Name: techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks
Uploaded: 2015-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
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Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

참고 : 모든 절차가 로얄 빅토리아 눈과 귀 병원의 동물 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다 (RVEEH AEC # 10-199AB). 대상은 국민 건강과 (2013)과 &quot;동물 학대 방지법&quot;의학 연구위원회 (Medical Research Council)의 &quot;관리 및 과학적인 목적을위한 동물의 사용을위한 연습의 호주 코드&quot;에 따라 처리 된 (및 개정 1986). 모든 외과 적, 전기 생리 학적 및 임상 평가 절차는 마취 하에서 수행하고, 모든 노력이 고통을 최소화 하였다. 1. 핵의 제거 및 고정 참고 : 존재하는 경우, 장치 케이블 또는 유리체 절제술 포트 주위에 추가 돌보는은 관련 원고 (16)에 자세히 설명 탈핵 및 고정 절차를 따르십시오. 간단히 말해서,이 포함됩니다 : <ol><li> 로 transcardially 차가운 중립 buffe 다음에 따뜻한 식염수 주제를 관류빨간색 포르말린. </li><li> 랜드 마크 역할을하는 안구에 봉합을 묶어. </li><li> 케이블 장치 및 부착 패치 / 탭을 유지, 눈 (16)을 명백히하다. </li><li> 36 시간 - 18 데이비슨의 솔루션에 눈을 포스트 - 수정. </li><li> 8 시간 - 6 50 % 에탄올로 전송합니다. </li><li> 해부까지 70 % 에탄올 냉장 (4 ℃)에 전송합니다. </li></ol> 2. 전극 제거 및 해부. 주 : 모든 망막 임플란트는 동일한 폼 팩터를 가질 것이지만, 일반적으로 전극 어레이 및 유연성 순응성 담체 물질의 일부​​ 형태가있을 것이다. 망막 식은되는 장치는 금속 압정 함께 이러한 유지 어레이 및 눈의 뒷면을 관통하는 구멍을 점착 기능. <ol><li> 임플란트는 망막에 고정되는 점을 시각화. <ol><li> 15도 블레이드를 사용하여 원주 트랜스 각막 절개를 그리고 특급하기 위해 각막 뚜껑을 제거기본 조리개와 렌즈 OSE. </li><li> 15도 블레이드를 사용하여, 망막 임플란트 시츄 금속 압정 후방 챔버를 노출시키는 렌즈의 소 대상의 섬유 및 토토 disinsert 렌즈를 제거한다. </li></ol></li><li> 임플란트와 연구 수행에 따라 추가 해부하기 전에 외부 구성 요소를 제거합니다. 참고 : 본 예에서, 평가중인 망막 배열 등각 실리콘 캐리어 내에 수용 프로토 밀폐형 다이아몬드 전극 및 전자 패키지 구성되었다 (집 제조 20 참조). <ol><li> 여기에 조심스럽게 메스와 미세 절개하여 다이아몬드 전극 패키지의 압축을 풉니 다. 망막 압정과 백금 배선의 잔해 (그림 2)와 함께 임플란트의 실리콘 몸을 둡니다. 임베디드 어레이 / 하우징 내사 장치 설계의 일부가 아닌 경우,이 단계 (2.2)를 생략. </li></ol></li><li> 주의하여원하는 방향으로 택 및 주변 조직을 포함하는 샘플을 해부. 