말, JCG, 그리고 부인은 NIA (R00AG033176 및 R01AG040081)와 연구실 감독 연구 및 개발, # DE-AC02-05CH11231 에너지 계약의 미국 부서에서 지원됩니다.

1. 조직 가공 소화 <ol><li> 수술 절차의 폐기 소재로 인간의 유방 조직을 얻습니다. 감소 mammoplasties는 정상 또는 양성 세포를 제공 할 수 있습니다, fibroadenomas과 gynecomastias는 양성 세포를 제공, 비 종양이 유방 절제술의 조직은 (주변 장치 또는 종양에 contralateral, 또는 피하) 일반의 포함 microtumors에 양성으로 다양 할 수 있습니다 세포를 제공합니다. 적절한 IRB 승인 전에 폐기 자료를 확보하기 위해 존재 확인하십시오. 모든 자료는 bloodborne 병원균 규정에 따라 처리해야합니다. </li><li> 버퍼 나 미디어를 포함하는 멸균 용기 (예 : 1시 1분 Dulbecco의 수정 된 이글의 매체와 햄의 F-12)에서 개최 재료는 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 5 μg / ML Fungizone, 50U/ml polymyxin B와 보충 4에 연구실로와 10 % 태아 소 혈청 및 전송 ° C. 감소 mammoplasty 조직이 크게 쓰에 영향을주지 않고 72 시간에 대해 4 ° C에 보관하거나 배송 될 수 있습니다bsequent 세포 생존 능력. 비 감소 mammoplasty 조직의 작은 조각 더 프롬프트 처리를 요구할 수 있습니다. </li><li> 멸균 메스, 집게와 가위의 조합을 사용하여 지방 조직, 결합 조직 및 혈관의 stromal 매트릭스에서 상피 영역을 분리합니다. 대형 유리 무균 접시에 가위와 장소가있는 조직의 조각 (예를 들어, 150mm)를 자른다. 부드럽게 필수적인 지방산 물질을 멀리 밀고 자료와 메스를 잡아 포셉을 사용하여 yellower stromal 매트릭스에 포함 된 흰색 가닥으로 표시 상피 영역을, 나가 해부. 소화를 촉진하기 위해 50 ML 테스트 튜브에 반대 메스와 장소를 사용하여 ~ 3-4밀리미터의 작은 조각으로 상피 조직을 잘라. 조직의 대량 처리되는 경우, 신선한 메스 블레이드가 필요 할 수 있습니다. 기관 규정에 따라 폐기 음식에서 지방산 물질을 제거합니다. <ol class="lalpha"><li> 크게 섬유 조직에서 (예를 들어, 피하 매스심한 fibrocystic 질환이있는 tectomies), 더 흰색, 비 상피 재료가있을 것입니다. 여기에는 섬유 매트릭스에서 상피 세포를 해부하기 어려울 수 있습니다. 섬유 소재의 대형 조각이 지역에 ~ 1-3mm 광장 있으며, 별도의 소화 작은 조각으로 절단 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 튜브의 양의 더 큰 것보다 세째을 포함하는 조직을 원추형 원심 분리기 튜브 (50 ML 또는 15 ML)로 해부하는 상피 조직을 배치합니다. 조직 소화 혼합물을 (DME/F-12 또는 동급, 10 μg / ML 인슐린, 위 등의 항생제, 10의 최종 농도 사용하여 회전하는 동안 혼합 할 수 있도록하기 위해 단지 작은 공기 공간을두고 전체 볼륨에 관을 올려 % FCS, 200 U / ML 원유의 collagenase 및 100 U / ML hyaluronidase. </li><li> 장소 HulaMixer 관 회선 근에 튜브 37에서 밤 8 rpm으로 360 °를 회전 ° C. </li><li> 5 분 600 XG에 튜브를 원심 분리기. 폐기 조약 표면에 뜨는 지방과 중간을 삭제 하시겠습니까기관 규정에 들죠. </li><li> 중간에있는 펠릿의 작은 나누어지는을 diluting하여 소화 완료를 확인합니다. 소화는 현미경 검사가 첨부 된 기질 (그림 1A)에서 무료로 부드러운 게재, ductal 폐포, 또는 ductal - 폐포 구조와 세포의 clumps을 (organoids)이 표시되면 완료된 것입니다. 감소 mammoplasty의 조직은 일반적으로 여전히 밤새 소화 한 후 첨부 된 기질을 보여줍니다 및 추가 소화 시간이 필요합니다. <ol class="lalpha"><li> 또 다른 4-12 시간에 37 ° C에서 회전 신선한 조직 소화 혼합하고 다시 배양에서 불완전하게 소화 펠렛을 Resuspend. 단계 1.6 1.7를 반복합니다. 