선이 테이블 상단과 완벽하게 평행한 위치에 있는지 확인합니다. 그런 다음 아틀라스 날개를 터치하여 겹치는지 확인하고 바늘이 후수 구멍에 들어갈 가능성이 가장 높은 미드라인의 자연스러운 들여쓰기를 느낍니다.
수막구치 또는 철 제비 균의 확립 된 하위 치명적인 세균 복용량으로 8 밀리 미터 30 게이지 바늘주사사기를 채우는 총 부피로 GC 국물을 10 마이크로 리터로 조절하십시오. 바늘을 사용하여 주사 지점을 식별한 다음 후두 버 구멍을 통해 마우스의 시스테나 마그나에 주사기의 함량을 주입한다. 주사 후 주사기와 바늘을 안전하게 버리십시오.
동물을 라미나르 플로우 캐비닛 아래에 케이지에 놓습니다. 프로토콜에 설명된 바와 같이 각성과 완전한 움직임 회복을 기다린 후 감염된 동물의 동물 생존을 진행한다. 마우스를 마취한 후 가슴을 70%에탄올로 소독합니다.
25 게이지 바늘을 사용하여 가슴 구멍의 심장 구멍에 의해 혈액의 600 ~ 700 마이크로 리터를 철회합니다. 구연산나트륨 3.8%를 함유한 튜브에서 혈액을 수집하고 나중에 가능한 세균세포 수 평가를 위해 섭씨 80도에 보관한다. 안락사 된 마우스를 supine 위치에 놓습니다.
가위와 집게를 사용하여 신체의 처진 평면을 따라 털을 자른다. 핀으로 바디의 측면에 털로 피부를 고정합니다. 날카로운 가위를 사용하여 수막을 차단합니다.
그런 다음 가위와 일회용 집게를 사용하면 비장과 간과 같은 장기를 소비하고 각각 10 %의 글리세롤을 보충한 GC 국물의 1 밀리리터로 별도의 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 5mm 주사기의 플런저를 사용하여 단일 세포 현탁액이 형성될 때까지 실온에서 약 2 ~3 분 동안 기계적으로 기관을 균질화하고 괴성 냉동 저온 바이알로 옮김합니다. 튜브를 드라이 아이스에 즉시 놓습니다.
항생제로 GC 한천 접시를 만들고 2 ~ 3 시간 동안 섭씨 37도에서 사용하기 전에 건조하십시오. 각 균질화 조직에서 GC 국물에 있는 샘플의 10개의 전체 직렬 희석을 준비합니다. GC 한천 접시에 접시를 매고 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 하룻밤 배양.
70%에탄올로 안락사 마우스의 머리를 소독합니다. 작은 수술 가위와 미세 한 기울어진 강철 집게를 사용하여, 제거 된 머리의 모피와 피부를 절제한 다음 봉합사를 명확하게보고 두개골의 개구부를 안내하기 위해 두개골 의 상단으로 진행합니다. 두개골을 열려면 포라멘 매그넘을 통해 작은 가위의 끝을 삽입하십시오.
두개골의 중심을 향해 정수리 뼈의 중간선을 가로질러 두개골의 반대편으로 자르고 람도이드 봉합사의 측면 사지를 따라 부드럽게 자릅니다. 후방 정수리 코너에서 시작하여 미세 한 포셉을 사용하여 두개골을 들어 올려 뇌를 발견하기 위해 대각선 위로 당겨 두개골이 들어 올릴 때 뇌 조직이 머리의 뼈에 부착되지 않도록합니다. 일회용 집게를 사용하여 두개골과 뇌 사이의 결합 조직을 제거하고 뇌 조직이 건조되는 것을 허용하지 않습니다.
일회용 집게를 사용하여 10%의 글리세롤을 보충한 GC 국물의 1밀리리터로 페트리 접시에 뇌를 즉시 배치하십시오. 5 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 단일 세포 현탁액이 형성될 때까지 실온에서 뇌를 기계적으로 균질화하십시오. 서스펜션을 2 밀리리터 멸균 튜브로 옮기고 나중에 가능한 세균세포 수 평가를 위해 섭씨 80도에 보관한다.
93/4286 야생형 또는 cssA 결함이 있는 Neisseria 뇌막염 균주에 감염된 마우스의 생존을 평가하였다. 야생형 균주에 대한 중위 치명적인 투여량은 10-4CFU의 수막구균 챌린지에 해당하였다. 반면 사망률 10 대 5 CFU는 83.4%와 100%와 100%로 10대 5CFU 투여량에 해당하였다.
cssA 결함이 있는 돌연변이 균주에 대한 중간 치명적인 용량을 얻기 위해, 10대 8CFU의 투여량이 필요하고 야생형 균주보다 1000배 더 높았다. 주사 후, 뇌 조직에서 야생 형 박테리아의 급속 한 증가 약에서 피크에 도달 24 감염 후 시간. 돌연변이 균주에 감염된 마우스의 뇌에서, 실행 가능한 수는 시간이 지남에 따라 점진적으로 떨어졌다.
또한, 돌연변이 감염된 마우스의 33.3%는 야생형 감염된 동물과 달리 감염 부위로부터 세균성 클리어런스를 보였다. 감염 후 48시간 후, cssA 결함이 있는 돌연변이는 비장과 간에서 완전히 지워졌고, 야생형 균주에 감염된 동물은 지속적인 감염을 나타냈다. 설명된 실험 방법은 면역 조직화학, 면역형광, 대뇌 출혈 분석과 같은 병리학적 평가에 의해 이 치명적인 질병과 관련된 뇌 손상을 분석하는 데 유용할 수 있다.