공막, 맥락막과 망막을 포함한 눈의 뒤쪽에서 전체 두께 스트립을 잘라 미세 해부 가위를 사용합니다. 압정에 인접한 모든 망막 층을 보여 택의 종단면을 제공하는 샘플을 보자 (그림 2) 참고 : 샘플 원하는 방향으로 원하는 특정 결과에 따라 다를 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 광학 디스크가 시료 내에 포함되어야한다 광학 디스크에 손상 압정 근방을 조사하고자. </li></ol> 3. 탈수, 임베드, 설치, 연삭, 염색, 및 이미징 <ol><li> 진보적 인 에탄올 단계에서 삼일을 통해 샘플을 탈수 : <ol><li> 회 2 시간 동안 70 % 에탄올에서 샘플 탈수. </li><li> O / N 두 차례 2 시간 동안 80 %의 에탄올의 샘플을 탈수. </li><li> 2 시간의 TWIC 90 % 에탄올에 샘플을 탈수전자. </li><li> O / N 배에서 2 시간 후, 100 % 에탄올에 샘플을 탈수. </li></ol></li><li> 회 2 시간 동안 100 % 아세톤 샘플 탈수. <ol><li> 아세톤에서 시료를 제거하고 실온에서 그 공기가 건조 등의 광학 현미경으로 관찰한다. 에폭시에 샘플을 전송은 / 축소를 곱슬 곱슬 시작 직전 (3.4 단계를 참조하십시오). 참고 : 붕괴 세포 수축의 부드러운 조직 결과에서 액체를 제거. 조직 컬링 / 축소가 발생했을 때의 감사 경험으로 개발되고있다. </li></ol></li><li> 제조업체의 지시에 따라 의료용 에폭시 수지를 준비합니다. 수지를 경화하려면 1 시간 또는 실온에서 24 시간 동안 중 55 ° C를 사용합니다. 기포 제거에 대한 ~ 50 밀리바에서 ~ 5 분 동안 진공 챔버에서 발생. 끓여 에폭시 혼합물의 원인이됩니다 과도한 진공으로 수동으로 진공을 조절하고 가스 제거를 효과적으로 발생하지 않습니다 참고 : 단계 3.2와 동시에 단계 3.3을 수행합니다. </li><li> SAMP 퍼가기명확한 에폭시 수지 르. 적절한 밀폐 용기에 가스가 제거 된 에폭시의 안구 조직을 담그고 O를 떠나 / N RT에서 치료. </li><li> 크기 조정 및 경화 된 에폭시 블록을 재-삽입하여 원하는 방향 (그림 2)에서 샘플을 포함 할주의하십시오. (-도 3a 노란색 컵) 점착성의 장축은 금형의 아래쪽에 평행하게 배향되도록, 안구 조직을 포함하는 크기가 조정 블록을 다시 임베드. </li><li> 연삭 시편 홀더에 수지를 탑재하고 샘플 갈기 - 탄화 규소 종이 사용 (230 수동 연삭, 물과 함께 250 RPM)를 (800 격자로 시작하는,도 3C 및 3E). </li><li> 염색의 경우, 3 톨루이딘 블루 염색에지면을 찍어 - 5 분, 또는 얼룩이 개발 될 때까지 (그림 3 층). </li><li> 수돗물 (그림 3G)로 씻어. </li><li> 이미지 고전력 해부 범위와 표본의 바닥면의 세포층을 나타낼망막 (그림 3H). 공기 계면에서 에폭시 회절을 부드럽게 시험편 상기 에폭시의 상면에 증류수 방울을 적용한다. 샘플을 조명하는 광섬유 &#39;거위&#39;광원을 사용합니다. </li><li> 샘플의 미리 설정된 두께 연마하여 각각의 시간 (시편 홀더의 최소 정확하고 재현성있는 분쇄 증가가 20 μm의 경우), 3.9 - 반복 3.6 단계를 반복합니다. </li></ol>