소화가 여전히 불완전한 경우, 다시 37 ° C 하룻밤에 회전 펠렛을 다시 부화 소화 혼합물을 추가합니다. 효소의 농도는 하루 아침에 오버 소화을 방지하기 위해 감소 될 수있다. </li></ol></li><li> 소화가 완료되면 5 분에 600 XG에 튜브를 원심 분리기, 다이제스트를 대기음약 15 ml/50 ML 튜브, 5 ml/15 ML 튜브의 중간 플러스 항생제의 이온 혼합, resuspend 펠렛. </li></ol> 2. 여과 및 소화 물질의 동결 <ol><li> 멸균 50 ML 튜브를 통해 멸균 100 μm의 스트레이너에 resuspended 펠릿의 aliquots을 전송합니다. 관에있는 매체 배수하자 다음 매체로부터 2-3 ML로 가기 1 - 배 시간에 organoids을 rewash. resuspended 펠렛의 모든 전송 될 때까지 반복합니다. 너무 많은 필터에 organoids 및 매체가 더 이상 쉽게 배수되지가있는 경우, 나머지 재료 새 필터 (들)을 사용합니다. 조심스럽게 또 다른 멸균 튜브의 상단에있는 필터 (들)을 회전시키면서 더 많은 매체 튜브에 organoids을 씻는다. 이 100 μm의 organoid 풀 수 있습니다. </li><li> 원래 50 ML 튜브로 배수 자료를 가지고 대부분 폐포 구조를 포함 40 μm의 organoid 풀을 얻기 위해, 40 μm의 스트레이너를 사용하여 2.1 프로세스를 반복합니다. 일에 배수 재료전자 튜브 중간 엽과 상피 세포와 vasculature의 작은 조각 / 단일 작은 clumps를 포함하는 여과 풀을 구성합니다. </li><li> 5 분 600 XG의 펠렛은 100 μm, 40 μm, 그리고 여과 풀. </li><li> 표면에 뜨는, reconstitute에게 포장 펠릿 0.1 ML 당 CPMII의 약 1 ML을 사용하여 CPM II (DME/F-12 또는 44% FCS와 6% DMSO와 이에 상응하는 금액)의 각 튜브를 대기음. 4 ° C.에 보관 </li><li> 아래 3.2에서와 같이 드롭하여 35mm 조직 문화 플라스틱 접시 드롭에 resuspended 소재의 0.1 ML를 삽입 시드 2 organoid 수영장위한 테스트 요리를. 여과 풀 직접 섬유 아세포 매체 (10 μg / ML의 인슐린와 10 % FBS와 DME/F-12 또는 동급)를 조직 배양 플라스틱에 놓는 할 수 있습니다. </li><li> Nunc 형 동결 ampoules (1 ML / 2 ML의 앰풀)로 나누어지는이 남아있는 resuspended 자료. -80 ° C에서 밤새 고정 후 액체 질소에 저장 장치에 즉시 전송할 수 있습니다. 우리는 생존의 상당한 손실을 관찰하지 않은오리지널 ampoules에 저장된는 후반 1970 년대부터 고정. </li></ol> 3. 냉동 Organoids과 차 문화의 하위 문화을 퍼 뜨리고 <ol><li> 신속하게 37 ° C의 물을 욕조에 organoids을 포함하는 냉동 앰풀을 해동. 앰풀의 organoids의 수의 시각적 평가에 따라 2-10 (보통 ~ 6) 60mm 요리, 또는 1-3 100mm 요리에 씨 organoids합니다. 60mm 요리 당 놓는 약 20-40 organoids는 최적입니다. </li><li> 해동 organoids는 신중하게 배치되어 organoids의도 배포 1 ML 피펫 또는 파스퇴르 피펫으로 요리 표면에 드롭하여 놓습니다. Organoids 가까운 곳에는 하위 문화 또는 동결에 대한 이하의 셀에 상승을 제공, 가지에 대한 공간이 제한됩니다 놓았다. (세포가 지난 긁힌 표면을 성장하지 않는 경향) 요리 표면을 긁는하지 마십시오. organoids 첨부 한 후 천천히 organoids (예를 들면 2-3 ml/60 mm 요리) dislodging 방지하기 위해 성장 매체를 추가 할 수 있습니다 1-2 분 기다립니다. 나는37 번 ° C humidified CO 2 인큐베이터에서 ncubate. 다음은 주요 문화입니다. 현재 가장 강력한 HMEC 성장 (그림 2)에 대한 M87A + 옥시토신 (X) 매체를 사용합니다. </li><li> 1 일 이내에, organoids가 연결되어 있는지 확인하십시오. 추가 매체 (예 : 2-3 ml/60 mm 요리)를 추가합니다. organoids에서 셀 마이그레이션 심는 후 48-72 시간 (그림 1B, C)으로 24-48 시간, 그리고 mitotic의 가지로 볼 수 있습니다. 