이 방법은 혈액 매개 박테리아가 중추 신경계와 뇌를 감염시키기 위해 혈액 뇌 장벽을 통과 할 수 있는지 여부에 대한 세균 성 병인 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술로, 감염된 동물의 혈액과 뇌 조직 내의 세균성 숫자는 뇌의 혈관 내에 거주하는 박테리아의 수를 제외하면서 결정될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 동료 인 Pallab Ghosh가 될 것입니다.
감염 후 72시간 에서 자동화된 관류 시스템을 분당 EDTA 10밀리미터로 보충한 PBS의 4밀리리터의 유량으로 설정합니다. 그리고 안락사 된 동물을 해부 팬에 수핀 위치에 놓습니다. 발 핀치에 대한 응답의 부족으로 안락사를 확인합니다.
그리고 75 %에탄올로 복부를 적시. 가위를 사용하여 흉곽 바로 아래에 복부 벽 절개를 하여 다이어프램과 내장 기관을 노출하십시오. 그리고 흉부 구멍을 열기 위해 다이어프램을 잘라.
왼쪽 심실을 노출하고 부드럽게 마음을 잡기 위해 집게를 사용하여 양측으로 문질러 케이지를 잘라. 21 게이지 나비 바늘을 왼쪽 심실로 관류 시스템에 연결된 21 게이지 나비 바늘을 삽입하고 오른쪽 아트리움을 조심스럽게 잘라 약 200 마이크로리터의 혈액을 10 밀리미터 EDTA가 함유된 2밀리리터 튜브로 수집하여 응고를 방지합니다. 그런 다음 PBS 플러스 EDTA의 15 ~20 밀리리터와 4 분 동안 동물을 perfuse.
완전한 관류 후에, 두뇌와 간은 남은 박테리아가 순환 혈액이 아니라 수확한 기관에서 이다는 것을 지키는 희게 나타납니다. 관류에 따라 관심 있는 장기를 개별 멸균, 튜브 당 섭씨 4도의 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원내 튜브로 조심스럽게 옮기시다. 참수 후 뇌를 수확하려면 가위를 사용하여 두피 피부를 눈 사이의 중간선 아래로 자르고 필요에 따라 과도한 조직을 다듬기 위해 두개골에 대한 팁을 유지하십시오.
가위의 한 쪽 끝을 포라멘 매그넘에 부드럽게 삽입하고 측면양쪽의 두개골에 옆으로 자른다. 조심스럽게 두개골의 중간선 아래로 눈 사이의 두개골을 잘라, 측면 압력을 적용하고 뇌의 혼란을 피하기 위해주의. 집게를 사용하여 두개골을 열어 뇌를 드러내고 뇌의 밑면과 두개골 의 밑면 사이에 주걱을 배치하여 4도 의 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 조심스럽게 뇌를 옮길 수 있습니다.
생물 안전 캐비닛에서 팁을 삽입하고 10초 동안 조직 균질화제를 순차적으로 5% 표백제, 멸균 수, 75%에탄올 및 멸균 물 용액을 별도의 15밀리리터 원문 튜브에 실행합니다. 팁이 완전히 살균되었을 때 튜브에 감염된 뇌를 균질화하십시오. 눈에 보이는 조직 단편이 남아 있지 않은 경우 팁을 다시 살균하여 다음 장기 샘플로 세균이 이월되는 것을 방지하고 다음 장기를 균질화합니다.
모든 장기가 균질화되면 멸균 PBS에서 각 장기의 10 배 연속 희석을 준비하고 뇌 심장 주입 한천 판에 희석을 플레이트. 그런 다음 하룻밤 사이에 37섭씨에서 균질 희석 배양을 배양하고 각 플레이트의 식민지 수를 계산하여 장기 당 박테리아 또는 혈액 밀리리터당 박테리아의 총 수를 결정합니다. L.monocytogenes-감염된 마우스 기관에 있는 세균성 부담의 계산은 단지 입증된 바와 같이 관류 감염이 이 대표적인 연구 결과에서 검토된 감염된 마우스의 혈액 또는 기관에 있는 세균성 부담을 현저하게 바꾸지 않는다는 것을 건의합니다.
이 절차에 따라, 리스테리아 단세포 유전자 감염 기관은 감염되지 않은 대조군 동물에 비해 감염된 마우스 기관에 염증 세포의 침투에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 조직 병리학 적 처리와 같은 추가 분석을 위해 추가 로 처리 될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 뇌의 혼란을 방지 하 고 가위와 뇌 조직 사이 최소한의 접촉을 유지 하는 것을 기억 하는 것이 중요 하다.