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Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

표준 조직 학적 기법으로 인해 금속, 유리 또는 다이아몬드 블레이드 이러한 개체를 절단의 제한 현장에서 하드 금속 임플란트를 처리 할 수 없습니다. 우리 컴패니언 용지 (16)에서는 개질 전체 눈 고정술의 사용은 인공적 망막 박리를 낮출 수있는 것으로 나타났다. 현재 원고에서, 연삭 설립 및 현장에서 21 ~ 23 망막 보철에 대한 수정 된 인공 와우 이식을 시각화 기술을 연마. 망막에 전극 배열을 확보하는 데 사용되는 티타늄 압정은, epiretinally, 주변의 눈 조직과 함께 에폭시에 포함되었다. 이 수지 블록이어서 금속 압정에 바로 인접 조직 형태를 공개하기 위해 적절히 방향이 점진적 접지 / 연마 하였다. 다양한 깊이에서 블록의 광택 표면의 이미지는 강력한 해부 현미경으로 촬영되었다. 비쥬얼과 evaluat :이 기술은 유용하다망막 임플란트에 인접한 조직 반응을 보내고; 임플란트의 이식과 관련된 수술 외상을 평가하는 단계; 경질 금속 성분에 생물학적 반응을 결정하는 단계; 임플란트 및 망막의 표면 사이의 거리를 측정한다. 이 기술은 눈의 망막 또는 다른 하드 압정 (예, 금속) 개체에 인접한 영역의 동일계 시각화에 대한 미래의 안전성 시험에서 유용 할 것이다. 이 epiretinally 망막에 압정으로 고정 보철물의 전임상 안전성 평가에 직접 응용 프로그램을 가지고있다. 또한 서브 망막 위치에 임플란트 접촉 영역에서 망막 조직 손상을 평가하기에 유용 할 수있다. 기술이 제대로 수행되었는지 확인하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 각 단계에서, 망막은 눈의 외부 층에 부착 된 상태로 유지한다. 총 인공적 망막 박리가 발생했을 경우는 인도어 수도고정에 문제를 먹었다. 샘플 및 매립 블록의 연삭면 직교에 가까워 야 망막을 차단 최종 수지에 다시 지향 경우; 이 경사 절단을 최소화 할 수 있습니다. 그것은 (예 : 망막 압정으로) 객체를 통과하는 데 필요한 (공지의 스텝 사이즈) 증분 연삭 단계 번호가 개체의 크기와 상관 따라서 확인하는 것이 유용하다. 이 기술은 여러 방식으로 최적화 될 수있다. 연삭 공정과 관련된 에폭시 블록의 표면에 미세한 흠집이 점진적으로 연마 급 감소 될 수있다. 본 연구를 위해, 우리는 800, 1000, 1200, 2400 및 4000 등급 실리콘 카바이드 종이를 사용했다. 다이아몬드 페이스트는 표면 마무리를 향상시키기 위해 사용될 수있다. 미세한 표면이 더 높은 품질의 이미지를 제공하지만 추가 연마 시간의 비용. 이 기술의 결과를 개선하기위한 또 다른 중요한 고려 사항은 OPTI의 선택과 품질CS 및 조명 이미지 캡처에 사용. 기타 기본적인 조직학 얼룩 - 특히 얼룩 Nissl, 톨루이딘 블루 대신에 사용될 수 있지만, 더 최적화를 필요로 할 수있다. 일부 얼룩이 수지뿐만 아니라 조직 (예, 에오신), 따라서 얕은 광택제 배경 변색을 제거하는 염색 후에 요구 될 수 얼룩 것이다. 전문 얼룩, 형광 염료 및 면역 조직 화학 염색은 시도되지되었지만 매우 특정한 결과가 요구되지 않는 한, 각각의 연삭 단계에서 이러한 얼룩을 수행하는 데 필요한 시간은 금지 될 가능성이있다. 그러나, 매립 단계 (단계 3.4) (24) 전에 전체 조직을 염색하는 것이 가능할 수있다. 이 기술의 주요 제한은 따라서, 연삭 및 연마의 각 단계에서의 배율 다양한에서 많은 (아마도 중복) 이미지를 캡처하기 위해 신중한, 관심 영역이 얻어 접지되면,이를 검색 할 수 없다는 것이다. 그것은이다또한 중요한 각 연삭 깊이 조정을 위해 작은 단위를 사용합니다. 이 기술의 다른 제한은 그 조직 유리 슬라이드 상에 장착되고 표준 (송신) 광학 현미경으로 볼에 비해 광학 해상도의 배율. 프로토 타입 및 신규 한 임플란트 장치의 안전성을 측정하기위한 목적으로, 병리학 적 평가는 주요 관심사이다. 이 기술은 망막 점착성과 관련된 임상 적 손상을 관찰하기위한 효율적인 방법을 제공한다. 실제로, 갈기, 폴란드어를 수집하고 (한 번 포함) 지정된 표본을 촬영하는 데 필요한 전체 시간으로이 섹션에 파라핀 블록 또는 동결 절편을 걸리는 시간 비교입니다. 망막 임플란트의 범위 밖의 애플리케이션으로 확장 될 수있는 본 기술에 대한 가능성이있다. 이 기법은 주입 추출 feasib없는 하드 임플란트에 인접한 조직을 평가하기에 적합제작 또는 인터페이스에 손상을 것입니다. 예를 들어,이 기술은 약물 전달을위한 일부 깊은 뇌 또는 말초 신경 전극, 캐 뉼러로 종래의 조직 학적 기법을 절단 할 수없는 금속 (예, 백금, 니티놀, 등)에서 만든 임플란트를 평가하기 위해 확장 될 수있는, 혈관 스텐트 또는 정형 외과 보철.