때때로 첨부 파일은 특히 나이 많은 여자에서 overdigested organoids 또는 organoids을 도금하는 경우, 24 시간 후에는 가난하지만, 대부분의 준비는 72 시간 내에 첨부합니다. vasculature의 작은 조각은 첨부 섬유 아세포 세포 가지 (그림 1D)에 상승을 줄 수 있습니다. </li><li> 문화에게 최소 3 회 일주일에 먹이. M87A 형 미디어에서 재배 세포가 시딩의 밀도에 따라, 5-8 일 이내에 근처 합류로 성장합니다. </li><li> 에 따라 큰 섬유 아세포 성장, 차동 Trypsinization (DT)는,이있는 경우표면 플라스틱에서 섬유 아세포의 급속한 이탈은 섬유 아세포를 제거하는 필요합니다. 상피 패치 STE (생리, 0.05 % 트립신, 0.02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 기음 대형, 기음 미디어, 세탁 요리 (예, 1-2 ml/60 mm 요리)가되면 실온에서 신선한 0.5 ML의 STE을 추가하고 떠나 연속 현미경 관찰 1 주변 분을위한. 섬유 아세포가 분리하지만 상피 세포가 부드럽게 여전히 자기편이지만 급격히 섬유 아세포를 제거하기 위해 하드 표면에 대한 요리의 측면을 잃었하고 신속하게 기음합니다. PBS로 한 번 씻어, 다시 대기음. 크게 섬유 아세포로 오염 된 문화는 추가 DT가 필요할 수 있습니다. </li><li> 대형 상피 패치가 존재 차 문화를 하위 문화 있지만, 합류하기 전에. organoid 심는 및 첨부 파일의 밀도는 필요한 시간에 영향을 미칠 것입니다. 주 문화를 유지하고 시간이 지남에 따라 간격을두고 여러 차 문화를 생성하기 위해 일부 Trypsinizations (PT)을 수행합니다. </li><li> 기음 미디어는 요리에 0.5 ML 신선한 STE을 추가, 1-2 ML의 STE와 60mm 요리를 씻는다. 셀 부대를 홍보 할 수있는 요리의 부드럽게 두드리는 소리와 함께 1-5 분 동안 실온에서 현미경으로 세포 부대를 관찰. Trypsinization은 세포 ~ 50 %가 분리했을 때 중지해야합니다. 조기 포인트는 일반적으로 빠른 세포 손상이 있습니다. 모든 세포가 빨리 내려 올 수 있으므로 나중에 포인트를 들어, 세포는, 조심 모니터링, 빠른 분리를 위해 37 ° C에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 접시에 혈청 함유 미디어의 2 ML을 추가 repipette는 세척 및 살균 15 ML 튜브로 전송합니다. 관에 빨래를 추가, 다른 ~ 1-2 ML 미디어와 함께 배를 반복합니다. 기본 요리를 Refeed와 보육로 돌아갑니다. 혈구와 튜브에 세포를 계산합니다. 한 번 subcultured, 세포 모르겠지만이없고, 포인트는 subcultured 또는 냉동 예비 (제 2 통로 세포가 예비라고의 기본 요리와 이에 상응하는 장기적인 성장의 좋은 세포 regrowth을 8-4 주위에 번 반복 할 수 있습니다nger의 예비 선거). 일단 organoid 물질이 차 문화에 존재는 더 이상 없다 subcultured 예비 장기 인구 복제 가능성의 감소를 보여줍니다. </li><li><ol class="lalpha"><li> 예비으로 하위 문화를 들면, 종자 세포에 직접 요리에 관에서. 이러한 M87A + X와 같은 강력한 매체에 1-2 × 10 5 cells/100 mm 요리를 심는 것은 4~7일에 합류 될 것입니다. 우리는 proliferative 가능성을 높이기 위해 제 2 통로에있는 매체에 콜레라 독소를 추가, 그것은 organoids에서 multilayered 세포 가지로 연결하기 때문에 콜레라 독소는 차 문화에 생략됩니다. </li><li> 냉동의 경우 예비로, 펠릿 관 10 6 세포 / ML의 최종 밀도 CPMII에서 5 분, 그리고 resuspend 600 XG에서. 나누어지는이 Nunc 형 동결 ampoules에 세포를 resuspended -80시 야간 고정 ° C 한 후 액체 질소에 저장 장치에 즉시 전송할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 그것은 보관에 대한 첫 번째 태평양 표준시에서 세포를 고정하는 것이 좋습니다, 그리고 수 있습니다하위 문화에 대한 두 번째 태평양 표준시의 세포를 사용합니다. 