색소 성 망막염 (RP)는 신경 활동으로, 광자의 형태로, 광 열 변환 할 책임이 망막의 최 외층에있는 광 수용체 세포의 광범위한 손실을 일으키는 유전 질환이다. 중요한 것은, RP 환자는 일반적으로 여전히 작동 그들의 망막의 다른 층에 잔류 신경 세포가있다. 망막 보철물 시각적 통로 1,2- 활성화와 전기 자극이 신경 세포 생존을 대상으로 환자에게 어떤 시각을 복원 할 수있다. 임상 시험에서 지각 결과는 초기 결과를 약속 보여 최근 일부 장치는 상업적 목적으로 승인되었습니다. subretinally 5, 6 및 suprachoroidally 7,8 epiretinally 3,4 : 현재 세 가지 주요 해부학 임상 망막 보철이 배치되어있는 위치가있다. 다른 장치는 다른 재료를 활용하여 자신의 양식은 사용자 정의됩니다그들은 주입되는 위치. 하지만, 그들 모두는 전기 펄스와 망막 뉴런의 잔류를 활성화하여 시각적 지각 표상을 만든다. 어떤 의료 보철물 때문에 초기 배치의 영향이나 기계적 이후 지속적인 힘 주변 조직 손상시킬 수있는 가능성이있다. 망막 이식 보철물 같은 자극의 경우에서, 전기 파라미터는 안전 한계 내에 있어야 추가적인 고려 사항이있다. 환자의 안전이 가장 중요하므로 장치는 엄격하게 임상은 9-15 설정에 진출하기 전에 임상 연구에서 테스트해야합니다. 우리 컴패니언 글에서는 맥락막 상강 공간 (16) 내에 위치 임플란트 주변의 눈 국소 조직 병리학을 평가하기위한 방법을 설명했다. 본 논문에서는 (FE를 임상에서 epiretinally 망막 식은 전극 어레이를 둘러싸는 눈 조직 시각화 기법을 서술라인) 모델 (그림 1). 망막 위치는 시각적 보철물을 찾기위한 가장 일반적으로 이용되는 위치이다. 여기에 위치한 전극 어레이는 전형적으로 17-20 눈의 모든 층을 관통하는 금속 압정 망막에 부착된다. 앞서 본 원고에 기재된 기술로, 정확하게 망막 즉시 압정을 둘러싼 다른 조직을 평가하기 어려웠다. 중성 포르말린을 사용하여 표준 눈을 고정으로 인해 택의 고정 점에 대한 망막과 공막의 차동 운동에 인공적인 망막 손상의 결과. 따라서 택 및 망막 배열로 인해 발생한 실제 손해를 정확하게 관찰 할 수 없습니다. 금속 물체가 용이하게 기존의 조직 학적 장치로 절단 할 수 없으므로 또한, 눈 조직 절편 것은 시츄 망막 압정 수행 될 수 없었다; 조직 학적 처리도되기 전에 택을 제거이것은 또한 인공적인 망막 손상에지도로 바람직하지 않은. 본 연구의 목적은 두 가지였다 : 택 및 망막 임플란트 배열로 인한 손상이 안정적으로 평가 될 수 있도록 1) 망막 박리의 유물을 줄이기 위해; 2) 삭제하지 않고 압정에 인접한 망막 구조를 시각화. 인공적 망막 박리를 감소시키고, (컴패니언 제 16의 설명 참조) 한 목적을 달성하기 위해, 새로운 고정술들이 이용 하였다. 이 목적을 달성하기 위해, 우리는 연삭, 원래 인공 와우 전극 21-23 원위치 관찰에 대한 기술 개발을, 연마, 임베딩 변성. 인공적 망막 손상을 최소화하고, 따라서 망막 택 및 배열로 인한 잠재적 인 손상의 정확한 평가를 허용하면서,이 원고에 기재된 방법은 반응계 내에서 가용 접 주변 망막의 가시화를 허용 인접.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Chem-Supply</td><td>AA008</td><td>Propanone BHD Medical grade</td></tr><tr><td>Epo-Tek 301 Epoxy</td><td>Epoxy Technology</td><td>Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70-75% v/v</td><td>Merck PTY LTD</td><td>4.10261</td><td>Alcohol</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck PTY LTD</td><td>90143</td><td>Alcohol</td></tr><tr><td>Toluidine blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TegraPol grinding/polishing machine</td><td>Struers</td><td>TegraPol-25</td><td></td></tr><tr><td>AccuStop specimen holder</td><td>Struers</td><td>Accustop</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Leica</td><td>2.0x Planapo Objective</td><td></td></tr><tr><td>Digital Microscope Camera</td><td>Leica</td><td>DFC-420C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>Application Suite v4.1.0</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

정착 프로토콜은 실질적으로 인공적 망막 박리 (16)의 박리를 저감. 에폭시 블록 내의 시험편의 방향은 두 단계로 설명 매립 공정을 이용하여 지속적으로 유지시켰다. 증분 연마 과정은 최적의 결과를 달성하기 위해 손재주의 중간 수준을 요구하지만, 증가 해상도 미세 제어를 제공하는 조정 시험편 홀더의 도움을했다. 모든 경우에 (N = 5) 점착성이있는 분쇄 하였다 / 바람직하고 일관된 결과로 연마. 침에 인접한 망막은 확인할 수 있었다 적절 스테인드. 등급 P # 800의 탄화 규소 종이 에폭시 수지 블록의 표면을 연마하는 것은 매립 조직 세포 거대 영상에 충분 하였다. 높은 등급의 종이, 또는 다이아몬드 슬러리를 원하는 경우, 상기 임의의 주어진 깊이로 표면을 연마하는 데 사용될 수있다. 해부 현미경과 광학 섬유 &#39;거위&#39;LIGHt 소스는 접지 블록과 내장 조직 샘플의 표면을 이미징하기에 적합한 것으로 밝혀졌다. 광원의 위치는 현미경을 통해 최상의 조명 및 콘트라스트를 준 위치 및 각도를 찾기 위해 시행 착오에 의해 변화시켰다. 블록의 표면에 증류수 방울을 추가 샘플 위에 에폭시 공기 계면에서의 광로 회절 및 / 또는 매끄러운 왜곡을 감소시키기에 유용 하였다. 도표 4는 티탄 망막에 바로 인접 시각화 망막 조직의 예시적인 이미지를 도시 이 기술을 사용 압정. 비 인공적인 망막 박리 및 폴딩 실리콘 (그림 4A)의 양쪽에 볼 수 있습니다. 압정 샤프트는 실리콘에 포함 보이고, 압정의 머리는 망막과 공막에 침투하고있다. 실리콘 (도 4C)의 흠 망막 양쪽에서 인공적인 비 - 망막 박리가있다. 이 기술은 거기는,이 경우에, 그 보여 주었다E 인해 비스듬한 각도로 삽입 일측 망막 택 및 압축에 인접 망막 무질서하다. 제공되는 이미지는 단순히 기술이 아니라 일반적으로 점착성이 손상 조직 병리학 대표의 성공의 그림 유의하십시오. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> 망막의 전극 배열도 1 요구함. (A) 뒤쪽 공막, 맥락막 및 망막 변성 (감광체 결여)의 확대 단면도를 눈의 개략도. 전극 배열. epiretinally 부착, 파란색으로 묘사 망막 전극 배열의 (B) 컴퓨터 지원 - 도면이다. , 집적 회로 ( &#39;칩&#39;) 및 전극 패키지; B, 티타늄 망막 압정; C, 의료용 실리콘 하우징; D, 납 종료 지점. 패널은 원래, 일러스트에서 수정슈퍼맨 비전 호주, 저작권 베스 크로체의 제공 의례에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> 그림 2. 전극 제거 및 눈의 해부. 현장에서 망막 압정 탈핵 고양이 눈의 높은 동적 범위 매크로 사진. (A) 데이비슨의 정착과 포스트 고정 망막 구조 (16) 보존하기 위해 탈핵 눈 해부했다. 전극 어레이 패키지는 실리콘 캐리어로부터 제거하고 나머지 임플란트 압정 (화살표)과 실리콘 바디와 (점선 사각형 윤곽 전극 어레이의 원래 위치를 나타낸다). (B)의 눈은 인접한 종단면으로 해부했다 압정(점선). 