추가 포인트는 나중에 사용하기 위해 냉동 보관하실 수 있습니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 인간의 유방 조직 처리 방법은 인간의 가슴속에 세포 유형의 이기종 혼합물에서 순수한 유방 상피 세포를 획득 할 수 있습니다. 고정 크기의 구멍을 통해 여과 소화 stromal 매트릭스에서 유선의 다른 분수 (예를 들어, ductal 및 ductal - 폐포 대 폐포)의 분리 할 수 있습니다. Isogenic 유방 섬유 아세포는 상피 세포와 일치하도록 얻을 수 있습니다. 냉동 소화 물질은 30 년 좋은 생존은 그대로 남아 있습니다. 이 방법은 모든하지만 매우 섬유 유방 조직에 성공적으로 일을하고, 수행 할 수 간단했다. 유방 조직 처리의 다른 변형은 가능한 깨끗하고, 또는 분리 된 상피 분수를 제공하지 않는 존재합니다. 같은 M87A의 낮은 스트레스를 유도하는 매체와 문화에 처리 organoids의 위치는 여러 계보 (Lineage) 마커와 HMEC의 장기 성장을 할 수 있습니다. 플라스틱 배양 된 HMEC는 여전히 장군에게 능력을 보유생체 같은 혈통 관계의 정상적인있는 테 3D 구조. 이 HMEC 문화는 정상적인 HMEC 행동과 노화와 변화를 추진하거나 억제 할 수 있습니다 요인의 높은 처리량을 포함한 광범위한 실험 조사, 적합합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 유리 페트리 접시 15cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> 가위 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> 집게 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> 일회용 메스 </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 시그마 </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> 시그마 </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 시그마 </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / 스트렙토 마이신 </td><td> 생명 기술 </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> 생명 기술 </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polymixin B 황산 </td><td> 생명 기술 </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 생명 기술</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> 트립신 0.05 % 100 ML </td><td> 생명 기술 </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 생명 기술 </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> 생명 기술 </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 100 μm </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 40 μm </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 튜브 15 ML </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> 튜브 50 ML </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> TC 요리 10cm </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> TC 요리 6cm </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> 극저온 튜브 </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> 하우저 과학 </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf 모델 </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

실험 정상적인 인간의 유방 상피 세포 (HMEC) 행동의 검사 방법과 정상 세포 이상 속성을 취득은 체외 문화 시스템에 의해 촉진 될 수 생체 생물학에 더 정확하게 모델입니다. 세포 차별화를 공부 인간의 유래 물질의 사용은 노화, 노화, 그리고 불멸화 1-2 인간과 일반적으로 활용 쥐 세포 사이의 이러한 속성에서 많은 중요한 분자의 차이 주어진 특히 바람직하다. 정상과 비정상 조직의 대량는 감소 mammoplasty과 유방 절제술의 수술의 주파수로 인해 사용할 수 있기 때문에 유방 세포는 편리한 모델 시스템을 제시한다. 유선은 많은 서로 다른 세포 유형, 예를 들어, 상피, 지방, 중간 엽, 내피의 복잡한 혼합물로 구성되어 있습니다. 상피 세포는 젖 분비의 차별화 된 유방 기능을 할 책임이 있습니다또한 인간 유방암의 대부분의 출처입니다. 우리는 순수한 상피 구성 요소로뿐만 아니라 중간 엽 세포에게 3 유선 수술 폐기 조직을 처리하는 방법을 개발했습니다. 처리 자료는 무한정 냉동 보관 또는 기본 문화에 시작 할 수 있습니다. 외과 폐기 자료는 실험실로 이송하고 수동 상피 포함하는 조직에 풍부하게 해부하고 있습니다. 해부 조직의 후속 소화은 지하 막에있는 상피 조직에서 collagenase와 hyaluronidase 스트립 stromal 자료를 사용합니다. 상피 나무의 결과 작은 조각 (organoids)는 고정 기공 크기의 멤브레인에 연속 여과하여 소화 기질로부터 분리 될 수있다. 기공 크기에 따라 분수가 큰 폐포 / ductal 조각, 작은 폐포 클러스터, 또는 stromal 세포로 구성된 얻을 수 있습니다. 문화는 비밀입니다으로보다는 organoids로 시작하는 경우 우리는 뛰어난 성장을 관찰 한sociated 단일 세포. 낮은 스트레스를 유발 미디어를 사용 문화에 organoids의 위치는 여러 계보 (Lineage) 유형 (myoepithelial, luminal, 전구) 4-5의 마커와 일반 HMEC의 장기적인 성장을 지원합니다. 세포의 충분한 숫자는 높은 처리량 modalities를 사용하여 표준화 된 셀 배치뿐만 아니라 심문을 사용하여 다양한 실험 시험을 허용 한 개인의 조직에서 얻을 수 있습니다. 양식 HMEC는 성장, 분화, 노화, 그리고 노화, 어떻게 이러한 일반적인 프로세스가 불멸과 악성 변화 4-15,16 동안 변경 아르에 관한 일반적인 과정을 조사 연구 다양한 고용되었습니다. 세포 외 기질 재료, 다른 세포 유형, 및 / 또는 3D 문화의 존재 성장의 효과는 플라스틱 5,15의 성장과 비교 될 수있다. 양식 HMEC는 정상 세포로 시작, 그 요인을 검토하는 실험적으로 다루기 쉬운 시스템을 제공인간의 노화와 발암을 추진하거나 방지 할 수 있습니다.