압정이 아이 컵 (화살표)의 후벽에 포함 된 상태로 유지, 공막에 의해 주로 안정화. 제거 된 전극 어레이 아래를 함유하는 망막 부 표준 조직학 처리부 (16) (왼쪽 부분)를 위해 준비하는 동안 압정을 함유하는 조직 절편은, 수지 매립하고 연마 (우측 부분)에 대해 제조 하였다. 0.5 mm 단위와 눈금자가 각 패널의 하단에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> 그림 3. 에폭시 매립 및 택 망막 조직의 연삭. 내장 된 에폭시의 사진 정렬 조직 샘플, 연삭, 염색 및 택 망막 조직의 영상. (A) 전술<html> k 개의 샘플을 에폭시 수지에 매립 블록 하였다. 금형을 사용하여, 시료 길이 평면 몰드의 저면에 평행하도록 배향되었다. 연마 용 (B)는 압정 형 샘플을 함유 경화 에폭시 블록. (C) 에폭시 블록 연삭 시험편 홀더에 장착시키고, 준비 . (D) 샘플은 1 조직이므로 이미지화 섹션 망막 세포층과 점착성의 종축을 포함 배향 하였다. (E) 샘플을 회전식 분쇄기 탄화 규소 용지를 사용하여 접지했다. (F)를지면의 블록은 망막 층을 식별 할 수 톨루이딘 블루로 염색했다. (G) 블록이 초과 얼룩을 제거하기 위해 수돗물에 헹구었다. (H) 푸른 스테인드 망막 층과 점성이 높은 전원이 공급되는 해부 범위를 사용하여 몇 군데 있었다 톨루이딘. 광고 / 52348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; 택과 망막의 그림 4. 높은 및 낮은 전력 이미지. 여러 지점에서 연삭 가공 이미지 동안은 압정 (별표)의 종단면 ( &#39;S&#39;공막을 눈 관통과 종료를 보여주는 해부 범위에서 측정 한 것 ), 실리콘 (해시) 및 스테인드 톨루이딘 블루와 흠없는 망막 ( &#39;R&#39;)를 인접. 이러한 예 이미지 만 본 시각화 기술을 보여주기 위해, 그리고 모든 망막 임플란트 또는 압정 삽입 조직 학적 결과를 대표하지 않습니다. 백금 배선의 접지 잔재 패널 AD에 ( &#39;W&#39;) 볼 수 있습니다. (A) 낮은 전력, 망막과 공막을 관통 택의 흠없는 이미지. (B) 망막 박리의 높은 전원이 공급되는 이미지와 흠없는 망막 인접한에게 폴딩 압정 형 샤프트의 중심에서 이미지 A. (C) 저전력 이미지 실리콘 캐리어. <str옹&gt; (D) 별도의 샘플에서 이미지 C. (E)의 압정의 중심의 고성능 이미지, 아니 실리콘 캐리어, 택 칼자루 아래 톨루이딘 블루 스테인드 망막의 높은 전원이 공급되는 이미지가 직전에 도시된다 . 압정 축 (F) 일반 톨루이딘 블루 염색 망막 구조를 연삭 (GCL : 망막 신경절 세포 층; INL : 내부 핵 층; ONL : 외부 핵 층; PR : 감광체; T : 고양이 휘판)는 같은 연마 기술을 사용하여 시각 . 각 패널의 스케일 바는 다음과 같습니다 A와 C = 2mm; B 및 D = 500 μm의; E = 200 μm의; F 100 μm의 =.