적절하게 organoids에 소화와 문화에 배치 조직에 ​​대한 대표 수치는 그림 1에 표시됩니다. 불완전하게 소화 조직 물질이 이러한 구조의 외부에 부착하고, 가능성이 DT 제거 요구, 기본 문화에 fibroblastic 세포 성장을해야합니다 표시됩니다. Overdigested 조직 적은 부드러운 외부 경계를 표시하고, 기본 문화에 첨부하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 상피 가지가 48-72 시간 (1B, C)에서 시작해야합니다. vasculature (1D)의 작은 조각은 중간 엽 세포 가지의 소스가 될 수 있습니다. 상피 outgrowths는 myoepithelial, 전구, 그리고 luminal lineages (1E, 3C-E)와 관련된 마커와 세포의 혼합물을 포함 proliferative 인구, morphologically 이기종 인구를 보여줍니다. 콜레라 독소와 옥시토신과 보충 등 M87A의 낮은 스트레스 미디어의 성장은 우수한 장기를 지원합니다일반 사전 스테이 시스 HMEC의 성장은 이전 미디어 공법 (그림 2)에 비교했다. 이후, 대부분의 세포는 myoepithelial 계보 (Lineage) 마커를 표시, M87A 타입의 미디어도 4-8 (그림 3C-E, 4) 통로를 통해 luminal 및 전구 세포의 성장을 지원합니다. 플라스틱 배양 HMEC는 myoepithelial 세포 (그림 4A, B)에 내부 luminal 셀과 micropatterned 3D microwells에 자기 조직 적절한 3D를 형성하는 능력을 유지 할 수 있으며, Matrigel (4C, D)에 도금 할 때 조직 구조를 형성 할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. HMEC organoids 및 기본 문화. (A) Organoid은 소화하고 여과 한 후 ductal - 폐포 구조를 보여주고 있습니다. (B, C) 이일 차 문화에 배치 한 후 ductal와 폐포 구조를 나타낸 Organoids는, 시작 셀 outgr에 유의owth (흰색 화살표). (D) 작은 혈관이와 B, C.와 동일한 문화에서 섬유 아세포 가지를 시작으로 첨부 사일 후 기본 organoid 문화에서 (E) 상피 세포 가지. Lineages는 K14 (빨간색)와 K19 (녹색)에 항체와 얼룩에 의해 식별되며, 핵은 DAPI (파란색) 물들되었습니다. Luminal (K14-/K19 +, 녹색), myoepithelial (K14 + / K19-, 빨강) 및 전구 (K14 + / K19 +, 노란색) 세포 볼 수 있습니다. 흠없는 세포는 불완전 항체 침투로 인해 organoid 코어에서 관찰됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 한 사람, 표본 184에서 얻은 다양한 미디어 공법에 HMEC 문화의 성장. Organoids는 다른 미디어 공법을 사용하여 기본 문화에 시작되었다. 최고의 장기적인 성장은 우리의 가장 최근의 수립, M87A + 옥시토신 (X) 4를 사용하여 얻어진다. 이 매체는 또한 지원여러 HMEC lineages의 성장 (그림. 1E 참조). 이전 미디어 수립, MM 3 적은 강력한 성장을 제공하는 동안 혈청이없는 미디어, MCDB170 (상업용 MEGM) 신속한 cyclin 키나제 억제제 p16 INK4A의 유도와 7,11,13 비정상 세포에 대한 선택에서 17 리드. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> 그림 3. (A) EpCAM와 CD49f/alpha 6 인테그린의 표현, 그리고 (B) CD227/Muc1에 대한 교양, 효소 dissociated organoid 4 일 통과. (A, B) FACS 분석에서 교양 organoids과 교양 HMEC의 계보 (Lineage) 다양성의 비교 그리고 CD10/CALLA. (C, D) FACS의 (C) EpCAM 및 CD49f/alpha 6 인테그린의 표현을위한 제 4 회 통로 사전 스테이 시스 HMEC의 분석, 그리고 (D) CD227/Muc1 및 CD10/CALLA. 신상 Populations는 LEP (luminal 마커 EPCAM 또는 CD227을 표현), MEP (myoepithelial 마커 CD49f 또는 CD10을 표현) 또는 음식물 (CD49f + / EPCAM + 인구 풍부)로 표시됩니다. EpCAM 및 CD49f 변경의 문화 규제에 적응하는 동안 교양 organoids에 비해합니다. (E) 정렬되지 않은 HMEC과 4 번째 통로에서 FACS 강화 LEP 및 MEP는 혈통 식별을 확인하기 위해 각질 K14 (MEP 마커)와 K19 (LEP 마커)의 immunofluorescence 분석 얼룩이. DAPI로 핵의 스테인드 파란색 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> 4 그림. 양식 HMEC 적절한 microenvironments에 배치 생체 같은 혈통 관계에서와 조직 구조를 형성 할 수 있습니다. (A) 사전 스테이 시스 4 일 통과 HMEC는 FACS 강화 나였다n 인물 luminal LEP 및 myoepithelial MEP의 lineages은 (표시되지 않음) K14와 K19의 표현에 의해 확인이 lineages과 CD227과 CD10에 대한 마커를 사용합니다. (B) micropatterned microwells에서 함께 혼합하면, 배양 세포는 외부와 LEP 내부에 MEP와 bilayers에 자기 조직 할 수 있었다 [샹송 외에서 적응. 5]. 휘황 표시 LEP (녹색)와 MEP는 (빨간색) microwells (위쪽)에 추가 한 후 공 촛점 0 시간에 현미경, 24 시간, 48 시간으로 이미징했다. 제어 HMEC은 임의로 빨간색 또는 녹색 형광 라벨 (아래)으로 분류되었다. (C) FACS 강화 전구 세포의 시야 이미지 (cKit +) 3D (Matrigel) 문화에 도금 18 일 성장. 결과 구조는 폐포 morphogenesis을 전시 할 수 있습니다. (D) 구조는 Matrigel에서 추출되어 K14 및 K19를 감지 할 수 물들 된, 핵은 DAPI로 counterstained했다. Immunofluorescent 분석은 올바른 luminal 및 기초 폴라와 조직 구조를 보여줍니다rity.

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

인간의 유방 수술 폐기 자료를 처리하는 방법이 설명되어 있습니다. organoids의 형태로 처리 조직은, 무기한 정지 또는 장기 성장 문화에 배치 저장할 수 있습니다. 이 방법은 실험 정상적인 인간 내피 세포 생물학의 심사 및 외인성 섭동의 효과를 수 있습니다.

세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K 조회수.  Lawrence Berkeley National Laboratory. 인간의 유방 수술 폐기 자료를 처리하는 방법이 설명되어 있습니다. organoids의 형태로 처리 조직은, 무기한 정지 또는 장기 성장 문화에 배치 저장할 수 있습니다. 이 방법은 실험 정상적인 인간 내피 세포 생물학의 심사 및 외인성 섭동의 효과를 수 있습니다.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

정렬 줄기 세포 Assays 및 흐름에 대한 기본 뇌 종양 조직의 처리

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

연구

의학

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

인간의 전정 신경초종의 차 문화

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

인간의 Dupuytren의<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 근섬유 아세포의 연구와 세포 외 기질 상호 작용에 대한 문화

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

번역 상 암 연구를위한 인체 조직에 대한 작업

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

선 유도 및 실험실 방법론

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...