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Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

현지화 된 조직 병리학 적 분석을위한 망막 보철물로 이식 된 가공 눈을위한 기술 : 파트 망막 끌어 올릴 2 망막 임플란트

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

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Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

현지화 된 조직 병리학 적 분석을 위해 망막 보철물 이식 처리 눈을위한 기법

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

연구

의학

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal pigmented epithelium (RPE) is a key pathobiological event in AMD. To understand the mechanisms that lead to RPE dysfunction, mouse models can be utilized by researchers. It has been established by previous studies that mice can develop RPE pathologies, some of which are observed in the eyes of individuals diagnosed with AMD. Here, we describe a phenotyping protocol to assess RPE pathologies in mice. This protocol includes the preparation and evaluation of retinal cross-sections using light microscopy and transmission electron microscopy, as well as that of RPE flat mounts by confocal microscopy. We detail the common types of murine RPE pathologies observed by these techniques and ways to quantify them through unbiased methods for statistical testing. As proof of concept, we use this RPE phenotyping protocol to quantify the RPE pathologies observed in mice overexpressing transmembrane protein 135 (Tmem135) and aged wild-type C57BL/6J mice. The main goal of this protocol is to present standard RPE phenotyping methods with unbiased quantitative assessments for scientists using mouse models of AMD.

Mouse models can be useful tools for investigating the biology of the retinal pigmented epithelium (RPE). It has been established that mice can develop an array of RPE pathologies. Here, we describe a phenotyping protocol to elucidate and quantify RPE pathologies in mice using light, transmission electron, and confocal microscopy.

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

유전학

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

생물학

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

작고 큰 눈의 망막 기능을 연구하기 위해 생체 외 망막 전도의 설정 및 조건 최적화

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

신경과학

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats

Retinal degeneration, such as age-related macular degeneration (AMD), is a leading cause of blindness worldwide. A myriad of approaches have been undertaken to develop regenerative medicine-based therapies for AMD, including stem cell-based therapies. Rodents as animal models for retinal degeneration are a foundation for translational research, due to the broad spectrum of strains that develop retinal degeneration diseases at different stages. However, mimicking human therapeutic delivery of subretinal implants in rodents is challenging, due to anatomical differences such as lens size and vitreous volume. This surgical protocol aims to provide a guided method for transplanting implants into the subretinal space in rats. A user-friendly comprehensive description of the critical steps has been included. This protocol has been developed as a cost-efficient surgical procedure for reproducibility across different preclinical studies in rats. Proper miniaturization of a human-sized implant is required prior to conducting the surgical experiment, which includes adjustments to the dimensions of the implant. An external approach is used instead of an intravitreal procedure to deliver the implant to the subretinal space. Using a small sharp needle, a scleral incision is performed in the temporal superior quadrant, followed by paracentesis to reduce intraocular pressure, thereby minimizing resistance during the surgical implantation. Next, a balanced salt solution (BSS) injection through the incision is carried out to achieve focal retinal detachment (RD). Lastly, insertion and visualization of the implant into the subretinal space are conducted. Post-operative assessment of the subretinal placement of the implant includes imaging by spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). Imaging follow-ups ascertain the subretinal stability of the implant, before the eyes are harvested and fixated for histological analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>쥐의 망막하 임플란트를 위한 수술 기법 개발

The present protocol describes the scleral approach for subretinal device implantation, a feasible surgical technique for implementation in animal models of retinal diseases in research.